ESR1 IVS1 - 401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义
晏泽辉邓国宏谭文婷但芸婕陈文汤影子周霞王小红毛青王宇明*
第三军医大学西南医院全军感染病研究所 400038 重庆
*通讯作者：王宇明教授, Email：wym417@https://www.doczj.com/doc/af14869060.html, , 电话：023-********
背景：我们前期在群体水平和流行病学角度证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV 感染及慢性HBV感染相关肝病存在显著遗传关联，且T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异。但阳性关联的T29C位点为同义SNP位点，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP（rSNP）位点，连锁不平衡分析和生物信息提示，ESR1内含子1（IVS1）T-401位点与外显子1 T29C强烈连锁且存在核蛋白结合位点。鉴定此ESR1 IVS1 T-401位点rSNP的功能，对揭示ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有积极意义。
方法：在我们收集的359名HBV感染相关急性肝衰竭(HBV-ALF)患者，464名HBV感染相关肝硬化(HBV-LC)患者和469例HBV感染无症状携带者(ASC)组成的基于医院的病例-对照人群中，采用限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)和直接测序法对ESR1位点基因3个SNP（IVS1 T-401/C, T29C, A11940G）进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。综合采用荧光素酶报告基因试验、电泳移动漂移分析（EMSA）、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术（HaploChIP）、位点特异性小RNA 干扰（SiRNA）等手实验对阳性关联的ESR1 IVS1 -401T/C位点进行功能验证。
结果：HBV感染相关ALF患者病例组和HBV感染相关LC患者病例组中IVS1 -401/C和29C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照组(HBV-ALF vs ASC：P = 3.7×10-4，HBV-LC vs ASC：P = 2.1×10-5)。经非条件逻辑回归校正年龄、性别等因素后，在显性模式下，IVS1 T-401/C和T29C 两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化显著关联。和IVS1 -401T/C或T/T基因型个体相比，IVS1 -401C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性显著升高(显性模式；HBV-ALF vs ASC：OR = 1.79, 95% CI = 1.54-2.12, P = 0.000；HBV-LC vs ASC：OR = 2.07, 95% CI = 1.47-2.92, P = 0.000) 。功能实验在多个角度证实了与T29C位点连锁的IVS1 T-401C位点的可以通过结合核蛋白C-myb而发挥对ESR1表达的顺式调控作用；并且IVS1 T-401C位点的两个等位对核蛋白C-myb的结合能力存在差异，-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强，表现出更强的增强子活性。
结论：中国人群中，ESR1 基因多态性（IVS1 T-401/C和T29C）两个SNP与慢性HBV感染者发生急性肝衰竭和关肝硬化的遗传易感性相关。IVS1 -401C等位可能通过影响了ESR1表达（mRNA和蛋白水平）而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。
前言
慢性HBV感染是遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。近年来普遍认为宿主因素，尤其是宿主的遗传因素，在慢性HBV感染极其相关肝病的发病机制中起着极为关键的作用[2]，影响HBV感染和疾病
进程的许多阶段[3]。探讨慢性HBV感染相关肝病的宿主遗传特征，将为我们从另一角度认识慢性HBV 感染相关肝病及发病机制提供新的线索，并为临床防治提供新的、合理的策略，而以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究，是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的主要策略。\ ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、发展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。顺式调控位点等位变异的功能影响是当前人类基因组研究的重要内容。本课题组前期研究从群体水平和流行病学角度已经证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及HBV 感染相关肝细胞癌的遗传关联。并且发现T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位。但T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(rSNP)位点。初步分析和前期实验提示与T29C高度连锁的内含子1 IVS1 -401T/C SNP位点是最可能影响转录调控的功能位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，观察C/T等位变异对ESR1启动子使用以及mRNA外显子缺失变异体产生的影响，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。本研究拟采用EMSA、荧光素酶报告基因试验(DLRA)、等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)、位点特异性RNA干扰(SiRNA)等手段，证实IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，以期深入认识ESR1基因rSNP在慢性HBV 感染疾病进程中的功能和作用。
研究对象，材料和方法：（略）
主要结果：
一、ESR1基因SNPs与HBV相关肝病的关联分析
(一) 研究对象的临床的人口学资料
前期建立的慢性HBV感染肝病标本数据库中无亲缘关系的359名的HBV相关肝衰竭患者(HBV-ALF)、470名HBV相关肝硬化(HBV-LC)和469名无症状慢性HBV携带者(ASC)纳入本部分的研究。研究所用样本的简要社会人口学和临床资料见表2-1。在我们收集的基于医院收集的病例-对照队列中，ASC对照组的男性比例(54.2%)显著低于HBV-LC组(83.0%; χ2=100.6; P =0.000)和HBV-ALF组(84.4%; χ2=76.1; P =0.000)；饮酒指数上ASC对照组与HBV-LC组(χ2=45.8; P =0.000)以及HBV-ALF组(χ2=28.9; P =0.000)差异显著，这可能与两组之间在性别分布上差异显著有关，因为在中国饮酒主要以男性为主；ASC对照组的年龄也显著低于HBV-ALF组(37.4±12.1 vs 41.0 ± 12.6; P = 0.000)和HBV-LC组(37.4±12.1 vs 43.0±11.82; P =0.000)；HBeAg 阳性率在ASC组与HBV-LC组(χ2=0.375; P =0.541)以及HBV-ALF组(χ2=1.819; P =0.177)均无明显差异。
表2-7病例对照人群的社会人口学和临床资料
Characteristic
AsC HBV-LC HBV-ALF (n =469) (n =468) (n = 359)
Gender, no. (%)
Men 254 (54.2) 395 (84.4) 298 (83.0)
Women 215 (45.8) 73 (15.6) 61(17.0) Age (years), mean (SD) 37.4±12.1 43.3±11.8 41.1 ± 12.7
Alcohol drinkers, no. (%) 82 (17.5) 174(37.2) 121 (33.7)
HBsAg All + All + All +
Anti-HBs IgG All - All - All -
HBeAg positive, no (%) 120(25.6) 128(27.3) 107(29.8)
Anti-HBc IgG All + All + All +
TBil ( μmol / L )13.5 ± 4.3 205.2 ±193.4 321.1 ± 166.1
ALT ( IU / L ) 27.7 ± 10.8 284.0 ± 426 410.1 ± 541.6
注：“Drinker”定义为男性每周饮白酒≥40 g/week 或女性男性每周饮白酒≥20 g/week；AsC,无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者
(二) 病例及对照标本的ESR1 SNPs分型
采用PCR-RFLP对对所有样本IL-10基因的3个SNP位点进行分型。其中随即选取5%的样本进行直接测序以验证PCR-RFLP方法分型的准确性，结果与测序结果完全吻合(图2-1至图2-5)。
图2-6 IVS1 T-401C位点PCR- Pvu II-RFLP分图2-7 T29C位点的PCR- BamH I-RFLP分型
图2-8 ESR1 A11940G位点的PCR- Alw26 I-RFLP分型
图2-9 ESR1 IVS1-401T/C位点测序验证
(三) ESR1基因3个SNP位点与HBV相关肝病的关联分析
1. 分型结果的初步分析
ESR1基因3个SNP位点在病例对照人群中分型结果显示(见表2-9)：ESR1 A11940G位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC对照组和HBV相关ALF病例组(χ2=0.357; P =0.550)以及HBV相关LC病例组(χ2=1.439; P =0.230)之间均无明显差异；但是ESR1 IVS1 T-401C位点的基因型和等位频率在HBV 感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(χ2=5.04; P =0.0246)以及HBV相关LC病例组(χ2=13.06; P =3.0×10-4)之间均差异显著；ESR1 T29C位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV 相关ALF病例组(χ2=7.22; P =0.0071)以及HBV相关LC病例组(χ2=20.69; P =5.4×10-6)之间均存在显著差异；HBV相关ALF组和LC组中-401C和29C 的等位频率显著高于HBV感染ASC对照组。与未携带有- T-401C和29C等位的个体相比，携带有-401C和29C等位的个体显著的增加了HBV相关ALF和
LC易感性。表2-9 病例组和对照组ESR1基因型和等位基频率分布及差异显著性
Genotype/allele
AsC HBV-ALF HBV-LC (n = 469) (n =359) (n = 464)
pvu II site
T/T, no. (%) 166 (35.4) 109(30.4) 120 (25.9)
T/C, no. (%) 242 (51.6) 182(50.7) 251 (54.1)
C/C, no. (%) 61 (13.0) 68(18.9) 93 (20.0) T allele, no. (%) 574(61.2) 400 (55.7) 491 (52.9)
C allele, no. (%) 364 (38.8) 318 (44.3) 437 (47.1)
P Value §0.0246 3.0×10-4 T29C 6.9
T/T, no. (%) 228 (48.6) 143 (39.8) 158 (34.1
T/C, no. (%) 188 (39.7) 160 (44.7) 225(48.5)
C/C, no. (%) 55 (11.7) 56 (15.6) 91 (17.4) T allele, no. (%) 642 (68.4) 446 (62.1) 541 (58.3)
C allele, no. (%) 296 (31.6) 272 (37.9) 387 (41.7)
P Value §0.0071 5.4×10-6 A252966G
A/A, no. (%) 193 (42.9) 135 (37.6) 174 (37.5)
A/G, no. (%) 196 (43.6) 184 (51.3) 227 (48.9)
G/G, no. (%) 61 (13.5) 40 (11.1) 63 (13.6)
A allele, no. (%) 582 (64.7) 454 (63.2) 575 (62.0)
G allele, no. (%) 318 (35.3) 264 (36.8) 353 (38.0)
P Value §0.5500 0.2302
注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；§P 值由2×2四格表 2检验给出，AsC组为对照。
2. 阳性关联位点的非条件logisitic回归分析和分层分析
经非条件logistic回归校正年龄、性别、饮酒指数等因素后，在显性模式下，ESR1 IVS1 T-401C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭和肝硬化显著关联(见表2-10)。和-401T/C或T/T基因型个体相比，-401C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.36, 95% CI = 1.09-1.70, P = 0.0061；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.12-1.83, P = 0.0004) 。和29T/C或29T/T基因型个体相比，29C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.29, 95% CI = 1.05-1.61, P = 0.0160；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.52-1.87, P = 0.0001)。同时,我们对这两个位点进行了年龄(＜40岁和≧40岁)和性别分层分析，结果显示(见表2-11)：ESR1 IVS1 T-401C和T29C的等位频率分布没有年龄、性别差异，基因型分布在病例对照之间
的差异仍然显著。
表2-10ESR1阳性关联位点与HBV相关肝病的非条件logisitic回归关联分析
P value§0.0113 0.0159 0.0987 0.0357 OR (95% CI) § 1.70(1.13-2.56) 1.62(1.09-2.40) 1.44(0.93-2.22) 1.55(1.03-2.34) Recessive model(TT/TC+CC)
P value§0.0467 0.0012 0.0244 0.0000 OR (95% CI) § 1.37(1.01-1.88) 1.66(1.22-2.67) 1.41(1.05-1.89) 1.83(1.38-2.46) Co-dominant model(TT/TC/CC)
P value§0.0061 0.0004 0.0160 0.0001 OR (95% CI) § 1.36(1.09-1.70) 1.48(1.19-1.83) 1.29(1.05-1.61) 1.52(1.24-1.87) 注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；§P值采用非条件logisitic 回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信区间。
表2-11 ESR1阳性关联位点与HBV相关肝病的关联分层分析
TT 98(38.5) 94(31.5) 101(25.7) 120(47.2) 120(40.3) 136(34.7)
TC 129(50.7) 149(50.0) 206(52.6) 108(42.5) 132(44.3) 186(47.4)
CC 27(10.6) 55(18.5) 85(21.7) 26(10.3) 46(15.4) 70(17.9)
T allele 325(64.0) 337(56.5) 408(52.0) 348(68.5) 372(62.4) 458(58.4)
C allele 183(36.0) 259(43.5) 376(48.0) 160(31.5) 224(37.6) 326(41.6)
P Value §0.012 2.3×10-50.034 2.6×10-4 Women only n=215 n=61 n=72 n=215 n=61 n=72 TT 68(31.6) 15(24.6) 19(26.4) 108(50.3) 23(37.7) 22(30.6)
TC 114(53.0) 34(55.7) 45(62.5) 79(36.7) 29(47.5) 39(54.2)
CC 33(15.4) 12(19.7) 8(11.1) 28(13.0) 9(14.8) 11(15.3)
T allele 250(58.1) 64(52.5) 83(57.6) 295(68.6) 75(61.5) 83(57.6)
C allele 180(41.9) 58(47.5) 61(42.4) 135(31.4) 47(38.5) 61(42.4)
P Value §0.263 0.916 0.139 0.016 Age ≥ 40 y n=175 n=166 n=255 n=175 n=166 n=255 TT 52(29.7) 54(32.5) 70(27.5) 85(48.6) 71(42.8) 91(35.7)
TC 106(60.6) 83()50.0 129(50.6) 72(41.1) 74(44.6) 120(47.1)
CC 17(9.7) 29(17.5) 56(22.1) 18(10.3) 21(12.7) 44(17.3)
T allele 210(60.0) 191(57.5) 269(52.7) 242(69.1) 216(65.1) 302(59.2)
C allele 140(40.0) 141(42.5) 241(47.3) 108(30.9) 116(34.9) 208(40.8)
P Value §0.512 0.035 0.257 0.003 Age < 40 y n=294 n=193 n=209 n=294 n=193 n=209 TT 106(36.1) 55(28.5) 50(23.9) 143(48.6) 72(37.3) 67(32.1)
TC 145(49.3) 99(51.3) 122(58.4) 115(39.1) 86(44.6) 105(50.2)
CC 43(14.6) 39(20.2) 37(17.7) 36(12.3) 35(18.1) 37(17.7)
T allele 357(60.7) 209(54.1) 222(53.1) 401(68.2) 230(59.6) 239(57.2)
C allele 231(39.3) 177(45.9) 196(46.9) 187(31.8) 156(40.4) 179(42.8)
P Value §0.042 0.016 0.006 3.4×10-4注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；§P值由2×2四格表 2检验给出，AsC组为对照。
3. ESR1基因启动子区3个SNP位点连锁不平衡检测
通过LDA软件分析ESR1基因3个SNP位点连锁不平衡情况，得到如下结果：ESR1 T29C与IVS1 T-401C，D'=0.734，r2=0.4248，Q value=0.924；ESR1 T29C与A11940G，D'=0.154，r2=0.024，Q value=0.315；ESR1 IVS1 T-401C与A11940G，D'=0.0999，r2 =0.0078，Q value=0.182；提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C位点存在强烈的连锁不平衡。
4. ESR1基因启动子区3个SNP位点单倍型分析及关联研究
单倍型分析提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C两个SNP位点仅存在四种单倍型(29T-IVS1T、29T-IVS1 C、29C-IVS1 T、29C-IVS1C)。初步统计分析(见表2-12)表明：四种单倍型的单倍型频率在HBV无症状携带对照组和HBV相关ALF组(χ2=7.86; P =0.049)以及HBV相关LC组之间差异分布显著(χ2=21.75; P=7.35×10-5)。分别以单倍型29T-IVS1或29C-IVS1C为标准，将HBV感染相关性急性肝衰竭患者病例组和HBV感染无症状携带对照组中单倍型29T-IVS1T和29C-IVS1C的携带情况分别进行非条件logisitic回归分析，校正年龄、性别等因素后，在共显性模式下，单倍型29T-IVS1T以及29C-IVS1C 与HBV相关急性肝衰竭显著关联(见表2-13)。和29T-IVS1T /---或---/---单倍型个体相比，29T-IVS1T /29T-IVS1T单倍型的个体对HBV相关LC(OR =1.52, 95% CI =1.24-1.88, P =0.0001)和(OR =1.35, 95% CI =1.10-1.67, P =0.0051)ALF易感性显著降低。和29C-IVS1C /---或---/---单倍型个体相比，29C-IVS1C /29C-IVS1C单倍型的个体对HBV相关LC(OR =1.51, 95% CI =1.21-1.90, P =0.0003)和(OR =1.32, 95% CI
=1.04-1.66, P =0.0187)ALF易感性显著增高。
表2-12 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的关联分析
Haplotype
AsC HBV-ALF HBV-LC 2n=938 2n=718 2n=928
29T-IVS1 T 536(57.1) 365(50.8) 442(47.6)
29T-IVS1 C 108(11.5) 82(11.5) 100(10.8)
29C-IVS1 T 39(4.2) 36(5.0) 50(5.4)
29C-IVS1C 255(27.2) 235(32.7) 336(36.2)
χ27.86 21.75
P Value §0.048999 7.35×10-5注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；§P值由2×4列联表 2检验给出
表2-13 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的的非条件logisitic回归关联分析
AsC HBV-ALF HBV-LC
2n=938 2n=718 2n=928 29T-IVS1T/29T-IVS1T(TT/TT) 146(31.1) 97(27.1) 104(22.4) 29T-IVS1T/--( TT/--) 244(52.1) 171(47.6) 234(50.4) --/-- 79(16.8) 91(25.3) 126(27.2) χ2tests χ29.12 18.02
P Value §0.010483 1.23×10-4 Dominant model P Value§§0.0023 0.0009
OR (95%CI) 1.77(1.23-2.56) 1.82(1.28-2.58) Recessive model P Value§§0.1066 0.0014
OR (95%CI) 1.31(0.94-1.81) 1.69(1.22-2.32) Co-dominant model P Value§§0.0051 0.0001
OR (95%CI) 1.35(1.10-1.67) 1.52(1.24-1.88) 29C-IVS1C/29C-IVS1C (CC/CC) 37(7.9) 33(9.2) 48(10.4) 29C-IVS1C/--(CC/--) 181(38.6) 169(47.1) 240(51.7) --/-- 251(53.5) 157(43.7) 176(37.9) χ2tests χ27.82 22.84
P Value §0.020027 1.10×10-5 Dominant model P Value§§0.0116 0.0000
OR (95%CI) 1.46(1.08-1.96) 1.83(1.38-2.44) Recessive model P Value§§0.3836 0.3758
OR (95%CI) 0.79(0.46-1.34) 0.80(0.48-1.32)
Co-dominant model P Value§§0.0187 0.0003
OR (95%CI) 1.32(1.04-1.66) 1.51(1.21-1.90) 注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；“---” 表示其他非ATA单倍型；§P值由2×3列联表 2检验给出；Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；§§P值采用非条件logisitic回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信区间。
二、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的荧光素酶报告基因实验
将构建好的pGL3-IVS1 -401 TT或CC的不同长度pGL3系列重组载体荧光素酶报告基因质粒单独转染或与c-myb表达质粒pcDNA-c-myb共转染HepG2细胞，转染24 h后分别测定期荧光素酶活性。Firefly荧光素酶(F值)与Renilla荧光素酶(R值)比值为每孔荧光素酶比值，将每孔比值除pGL3-Promoter 空质粒得到荧光素酶的相对活性。结果提示：在HepG2细胞中，这两种等位片断重组pGL3-Promoter 载体荧光素酶活性较pGL3-Promoter空载体明显增强(p<0.05)，-401C pGL3-Promoter重组载体荧光素酶表达量显著高于-401T pGL3-Promoter重组载体(p<0.05)，提示-到＋这个片断具有增强子功能。但不同等位片断启动子活性存在差异。结果发现IVS1 -401 C等位存在能显著提高pGL3-promoter的荧光素酶活性，IVS1 -401 C表明出增强子活性，且c-myb表达质粒共转染提高了IVS1 -401 C的增强子活性(图4-10，图4-11，图4-12，图4-13)。
图4-10 pGL3-Promoter-IVS1 -40I T/C不同等位载体与pGL3-Promoter空载体的荧光素酶活性比较
图4-11 pGL3-Promoter-IVS1-401C /T 不同等位载体与pcDNA3-C-myb质粒共转染与pGL3Promoter空
载体的荧光素酶活性比较
图4-12 pGL3-Promoter-IVS1-401C /T 不同等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与pGL3-Promoter
空载体的荧光素酶活性比较
图4-13 pGL3-Promoter-IVS1-401C等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与
pGL3-Promoter-IVS1-401T等位载体的荧光素酶活性比较
三、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的EMSA分析
1. 交叉抑制EMSA
我们所用的核蛋白来源于雌激素诱导2h的HepG2细胞。交叉抑制EMSA结果见图4-14，结果显示：ESR1 IVS1 -401C、-401T等位探针均可见有一条结合带(箭头所指)，C等位探针与核蛋白的结合能够被C、T两种冷探针所竞争抑制(泳道3，5)，同样T等位探针与核蛋白的结合也分别被T、C冷
探针竞争抑制(泳道7、9)，提示针对IVS1 -401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的,且两种等位的所结合的核蛋白的种类相同。通过Quantity One分析，C、T等位探针与核蛋白的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.3倍。提示IVS1-401C/T的两种等位特异性探针对核蛋白的结合量存在差异，C等位的结合能力强于T等位。
图4-14 ESR1 IVS1-401C/T位点EMSA交叉抑制分析
2. 超漂移EMSA
为鉴定探针结合核蛋白是否为预测的C-myb，我们在结合体系中先加入C-myb单抗孵育，再加入标记探针，观察加C-myb单抗后是否会出现核蛋白-探针结合带的超漂移。结果显示(图4-15)：ESR1 IVS1-401C、-401T等位探针，均可见有一条结合带(Complex箭头所指)，-401C、-401T 等位探针与核蛋白的结合能够被相应的冷探针所竞争抑制，提示针对ESR1 IVS1-401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的。泳道4、8分别为预先加入C-myb单抗孵育的IVS1-401C、-401T等位探针，均可见有一条“核蛋白-探针”的结合带(Complex箭头所指)和一条“C-myb单抗-核蛋白-探针”结合带的超漂移带(Shift Band箭头所指)。通过Quantity One分析，C、T等位探针与核蛋白-抗体复合物(超漂移带)的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.5倍。提示ESR1 IVS1-401C/T的两种等位特异性探针与核蛋白C-myb均有结合(还存在与其他的核蛋白的结合)，但两种等位对核蛋白C-myb 结合能力存在差异，C等位的结合能力强于T等位。
图4-15 ESR1 IVS1-401C/T位点超漂移EMSA分析
四、ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)
1. ChIP ESR1 IVS1 - 401位点T/C杂合的CBMC细胞(11例)经培养24 h后，用β-雌二醇刺激和甲醛处理使结合在DNA上的转录因子交联，提取细胞核，分别采用RNA多聚酶ⅡH14 mAb和c-myb 单抗，对超声打断的核染色质片断进行ChIP(mock样本采用无关的Anti-T Antigen pAb101对照抗体)，然后采用针对IVS1 – 401位点的特异性PCR引物检测该区域是否有RNA多聚酶Ⅱ和(或)c-myb结合。免疫沉淀PCR定性检测结果表明，ESR1 IVS1 – 401T/C 位点附近(-67
2.-至-38之间)无RNA多聚酶Ⅱ结合，但存在c-myb结合(图4-16)。
图4-16 IVS1 – 401位点的特异性的ChIP定性结果检测
2. c-myb等位特异性结合量的检测c-myb单抗ChIP片段用MGB-TaqMan荧光定量PCR技术方法检测活体状态下IVS1 - 401位点T和C等位myb结合量的差异；两种等位特异性ChIP沉淀产物定量结果显示(图4-17)，11份杂合子细胞中，C等位的沉淀量显著高于T等位(C /A等位，平均比值为1.89)，提示活体状态下，细胞内ESR1 IVS1 - 401位点T和C等位对c-myb结合能力存在差异，C等位的结合量显著高于T等位。
图4-17 11例ESR1 IVS1-401T/C杂合子细胞的等位特异性ChIP鉴定结果
五、ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰
1．等位特异性RNA干扰载体的构建按照干扰靶序列合成回文DNA寡核苷酸(目标序列：IVS1 –401TT干扰靶序列：5’-tgtcccagc t gttttatgc-3’；IVS1 –401CC干扰靶序列：5’-tgtcccagc c gttttatgc-3’)，5’端和3’端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，克隆至pRNA T-U6.1/Neo干扰载体。构建好的T和C 两种等位特异性RNA干扰载体经过测序验证无误(图4-18)，可以用于后续的RNA干扰实验的细胞转染。
图4-18 ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰载体测序验证
2．等位特异性RNA干扰载体转染利用脂质体2 000将构建好的ESR1 IVS1 - 401 T和C两种等位特异性RNA干扰载体分别转染ESR1表达阳性的IVS1 - 401CC和TC基因型的HepG2、293细胞株，Skov3细胞株，G418筛选稳定转染的细胞。荧光显微镜下显示细胞转然后生长状态良好，荧光强度亮，可稳定表达pRNAT-U6.1/Neo干扰载体自带的绿色荧光蛋白(图4-19)，说明干扰效果理想。
图4-19 三种不同基因型细胞的pRNAT-U6.1/Neo-IVS1干扰载体转染
左图：HepG2细胞；中图：293细胞；右图：Skov3细胞(荧光显微镜，×200)
3. mRNA转录水平检测等位特异性RNA干扰效果采用Syber Green I 染料荧光定量PCR检测ESR1 mRNA与恒定表达的看家基因β-action的mRNA的相对表达量，结果显示(图4-20)：在IVS1 - 401CC纯合的HepG2细胞株中，转染pRNA T/U6.1-CC干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量降低了47%(p<0.01), 而转染pRNAT/U6.1-TT干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量降低不明显(p>0.05)；在IVS1 –401TC杂合的293细胞株中，转染pRNA T/U6.1-CC和TT干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量分别降低了64%和31%，两者之间的干扰效率存在显著差异(p<0.01)；在IVS1 – 401TT纯合的Skov3细胞株中，各种干扰载体转染前后的ESR1 mRNA 表达量无明显差异(p>0.05)。
# ：与pRNAT/U6.1空载体比较，p<0.05；&：与pRNAT/U6.1-TT阳性干扰载体比较，p<0.05
图4-20 mRNA转录水平检测等位特异性RNA干扰效果
4. 蛋白水平检测等位特异性RNA干扰效果蛋白印迹转移实验(Western Blot，WB)检测三种基因型IVS1 -401位点干扰后对ESR1蛋白表达量影响。分别提取干扰前后细胞总蛋白，采用利用ESR1特异型抗体进行WB检测，检测干扰前后后细胞内ESR1与β-action的蛋白相对表达量。结果显示(图4-21)：在ESR1 IVS1 - 401CC纯合的HepG2细胞株中，与空载转染后比较，转染pRNA T/U6.1-CC和TT干扰质粒的ESR1 蛋白表达量明显降低降低了(p<0.05), 而转染pRNA T/U6.1-TT干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量降低不明显(p>0.05)；在ESR1 IVS1 – 401TC杂合的293细胞株中，转染pRNA T/U6.1-CC干扰质粒的ESR1 蛋白表达量与与空载转染和pRNA T/U6.1-TT载体转染相比明显降低，但与空载转染后比较，转染pRNA T/U6.1-
TT阳性干扰质粒的ESR1 蛋白表达量无明显变化(p>0.05)；在ESR1 IVS1 – 401TT纯合的Skov3细胞株中，与空载转染后比较，转染pRNA T/U6.1- TT干扰质粒的ESR1 蛋白表达量无明显变化(p>0.05),而转染pRNA T/U6.1-CC干扰质粒的ESR1 蛋白表达量明显降低(p<0.05)，转染pRNA T/U6.1-CC和转染pRNA T/U6.1-TT干扰质粒的ESR1 蛋白表达量没有明显差别。
# ：与pRNAT/U6.1空载体比较，p<0.05；&：与pRNAT/U6.1-TT阳性干扰载体比较，p<0.05 图4-21 蛋白水平(Western Blot)检测等位特异性RNA干扰效果
讨论
近年的研究显示，雌激素和雌激素受体(estrogen receptor, ESR)在慢性肝病的发生、发展过程中起着极为重要的作用[31]。肝炎病毒、酒精等因素使肝组织存在氧化性张力，氧自由基、脂质过氧化产物(如丙二醛等)释放增多，引发慢性炎症、肝纤维化、细胞基因组DNA损伤(形成8-羟基脱氧鸟苷，8-OHdG)或失稳，导致肝硬化与肝细胞癌的形成。雌激素受体与雌激素结合后被激活，一方面结合并激活AP-1，上调Bcl-2表达，进而抑制脂质过氧化；另一方面抑制NF-κB活性，减少TNF-α、IL-1、IL-6等前炎症因子的产生[75, 76]。绝经后的女性慢性肝病患者，其肝细胞雌激素受体数量显著减少，导致脂质过氧化增加，超氧化物歧化酶功能下降，肝纤维化和肝细胞癌的发生率显著上升[77]。
ESR是一类配体活化的转录调节因子，属核受体超家族成员。目前已发现在人体组织存在的ESR 有两种，即最早发现的α型(ESR1)和后来发现的β型(ESR2)[78]。ESR1表达较广泛，且与肝脏氧化性损伤关系紧密[75, 76]。ESR1基因是人类基因组中一个异常巨大的基因，其编码序列仅有1.8kb，8个外显子分布在300kb长的内含子中，5’上游150kb范围内至少有8个不同的启动子(图1. A)。ESR1 mRNA存在多种外显子缺失变异体，其中外显子5缺失变异体(用⊿5表示)缺乏雌激素结合区。⊿5剪接变异体在慢性HBV感染男性患者的肝组织多见，其表达量随着疾病的进展(从慢性肝炎、肝硬化到肝细胞癌)而升高，甚至在部分患者的肝癌细胞中成为ESR1 mRNA的主要表达形式[51]。此外，单纯表达⊿5剪接变异体为主的肝细胞癌对雌激素拮抗剂他莫昔芬的敏感性降低。ESR1不同启动子的使用可能影响转录和翻译效率，不同外显子缺失变异体可能影响ESR1的雌激素信号介导作用。导致ESR1不同启动子使用以及mRNA不同外显子缺失变异体产生的原因及调控机制目前尚不清楚，不同研究、不同个体差异很大[78]。
邓国宏等采用候选基因关联研究策略，对ESR1基因进行了系统性SNP发掘、单倍型构建和连锁不平衡结构分析，经过大样本的病例对照研究和核心家系传递不平衡测试，从群体水平和流行病学角度首次证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染[16]及慢性HBV感染相关肝细胞癌[21]的遗传关联。相反，ESR2基因多态性与慢性HBV感染的疾病进程没有显著关联。ESR1基因外显子区没有改变氨基酸序列的高频SNP位点，而阳性关联的ESR1外显子1 T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。前期研究发现T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位[21]。可能存在与外显子 1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)位点，调控区SNP位点与29C等位连锁的等位转录调节活性较强，导致转录
本中29C等位的表达比例高于29T等位。我们对ESR1基因两侧区域进行连锁不平衡作图的结果显示，ESR1关联位点位于启动子区-76 kb至内含子3之间的一个150 kb的连锁不平衡模块内，此区域内无其他基因存在，表明此关联是ESR1基因本身的关联[16](图4-22. A)。寻找此区域内影响T29C等位特异性表达差异的rSNP位点，对进一步认识ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有重要意义。位于此连锁不平衡区域内的ESR1基因A、B、C、D、T启动子区没有发现高频SNP位点, 没有迹象表明ESR1启动子区存在与T29C连锁的rSNP位点。
图4-22 ESR1基因结构示意图。A ：ESR1基因启动子、外显子及连锁不平衡模块；B：与疾病关联T29C位点连锁的IVS1 – 401T/C位点及其潜在的c-myb识别位点。
对其他基因的研究提示，启动子、增强子等转录调控序列有存在于内含子的可能性[79]。与ESR1外显子1 T29C位点连锁的内含子1 - 401T/C位点(IVS1 - 401T/C)为人群中常见多态，与乳腺癌、高血压、动脉硬化、骨质疏松、高血脂水平等多种疾病的遗传易感性有关[80-82]。绝经后的冠心病妇女中，IVS1 - 401C/C基因型个体对雌激素替代治疗的应答显著强于C/T或T/T基因型个体，表现为血清HDL胆固醇水平显著升高[83]。我们对IVS1 - 401T/C位点附近基因组DNA序列的生物信息学分析表明，C等位变异产生一个转录因子c-myb的识别位点(图4-22. B)。c-myb是肝脏星状细胞活化标志，与慢性肝炎及肝纤维化有关，其本身又可受雌二醇诱导[84-87]。根据以上证据，推测IVS1 -401T/C位点可能是ESR1基因一个新的顺式调控位点，并可能在慢性肝病中起作用。
我们的关联分析证实，由于IVS1 - 401C等位与外显子1 29C等位连锁，并且IVS1 T-401C和T29C 两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化的易感性显著关联。ESR1基因单倍型-401C+29C增加了HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性。因此，IVS1 -401T/C SNP可能就是影响T29C等位特异性表达的功能性rSNP位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。从疾病关联的rSNPs入手，深入研究其对基因及蛋白表达的影响，不仅对阐明疾病的发病机制有意义，而且，为下一步对复杂性疾病开展靶向治疗提供了理论依据。因为对调节性多态性位点进行治疗性突变比修复或者调节异常蛋白的效应容易得多[88]。
在本研究中我们采用EMSA、荧光素酶报告基因试验、等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)、位点特异性RNA干扰等手段，证实IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用。荧光素酶报告基因试验结果表明在雌二醇刺激后，pGL3- Promoter - IVS1 - 401C载体的荧光素酶活性显著高于pGL3- Promoter- IVS1- 401T载体，并且随着C等位不同拷贝数的增加，载体的荧光素酶活性也随着增加，而T等位的增加并不明显。C-myb表达载体能显著增加pGL3- Promoter - IVS1 - 401C载体的荧光素酶活性。提示这段ESR1 IVS1 -401T/C位点具有一种依赖核蛋白c-myb的增强子的活性，并且-401C等位的增强子活性高于-401T等位。EMSA和ChIP实验在体内和体外两个水平都证实ESR1 IVS1 -401T/C位点可等位特异性的结合核蛋白c-myb，并且两种等位的结合量存在明显差异，-401C等位的结合能力高于-401T等位。为了反向证明IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，我们对不同基因型细胞中进行了IVS1 -401T/C位点等位特异性干扰(内含子序列的干扰表现为被甲基化[89-91])，RNAi干扰结果表明，
IVS1 -401T/C位点两种等位特异性干扰后，可不同程度的抑制ESR1 ESR1转录(ESR1 mRNA和蛋白两个水平)，并且-401C等位干扰载体对CC型的细胞的ESR1 ESR1转录抑制效果最为明显，这也反向证明了IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控，-401C等位的顺式调控功能更强。
总之，ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、发展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。我们通过一系列的经典鉴定顺式调控元件的实验技术，多个层面的证明了ESR1 IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，首次证实ESR1 IVS1 T-401C位点为一与慢性HBV感染相关的功能性调节性SNP(rSNP)，IVS1 T-401C位点的等位特异性顺式调控功能可能是通过和依赖结合核蛋白c-myb而发挥作用。当然，我们还需要在这一重要发现的基础上，进一步观察IVS1 - 401位点C/T 等位变异对肝组织ESR1启动子使用、外显子缺失变异体表达的影响，以期深入认识ESR1基因rSNP 在慢性HBV感染相关肝病疾病进程中的功能和作用。