武汉植物学研究2006,24(6):541~545
Jou r na l of W uhan B ot anical R esearch
一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究田仁鹏,杨桥,周国玲,谈静泉,张珞珍,方呈祥*
(武汉大学生命科学学院,武汉 430072)
摘 要:从生长在湖北的南方红豆杉树皮中韧皮部分离出一批内生真菌,从中获得一株能产紫杉醇的菌株TPF6。
对其形态特征的研究以及生理生化特性的测定(b ilog)结果表明,菌株TPF6与链格孢属有很大的相似性;与18S r DNA分析比对表明,菌株TPF6属于链格孢属,并与链格孢属其他种共享95%~99%的保守序列,其中与交链格孢
(A lternaria alterna t a)18S r DNA的保守度高达99%;全细胞脂肪酸分析结果显示,18:2C IS9、12/18:0a为TPF6的主
要脂肪酸组分,该菌株与链格孢属(A lternaria)相似度最高,SI M值为59 8%。根据分类学研究结果,菌株TPF6属于半知菌门链格孢属,定名为交链格孢(A.alternata)。应用高压液相色谱技术测定结果表明,菌株T PF6发酵液中紫杉醇含量为84 5 g/L。
关键词:紫杉醇;交链格孢;18S r DNA分析;脂肪酸分析
中图分类号:Q949.331+.3 文献标识码:A 文章编号:1000 470X(2006)06 0541 05 Taxono m ic Study on a Taxol Produci ng Fungus Isolated fro m
Bark of Taxus chi nensis var.ma i rei
T I A N R en Peng,YANG Q i a o,Z HOU Guo L i n g,TAN Ji n g Quan,Z HANG Luo Zhen,FANG Cheng X iang*
(C olle ge of L i fe Sc i ences,W uhan Universit y,W uhan 430072,Ch i na)
Abst ract:T axono m ic stud ies w ere prefor m ed on the stra i n TPF6,w hich w as isolated fro m the bark o f Taxus chinensis var.m airei gro w ing i n H ubei Prov i n ce.Phenotypic ana l y sis and biolog analysis indicated that stra i n TPF6sho w h i g h si m ilar ity w ith genus A lternari a.Phy l o genetic analysi s based on18S r DNA gene sequence i n dica ted that the strain belongs to the genus Alternaria,sequence si m ilarity va l u esw ith its nearest neighbors are bet w een95%~99%,and share m ore than99%w ith stra i n A.alternata.The pre do m i n ant fatty acid co m ponents are18:2C I S9,12/18:0a and shares59 8%the sa m e cell u lar fatty ac i d co m positi o n w it h other m e m bers in A lternaria.On the base of taxono m ic data,the stra i n w as na m ed as A.
alternata.The taxol produc i n g ab ility w as deter m i n ed by HPLC and M S.The resu lt sho wn t h at the taxo l concentration in fer m entation m ed i u m is84 5 g/L.
K ey w ords:Taxo;l Alternaria alternata;18S r DNA;W ho le ce ll fatty ac i d s
紫杉醇(Taxo l)是一种抗肿瘤的特效药物,广泛被应用于转移性卵巢癌与转移性乳腺癌、肺癌、结肠癌以及支气管癌等疾病的临床治疗。它主要来源于植物组织中提取、红豆杉(Taxus)细胞组织培养、化学合成和微生物发酵等途径。红豆杉细胞组织培养需要的条件严格且产量低而化学合成成本昂贵,因此这两种途径均不适合大量获取紫杉醇。目前获得这种特效药物的主要途径是从红豆杉植物组织中提取。据初步统计,制备1g紫杉醇需要6棵60年龄以上的红豆杉的树皮,才能达到一个病人的治疗用量。但红豆杉已经作为濒危物种被列为国家一级保护植物。显然从红豆杉植物组织中提取已受到极大的限制,寻找获取紫杉醇的新途径具有十分重要的意义。
植物内生真菌是寄生于植物组织内的真核微生物,经过长时间的进化,植物内生真菌和寄主植物体形成了一定程度的共生关系,相互依赖,很多内生真菌带有植物体的酶系,可以产生和寄主植物体相同的次生代谢产物。1993年,美国化学家Stierle和植物病理学家Strobe l[1,2]最早从短叶红豆杉(Taxus brevi f olia)的韧皮部分离出一株产紫杉醇的内生真菌,通过采用质谱、色谱(TLC/HPLC)和放射性化学
收稿日期:2006 04 13,修回日期:2006 06 06。
基金项目:国家自然科技资源平台项目(2005DKA21208)资助。
作者简介:田仁鹏(1981-),男,硕士研究生,主要从事微生物遗传学研究。 *通讯作者(E m ai:l cxfang@w https://www.doczj.com/doc/a913626629.html,)。
标记证明了其培养物中存在紫杉醇,虽然产率较低,但是给人们很大的启示,为通过微生物发酵产生紫杉醇带来了希望。相继分离产紫杉醇真菌的研究逐渐活跃。目前报道产紫杉醇的真菌有紫杉霉属(Tax o myces)、盘单毛孢属(M onochaetia)、镰刀霉属(Fusarium)、链格孢属(A lternaria)等数十个属[3,4],经过培养优化,得到了许多高产的菌株。其中王建峰等[5]从福建地区的南方红豆杉中分离出一株紫杉醇产生菌,发酵产量达到了185 4 g/L。
红豆杉这种古老的树种分布于我国境内的主要有东北红豆杉(T.cus p idata)、中国红豆杉(T. chinensis)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、西藏红豆杉(T.wallichiana)和南方红豆杉(T.chinensie var. m airei)等品种,它们的组织中寄生有种类丰富的内生真菌。我们从生长在湖北地区的南方红豆杉组织中分离出内生真菌,并对其进行了分类和代谢的研究,以期丰富红豆杉内生真菌的种群资源,为寻找更高产或更适合人工修饰的产紫杉醇真菌奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
南方红豆杉(Taxus ch i n ensis var.mairei)树皮,采于湖北地区,样品采集后迅速装入无菌塑料袋中, 4 保存。
1.2 实验方法
(1)菌株的分离与纯化 将南方红豆杉树皮置于无菌条件下,切割成边长为0 5c m的正方形小块,用75%的乙醇表面消毒2~3m i n,然后用无菌水漂洗3次;用无菌滤纸吸干水分,然后嵌入水 琼脂培养基中,30 培养3~10d,待菌丝体长出后,挑取菌丝体尖端于PDA培养基中,28 培养3~4d 后,再挑取菌丝分离单个菌落,直至为纯培养。
(2)菌株的形态特征 取菌株TPF6孢子涂布于PDA平板上,置28 培养;待刚长出菌丝时,将无菌的盖玻片斜插入平板内(插片法),继续培养至孢子成熟时,将玻片取出在显微镜下观察其特征。
(3)生理生化特性的测定 使用B i o log自动微生物分析仪(BI OLOG公司)对TPF6的生理生化特性进行测定。操作方法根据B io l o g操作指南进行[6]。培养基为2%的M E固体培养基,加样悬浮液浊度为75%。
(4)全细胞脂肪酸组分分析 全细胞脂肪酸组分分析使用安捷伦GC6890series(安捷伦公司生产)。全细胞脂肪酸的制备与测定按照安捷伦GC 6890脂肪酸测定仪操作手册进行。培养基为沙堡葡萄糖液体培养基(Sa bouraud Dex trose B roth),28 扩大培养3d,待培养物变成褐绿色时离心收集菌体,经过皂化和甲脂化处理后,抽提脂肪酸甲脂上样分析。
色谱条件:检测器,氢火焰(FI D);检测器温度300 ,色谱柱为19091B 102UL TRA2,固定相DEGS,汽化室温度250 ,柱温170 ,载气(N2) 60~65mL/m i n,H250mL/m in,空气500mL/m i n,进样量0 5 L。
(5)18S rDNA测定 菌株TPF6的18S r DNA 序列的测定参照W h ite等的方法[7]进行。PDA培养基28 培养TPF6至对数期,收集菌体,用酶 CTAB 法破菌株TPF6细胞壁抽提染色体DNA[8,9],从琼脂糖凝胶电泳检测并回收染色体DNA。PCR扩增菌株TPF6的18S r DNA序列与测序根据其通用引物NS1,NS8进行。
NS1:5 GTA GTC ATA TGC TTG TCT C 3 ;
NS8:5 TCC GC A GGT TCA CCT ACG GA3 。
PCR反应总体积为50 L(其中Taq pre m ix 25 L,上游引物1 L,下游引物1 L,模板DNA 3 L,无菌去离子水20 L)。PCR反应条件为: 94 5m i n一个循环,94 1m i n,60 1m i n,72 1 5m i n,共35个循环;最后在72 下延伸10m i n。PCR反应产物用0 8%琼脂糖凝胶电泳检测,回收(使用OMEGA公司胶回收试剂盒)。序列测定由博亚公司完成。根据测序结果,应用P HYLI P软件建立系统发育树[10]。
(6)紫杉醇的检测 将菌株TPF6接于200mL 液体PDA培养液中28 振荡培养2~3周,破壁,滤掉固状物,滤液经冻干机浓缩至1/10,然后用等体积氯仿/甲醇(10 1)抽提,取有机相;再抽干至粉状,并溶于1mL甲醇,用0 22 m微孔过滤器(M il lipore,B edford,MA,USA)过滤除杂质。
紫杉醇标准样品(SI GMA产品)用甲醇配成
0 07~0 7m g/mL的梯度,绘制标准曲线[11]。
H PLC检测条件:C8色谱柱,梯度洗脱:1~15m i n,甲醇含量从80%~100%,流速为0 2mL/m i n,检测波长为228nm,进样量为20 L,每份样重复3次。质谱分析用ESI离子源full m s scan 50 2 结果 2.1 菌株TPF6的形态特征 共从南方红豆杉树皮中分离出了6株内生真 542武汉植物学研究 第24卷 菌。菌株TPF6在PDA 平板上生长迅速,其形态特征见图1。菌落呈圆型,边缘不规则,菌落厚实;菌落表面初期呈白色,3~4d 左右逐渐由灰变为灰褐绿色。显微镜下菌丝有隔膜,未见核,菌丝直径2~5 m 不等。分生孢子梗从菌丝上生出(见图1:a), 结构简单有少量分支,分生孢子梗上形成分生孢子; 分生孢子呈倒棒状,无喙或喙短,直径4~8 m,长10~30 m,颜色由金黄色逐渐加深至褐色,成链状,具有明显的环状孢痕(见图1:b)。图1:c 为TPF6 产孢子后菌落表面扫描电镜照片。 a .TPF6菌丝体,分生孢子梗及分生孢子; b.TPF6孢子形态;c .TPF6菌体表面扫描电镜 a .M yceli al and s pore photo m icrograph ofTPF6gro w n on PDA m ed i um at 28 for 3d ; b .Photo m icrograph of spores of TPF6; c .SE M Photo m i crograph fro m t h e s u rf ace of strai n TPF6 图1 菌株TPF6的形态特征( 1000) F i g .1 Phenotypic data o f stra i n TPF6( 1000) 2.2 生理生化特性 经用B i o log 96孔真菌鉴定板(FF)和微生物自 动鉴定仪测定菌株TPF6的生理生化特征,结果表明,菌株TPF6可利用的碳源有:N 乙酰基 D 葡萄糖胺、L 阿拉伯糖、熊果苷、D 纤维二糖、糊精、龙胆二糖、乳果糖、麦芽糖、麦芽三糖、D 甘露糖、 甲基 D 葡萄糖苷、D 核糖、蔗糖、D 海藻糖、松二糖、D 木糖等碳水化合物,以及i 赤藓糖醇、甘油等有机醇和 D 葡萄糖 1 磷酸、D 葡萄糖醛酸、溴化琥珀酸、延胡索酸、 酮戊二酸、L 乳酸、L 苹果酸、奎尼酸、L 丙胺酸、L 丙氨酰甘氨酸、L 天门冬酰胺、 L 谷氨酸、L 苯丙氨酸等有机酸,而不能利用阿东糖醇、葡萄醛酰胺、肌醇、麦芽糖醇、D 蜜二糖等物质。 B i o log 测定结果与其真菌库比对结果显示菌株TPF6与互格链格孢[A lternari a alternat a (Fr .) Ke issler]最为相似。 2.3 全细胞脂肪酸的测定结果 TPF6的全细胞脂肪酸组分主要为18:2CIS9,12/18 0a ;16:0;17:03OH;17:1C is 9(w 8);18:0;19:0I SO 等,其中18:2C I S9,12/18:0a 含量最高,占总脂肪酸的63 17%(见图2)。Sherlock 软件配有真菌脂肪酸数据库,可以和TPF6全细胞脂肪酸成分分析结果进行比对,根据该数据库的比对结果显示:菌株TPF6的脂肪酸组分与链格孢属(A lterna ri a spec ies)的相似性(S i m 值)最高,为0 589,其中与交链格孢(A.alternata )的Si m 值为0 530 。 图2 TPF6全细胞脂肪酸GC 分析图 F i g.2 W ho l e ce ll f a tty ac i d ana l y si s of T PF 6 543 第6期 田仁鹏等:一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究 2.4 18S r DNA 序列的测定结果 以TPF6染色体DNA 为模板,使用丝状真菌18S r D NA 通用引物NS1、NS8进行PCR 扩增,获得一条1 8kb 左右大小的片断(见图3),经过测序,得到的1834bp 的片段在GenBanks 数据库比对,其结果见图4 。 1-4.18S r DNA of TPF6; 5. Eco T14DNA m arker ; 6.DL2000 m ar k er(Purchased from T akara) 图3 18S rDNA 扩增片段琼脂糖凝胶电泳图 F i g .3 0.7%aga rose g el e l ec trophoresis pattern o f TPF618S r DNA 图4 菌株TPF6依据18S rDNA 序列的系统发育树 F i g.4 Phylogenetic tree bet ween stra i n TPF6and re l a ted stra i ns based on 18S r DNA sequence (The 18S r DNA sequence were a ll from N CB I) 根据比对结果表明菌株TPF6与链格孢属内各种之间含有95%~99%的序列高度保守。其中交链格孢的18S r DNA 序列与菌株TPF6的同源性为99%,只有3个碱基的差别;萝卜链格孢霉(A.raphani ),番 薯生链格孢霉(A.brassicicola ),芥链格孢霉(A.bra ssicae )[12] 等与TPF6的相似度都大于98%,可认定在进化地位上与TPF6的亲缘关系较近。2.5 菌株TPF6产生紫杉醇的检测结果 高压液相色谱分析紫杉醇标准样在RT =2 210左右有较强的一个吸收峰(见图5:A ),根据0 07~ A .0.14m g/mL 的紫杉醇标准样品液相图; B.TPF6细胞发酵提 取液样品液相图 A .Taxol standard sa m p l e (0.14m g/mL ); B .Fer m en t ati on m et abo li te and cell extract of TPF6 图5 H PLC 检测紫杉醇的图谱F i g .5 HPLC Chrom atogra m o f taxo l detection 0 7mg /mL 的紫杉醇标准样流出线性方程用来计算 样品的浓度(y =7135 92027x -51 56744(p <0 0001,r=0 99886)。图5:B 为菌株TPF6细胞发 酵提取物样品液相色谱图,在保留时间RT =2 209左右有一个较强的吸收峰。在同样的色谱条件下,可以初步判定与标准样品峰为同一物质,并可根据峰面积551 4推算出原始发酵液中紫杉醇含量为84 5 g /L 。选择性离子质谱(M S)分析得到分子量为854紫杉醇分子离子峰和876 5的钠离子加合峰(见图6), 确定该分子为紫杉醇分子。 图6 菌株TPF6产生紫杉醇的质谱图 F i g .6 M S chro m atogra m o f taxo l fro m stra i n TPF6 544 武汉植物学研究 第24卷 3 讨论 通过对分离获得的菌株TPF6的显微镜观察和B I O LOG微生物生理生化鉴定,从菌丝、孢子的形态,产孢子的特征,代谢特性等发现菌株TPF6株与链格孢属特征相似。以丝状真菌18S r D NA的通用引物,以菌株TPF6染色体DNA为模板扩增出菌株TPF6的18S r DNA进行测序,并在NCBI上进行比对及建立系统进化树,可以确定菌株TPF6与属内其他种的亲缘关系,从而更准确的对其进行定位。全细胞脂肪酸组分在系统微生物学占有重要的地位。细菌的脂肪酸组分测定较多,丝状真菌分析较少,链格孢属中尚未见报道。本研究的全细胞脂肪酸组分分析结果可补充这方面数据。在对菌株TPF6的分类学研究中,B i o l o g生理生化特征的测定、全细胞脂肪酸组分测定和18S r DNA序列测定取得了一致的结果。国内外研究者在对产紫杉醇真菌的研究中多为形态特征和生理生化特性的检测以及产紫杉醇特性的分析,尚未见对产紫杉醇真菌进行全面分类学分析的报道,我们将18S r DNA序列分析和全细胞脂肪酸组分测定用于产紫杉醇真菌的分类研究中,丰富了对产紫杉醇真菌的鉴定手段,使我们能更全面更准确地将其定位。 链格孢属真菌大多兼性寄生于植物体,作为一种植物的内生物(endophy te);它们大多可以产生很多有用的代谢产物,是经济上重要的真菌属之一,也是真菌学研究热点之一。红豆杉属植物全世界约有11种,分布于我国的有4个种和1个变种,即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉。目前这几种红豆杉都有报道分离出产紫杉醇的内生真菌,且它们有着丰富的多样性。累计研究结果表明,红豆杉组织中紫杉醇的含量与其种属没有明显的相关性,而与红豆杉的产地和生态环境密切相关[13]。葛菁萍[14]、项勇等[15]曾分别报道从东北红豆杉树皮中分离出产紫杉醇的链格孢属真菌,而从南方红豆杉分离获得产紫杉醇的链格孢属真菌国内尚未见报道。我们从生长在湖北地区的南方红豆杉树皮中分离获得了产紫杉醇的链格孢,同时暗示链格孢属真菌为红豆杉属植物的常见内生菌,含有紫杉醇生物合成酶系。本研究结果表明链格孢属真菌的寄生特性与植物的种类有关,而与其生长的地域性的关系不明显;而其产生紫杉醇的能力是否也与宿主红豆杉生长的地理位置及其生态环境存在相关性尚待进一步研究。 参考文献: [1] Sti erl e A,S trob el G,Sti erl e D.Taxol and t axane p roduction by Taxo m yces and reanae,an endophyti c f ungu s of pacific ye w[J]. 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Stierle证明Taxus brenifoli a nutt中的内共生真菌Ｔaxomyces andreanae可以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩目[5]。 目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的研究。本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优化的研究。 1.3本论文研究的内容 碳源在微生物中是用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢提供能量。除自养菌能以CO2作为唯一碳源外，大多数微生物是以有机含碳的化合物做为碳源和能源。 红豆杉内共真菌发酵培养选用的碳源一般有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等。糖类的种类和浓度对细胞生长的影响很大，本试验运用正交试验设计对发酵培养基的碳源进行优化。 2.材料和方法 2.1.材料 2.1.1试剂 葡萄糖AR 中国医药集团上海化学试剂公司麦芽糖BA 上海生物化学试剂公司 蔗糖AR 上海化学试剂有限公司 南方红豆杉栽培技术-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII 南方红豆杉栽培技术 南方红豆杉为国家Ⅰ级保护树种，采取人工造林的方式进行南方红豆杉培育生产，具有成本低、见效快等优点。 1、造林地的选择 根据南方红豆杉的生物学特性及天然分布区域，造林地宜选在山坡中、下部及坡脚和沟槽，阴坡或半阴坡，坡度30°以下，土层深厚、肥沃，土壤pH值在5～7的微酸性砂壤土（一般生长松科植物、蕨类和竹类的地段均适宜），也可在郁闭度较小的幼林下造林，最好是附近有天然红豆杉分布。 2、整地 整地一般在10～12月进行。地势平缓、土壤肥力高的地块宜全垦整地，可高密度栽植；荒山荒地宜穴状整地，低密度栽植；幼林下造林，根据郁闭度大小及林木分布情况，在林中空地采用穴状整地。株行距2m×2m，穴规格30cm×30cm×40cm，将表土回填到穴深的1/3左右，并去除石块、杂物等，再施基肥与表土混合均匀，肥料以有机肥为主，最后回填表土使穴成馒头状。 3、栽植 根据江西山区气候特点，南方红豆杉的栽植时间以冬末春初为好，即每年的11月末至翌年3月初，随起随栽，将苗木的根系在已准备好的ABT生根粉带泥浆溶液中浸一下，以促进根系生长和补充苗木所失水分。挖开已回填的穴，将苗木植入穴中，回填土提苗，保证苗木根系舒展，扶正苗木，用脚踩实四周，保证苗根与土壤密接，栽植后及时浇透定根水。 4、抚育管理 南方红豆杉生长较慢，造林后的前几年要精心管理。一般在5～6月和8～9月各锄抚1次，主要是松土、除草等。在锄抚时应对苗木进行培土、扩穴、埋青，以增加土壤肥力，涵养水分，并使穴状整地造林地尽量连成带状或小带状。自第2年开始，可结合抚育进行施肥，每年至少1～2次，施肥方法是在苗干基部挖环形沟，后将复合肥均匀施入沟内，每株200g左右（逐年增加），浇水，再覆土填平即可。也可在栽植后进行间作玉米、黄豆等高杆农作物，不仅可以为幼苗遮荫，还可以结合农作物管理进行除草、施肥。为促使幼林生长，在造林5年以后，可根据幼树生长情况进行修枝、定干，以解决红豆杉分枝低、冠幅大、主干不明显的不利影响。修枝每年1次，修去最下面的一轮枝，达到一定的郁闭度后，应及时进行抚育间伐。 5、病虫害防治 南方红豆杉抗逆性强，病虫害较少。目前只发现有少量蜘蛛或蚜虫为害，可在5～6月喷1次杀螨剂2000倍液防治蜘蛛；喷吡虫啉1000～1500倍液，或啶虫脒1000～1500倍液防治蚜虫。 6、种植前景红豆杉是第三世纪遗留植物，被称为植物王国里的“活化石”，因其资源稀少，被列为世界珍稀树种加以保护。红豆杉集药用、材用、观赏于一体，具有极高的开发利用价值。从红豆杉树皮和枝叶中提取的紫杉醇是世界上公认的抗癌药，每公斤售价为500～1000万美元。紫杉醇用于治疗晚期乳腺癌、肺癌、卵巢癌及头颈部癌、软组织癌和消化道癌。红豆杉枝叶用于治疗白血病、肾炎、糖尿病以及多囊性肾病。红豆杉自然资源匮乏，药源紧缺，因而各地都在对其进行着广泛的研究开发。红豆杉全身是宝，因此红豆杉树又被称为“黄金树”，种植前景看好。条件成熟的地方可适当发展。 江西绿农编赠 2 苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目: 有机合成考试得分 院别: 材料与化学化工学部专业: 分析化学 学生姓名: 饶海英学号: 20114209033 授课教师: 考试日期: 2012 年 1 月8 日 天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要:本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词:多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西她赛(Docetaxel) , 化学名为[ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,就是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制就是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂与增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这就是现阶段最具经济性与可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法就是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C13位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多烯紫杉醇C13位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究与总结。具有游离羟基的C13位侧链,C2与C4位的酯基,C4、C5位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起着很重要的作用。 1988年,Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB),DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇,并已工业化生产[6]。半 生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ?研究报告?２００８年第４期 收稿日期：２００８－０２－２１ 基金项目：河南省科技攻关项目（０６２４４２００１６） 作者简介：竺俊鑫（１９７９－），男，硕士研究生 通讯作者：孟丽（１９５９－），女，汉族，河南睢县人，教授，硕士生导师，主要从事植物资源及利用的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｉｓｔｍｌ＠１６３．ｃｏｍ 前言 紫杉醇的国际通用名为Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商品名Ｔａｘｏｌ［１］，是１９７１年美国学者Ｗａｎｉｅｔａｌ［２］从短叶红豆杉（ＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮｎｔｔ．）的树皮中提取的一种四环二萜类化合物。作为一种天然的次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效［３￣５］。紫杉醇是近年来在抗癌领域的最重大发现之一，已于１９９２年被美国食品和药物管理局（ＦＤＡ）批准为治疗转移性卵巢癌的新药并已上市。 红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究 竺俊鑫１ 李勇超２孟丽２（１河南师范大学生命科学学院，新乡４５３００７；２河南科技学院生物技术系，新乡４５３００３） 摘要：目的探讨红豆杉不同部位在内生真菌分离效率以及产紫杉醇菌株筛选率方面的规律性，为红豆杉产紫 杉醇内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。方法从根、茎、叶３个器官取大小和表面积相同的太行山野生红豆 杉（Ｔａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）材料，用组织块法分离红豆杉内生真菌，计算各部位内生真菌的分离效率；用高效液相法对分离到的内生真菌发酵液提取物进行紫杉醇含量分析，计算各部位产紫杉醇内生真菌的筛选率。结果 共分离到１０９株红豆杉内生真菌，根部、茎部和叶部分离效率指数分别为０．９０、０．６３和０．２８；其中有２８株产紫杉醇，紫杉醇菌株筛选率分别为３１．４８％、２１．０５％和１７．６５％。结论 在内生真菌的分离效率及其产紫杉醇内生真菌的筛选率上，均为根部﹥茎部﹥叶部，即根部在内生真菌分离效率和筛选产紫杉醇内生真菌效率上均具有明显的优势。 关键词：内生真菌紫杉醇高效液相色谱分离部位ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰａｒｔｓｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃＦｕｎｇｉｆｒｏｍＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｉｎＴａｉｈａｎｇＭｏｕｎｔａｉｎ ＺｈｕＪｕｎｘｉｎ１ＬｉＹｏｎｇｃｈａｏ２ＭｅｎｇＬｉ２ （１ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｉｔｕａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｃｅｒｔａｉｎｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｍａｔｅｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｓｉｚｅｆｒｏｍｒｏｏｔ、 ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅａｃｈｐａｒｔｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＴｈｅｔａｘｏｌｃｏｎｔｅｎｔｓｆｒｏｍｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｌｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＰＬＣ．ＡｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ１０９ｓｔａｉｎｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｇｒｏｗｉｎｇｉｎＴａｉＨａｎｇｍｏｕｎｔａｉｎ，ｔｈｅｉｒｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅ０．９０，０．６３ａｎｄ０．２８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｉｇ，ａｎｄ２８ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｓｔｒａｉｎｓｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｔａｘｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔａｉｎｓｗｅｒｅ３１．４８％，２１．０５％ａｎｄ１７．６５％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｆｏｌｌｏｗｅｄｌｉｋｅｔｈｉｓｒｏｏｔ＞ｓｔｅｍ＞ｌｅａｆ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｎｔｈａｔｒｏｏｔｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｄｖａｎｔａｇｅｏｎｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔａｘｏｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ，ａｎｄａｌｓｏｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｎｄｏｐｈｔｉｃｆｕｎｇｉＴａｘｏｌＨＰＬＣＩｓｏｌａｔｉｏｎｐａｒｔｓ 南方红豆杉的鉴别研究 李效贤,张春椿,熊耀康 * (浙江中医药大学药学院,浙江杭州310053) 摘要 目的:对南方红豆杉枝叶进行鉴别研究。方法:采用系统的中药鉴定方法对南方红豆杉枝叶的性状、组织显微进行研究,并以10 脱乙酰巴卡亭 (10 DAB )为对照对南方红豆杉枝叶进行薄层鉴别。结果:南方红豆杉枝叶性状特征:茎上小枝不规则互生,叶片全缘,近革质,中脉隆起明显,叶背具有2条黄褐色气孔带。茎横切面特征:形成层明显,木质部发达,年轮清晰,有髓射线,髓发达;叶横切面特征:叶表面具角质层,叶肉组织异面型,栅栏组织通过中脉,气孔分布于下表皮;叶上表皮栅表比为0 33,叶下表皮气孔带内的气孔指数为0 074~0 085;粉末特征:表皮细胞、纤维、气孔多见,色素块棕色或红棕色,木栓细胞黄棕色,管胞多为环 螺纹和螺纹,偶见绿色草酸钙方晶。薄层色谱法可检出10 DAB 。结论:本研究结果为南方红豆杉的药材鉴定、资源利用和质量标准制定提供科学依据。 关键词 南方红豆杉;性状鉴别;显微鉴别;薄层色谱鉴别 中图分类号:R 282 5 文献标识码:A 文章编号:1001 4454(2011)04 0538 03 收稿日期:2010 06 03 基金项目:浙江省中医药管理重大项目(2007ZA002);浙江省科技厅项目(2008C32020);浙江省中药现代化项目(浙财企字[2009]331)作者简介:李效贤(1984 ),女,在读博士研究生,主要从事中药资源开发与利用研究;E m ai :l xi aoxian07@126 co m 。 * 通讯作者:熊耀康,Te:l 0571 ********,E m ai:l x i ongyaokang @to m co m 。 南方红豆杉Taxus w allichiana Zucc var m airei (Le m ee et L vl)L K Fu etN L i 为红豆杉科红豆杉属植物,主要分布在我国长江流域、南岭山脉等地区的山地或溪谷 1 。据 本草纲目 记载: 其性辛、味 甘,大温,归胃、肝经 ,具有解毒、散结、止痛等功效,临床上用于治疗症瘕积聚、瘀血经闭,食积胀痛、霍乱、伤寒等症。现代研究表明,南方红豆杉枝叶中 含有紫杉醇、10 脱乙酰巴卡亭 (10 DAB )等数种抗肿瘤活性物质,对乳腺癌 2,3 、卵巢癌和食管癌 等恶性肿瘤疗效较好 4,5 。关于南方红豆杉的生药 学研究尚未见详细报道,为了开发利用并能准确鉴别南方红豆杉,笔者对其枝叶的组织、粉末特征及薄层鉴别进行了研究。现报道如下。1 仪器与材料 1 1 仪器 E200三目显微镜(日本N I KON 公司),数码相机(日本N I K ON 公司),2235转轮式切片机(襄樊徠克生物电子仪器厂),TB 718E 型生物组织自动包埋机(泰维科技)。 1 2 材料 南方红豆杉1~4年生枝叶采自浙江宁海,经浙江中医药大学姚振生教授鉴定为红豆杉科红豆杉属植物南方红豆杉Taxus wallichiana Zucc var ma irei (Le m ee et L v l)L K Fu et N L i 的枝叶,凭证标本保存于浙江中医药大学药学院中药标本馆。10 脱乙酰巴卡亭 (10 DAB )标准品(批号:054K1372)购自美国si g m a 公司;石蜡为专供生物组织切片用;所用试剂均为国产分析纯。2 性状鉴别 茎呈圆柱形,多分枝,小枝不规则互生,1~4年 生小枝直径约2mm,表面黄绿色至黄褐色。叶易脱落,呈螺旋状着生,排成两列,条形,微弯,黄绿色至黄褐色,长1 5~3c m ,宽0 25~0 35c m ,上部渐窄,先端急尖或渐尖,叶柄短,叶基扭转;叶片全缘,近革质,上面中脉隆起明显,叶背具有2条黄褐色气孔带。质脆,易折断。气微,味苦、涩。3 显微鉴别 3 1 茎横切面 木栓层由3~7层细胞构成,排列紧密,沿切线延长。栓内层细胞5~7层,细胞长方形、类圆形,直径3~10 m,排列疏松并向内逐渐变小。韧皮部由7~9层细胞构成,细胞长方形、类圆形,排列整齐,形成层明显,木质部发达,年轮清晰。髓射线宽1~2列细胞,细胞由内向外逐渐增大并呈径向延长。髓发达,细胞圆形、类圆形,直径8~10 m 。见图1。 3 2 叶横切面 叶表面具角质层,厚约0 33 m 。上、下表皮均有1层排列紧密的细胞构成,细胞类圆形,大小不等,直径6~11~1 4 m,排列紧密。气孔分布于下表皮,内陷成行排列。叶肉组织异面型,栅栏组织和海绵组织分化明显,栅栏组织通过中脉,由1~2层细胞组成,细胞长圆形,直径0 8~1 8 m;海绵组织由多层细胞组成,细胞类圆形、椭圆形,大小不等,直径0 5~2 9 m,细胞间隙较大,排列疏松。叶脉处传输组织明显,形成层明显,木质部位于向茎面,韧皮部位于背茎面。见图2。 538 Journa l o f Ch i nese M ed ici na lM a teria l s 第34卷第4期2011年4月 紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。 植物内生真菌研究进展 植物内生真菌（Endophytic fungus）是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在，具有丰富的物种多样性。它是生活在植物组织内的一类微生物, 是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中, 与寄主协同进化, 根据内共生理论, 内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。1898年，Vogl等人从黑麦草Lolium temulentum L. 种子内分离出第一株内生真菌，引起了人们对植物内生真菌的注意。特别是美国学者从短叶红豆杉Taxus brevifolia的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，更是掀起了各国学者对内生真菌的研究热潮。 1 植物内生真菌的研究方向 内生真菌活性成分的筛选有两条思路。一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力这一特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生真菌，常用方法是对分离得到的内生真菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对性强、工作量相对较小，是目前从内生真菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法已从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活性物质。这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生真菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型进行活性菌株的筛选。其次是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质，再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。 2 内生真菌药用活性物质及其生物学作用 2.1 抗肿瘤活性物质 2.1.1萜类化合物 紫杉醇是存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物, 被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。由于紫杉属植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1993 年美国学者Stierle 等首次从短叶紫杉( Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离出一种新的内生真菌( Taxomyces an2dreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。2006年, 田仁鹏等从生长在 综诉利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇的技术 路线及其影响因素、对策 摘要红豆杉细胞培养是工业化生产紫杉醇的很有前景的途径之一。综述了红豆杉细胞培养过程中外 植体的选择、愈伤组织的诱导、培养方式、生物反应器及培养动力学等方面的最新研究进展,并对今后利用细胞 培养工厂化生产紫杉醇尚需解决的问题作了简略的探讨。 关键词红豆杉;细胞培养;紫杉醇 紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物中分离出的一种二萜类化合物,对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效,它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。然而从天然生长的红豆杉树中提取紫杉醇无法满足需求,药源不足已成为限制紫杉在临床中大量应用的瓶颈。植物细胞培养具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。目前利用细胞大量培养技术生产紫杉醇的研究已经进入到生物反应器放大阶段，红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇有望获得突破。 为解决紫杉醇的药源问题，人们从以下几个方面进行了研究：全合成、半合成、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等方法。其中细胞培养法由于具有下述优点成为人们进行商业生产的优选方法：(1)能够确保产物无限、连续、均匀地生产，不易遭受病虫害、季节等因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并且通过控制环境条件提高紫杉醇产量；(3)所得产物比从植物体内直接提取简单，可以大大简化分离和纯化步骤; (4)除提供紫杉醇外，还可以生产出前体及其他有抗癌活性而原植物所不含的化合物。 技术路线 1 愈伤组织的诱导与培养 1. 1 外植体的选择 外植体对于愈伤组织的诱导率、生长状况等具有重要影响。红豆杉属植物愈伤组织的诱导相对比较容易。根、茎叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴、芽等都可作为外植体诱导出愈伤组织,但不同外植体其愈伤组织的诱导率及愈伤组织生长情况差别很大。茎段的诱导效果较好,而树皮、叶片较差。 1. 2 培养基及激素的选择 对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养,多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5 【1】培养基。然而,也有不同的研究结果报道。以南方红豆杉芽为外植体,最适诱导培养基为MS 【2】,对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5 为最佳。 1. 3 培养条件 黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成,紫杉醇的产量高于光照条件下的3 倍。愈伤组织诱导与培养的适宜温度为20～25 ℃。对于细胞悬浮培养而言，培养基的主要成分相同于固体培养基，只是去掉了琼脂,大多使用B5培养基。悬浮培养中，使用的碳源大多为蔗糖，果糖对紫杉醇含量的提高有一定的作用，而半乳糖对细胞生长作用显著。高浓度蔗糖（40 g.L-1)能提高培养细胞紫杉醇的含量。果糖能提高一般细胞紫杉醇的含量，但对高产培养物来讲，果糖没有作用。蔗糖有利于细胞生长，而葡萄糖抑制紫杉烷的合成。糖的补充有缩短悬浮细胞生物量增加时间的作用。植物激素对悬浮培养细胞的生长和紫杉醇含量有较大的影响。2,4-D一般抑制次生代谢产物的合成，促进细胞生长。2,4-D 浓度在1.0～3.0 mg.L-1之间时，培养细胞中紫杉醇的含量与2,4-D浓度呈负相关。适当改变生长素与激动素比例可提高紫杉醇含量,当其比例为5～10时，紫杉醇含量较高。 1. 4 愈伤组织褐变现象的控制 紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学 紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀 2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。 紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中 1999年2月 第29卷第1期 西北大学学报(自然科学版) Jou rnal of N o rthw est U n iversity (N atu ral Science Editi on ) Feb .1999V o l .29N o.1 0收稿日期:1998205220 资金来源:陕西省自然科学基金资助项目(FH 95401) 作者简介:马天有(19682),男,硕士 从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究0 马天有 董兆麟 (西北大学生物学系,西安,710069) 摘 要 将生于秦岭地区的中国红豆杉树皮中分离得到的一株内生真菌,在马铃薯培养基中进行 发酵试验,用薄层层析、薄层扫描检测。分析结果表明这株真菌能合成紫杉醇,高效液相色谱技术测定其紫杉醇含量约为14120Λg L 。 关键词 中国红豆杉;内生真菌;紫杉醇;薄层层析;高效液相色谱 分类号 Q 93915 文献标识码 A 论文编号 10002274 (1999)0120047249 紫杉醇(taxo l )是人类70年代初从短叶红豆杉(tax us bren if olia nu tt )[1]树皮中分离提取到的一种二萜衍生物。后经Ho rw itz 等研究证实紫杉醇具有独特的抗癌作用机理,它能使癌细胞内纺锤丝的形成受到抑制,有丝分裂不能正常进行,而阻止了癌细胞的扩散。故1992年被美国FAD 批准用于卵巢癌的治疗。后又经多年的研究和临床实验,使紫杉醇的抗癌范围逐渐在扩大,目前进行的乳腺癌、肺癌的临床试验已取得很好的效果。 目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的。由于红豆杉属于濒危珍稀植物,资源有限,生长又很慢,大量砍伐不但危及到自然界的生态平衡,而且也会带来紫杉醇原料的枯竭。因此,寻找紫杉醇未来新的生产途径,已成为摆在人类面前的一项重大研究课题。近年来国内外学者主要从3个领域进行探索,即化学合成法、植物细胞培养法[2]和微生物工程法[3]。目前人们普遍认为微生物工程法是一种最具潜在能力,最具可能性的一种方法[4]。本文正是采用微生物工程技术,研究从我国秦岭地区生长的红豆杉树皮中,分离产紫杉醇的内生真菌的方法和结果。 1 材料和方法 111 材料来源 中国红豆杉(tax us chnesis )来源于陕西省留坝县庙台子地区为几十年生的老树。紫杉醇标准品购 自Sigm a 公司。112 实验用培养基 固体培养基:马铃薯200g ,葡萄糖20g ,琼脂20g ,水1000mL ,pH 自然。配制方法是马铃薯去皮切碎,水煮40m in ,4层纱布过滤,溶入葡萄糖及 琼脂后加水定容。1105kg c m 2 灭菌20m in 。 液体培养基:配制方法同上,只是不加入琼脂, 分装至250mL 三角瓶中,每瓶50mL 。1105kg c m 2 灭菌20m in 备用。 113 内生真菌的分离和纯化 取新采的红豆杉树皮,除去外层老化部分,切成1c m ×1c m 的小块,置于75%的酒精中消毒5m in ,用无菌水冲洗后置于马铃薯固体平板培养基上,25℃培养一段时间后周围长出少量菌丝。用接种针挑取不同部位的边缘菌丝,分别接种到固体平板上培养,长出新的菌落后,再挑取其尖端菌丝培养,如此反复纯化多次后即可得到一个纯菌株。114 真菌培养物的预处理及样品溶液的制备 用马铃薯液体培养基,250mL 三角瓶中装50 mL 培养液,接少量菌丝,30℃,220r m in ,培养6 ～7d 。培养物冷冻后用组织捣碎机匀浆3m in (转速为10000r m in ),4层纱布过滤,滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(CHC l 32M eO H 10∶1),充分振荡后静置8～12h ,收集有机溶液相,并在45℃条件下减压蒸发,残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。 红豆杉南方红豆杉盆景日常养护知识 红豆杉基本知识 红豆杉，学名Taxus mairei ，红豆杉科，红豆杉属。又名赤柏松、紫杉。是冰川世纪孑遗物种。紫杉是国家一级保护植物，常绿乔木，其木材细密，色红鲜艳，坚韧耐用，为珍贵的用材树种。其果实结樱桃大奇特红豆果，其果假种皮肉质红色，杯状或坛状，具有较高观赏价值，是珍贵的绿化树种。红豆杉中含有的紫杉醇具有独特的抗癌作用，能阻止癌细胞繁殖，抑制肿瘤细胞迁移，被公认为当今天然药物中最重要的抗癌活性物质。红豆杉属常绿乔木，叶螺旋状着生，排成二列，条形，略弯，近镰刀形，长2厘米—4.5厘米，宽3毫米—5毫米。边缘通常不反曲，上面中脉隆起，下面有两条黄绿色气孔带，下面中脉带的色泽与气孔带不同，中脉带上局部有成片或零星的角质突起，种子通常较大，长6毫米—8毫米，呈卵形或倒卵形，微扁。4月开花，10月种子成熟。红豆杉中国特有树种，产于通常生于海拔1000米—1200米较荫湿的山谷、溪边，成散分布。红豆杉生于亚热带树种，喜生于气候较暖、雨量充沛、湿度较高和酸性的土壤上，耐阴性强，生长缓慢，基部能萌蘖, 红豆杉日常养护 一、“光照要求”红豆杉幼苗和幼树喜阴性，因此不宜全光照，夏天要适当遮光，特别是每年7月至8月全光照和强光照下，过强的阳光，会导致幼树死亡。冬天红豆杉能耐零下20摄氏度低温，但在冬眠期（当年12月初到翌年2月底）不宜浇水。根据多年的实践，红豆杉最佳的光照是每天上午7点至11点，每天光照4小时左右，夏天光照时间短一些，在秋天和春天光照时间可以长一些。但没有光照也影响红豆杉的光合作用和生长。 二、“土壤选择”盆栽的土壤以壤土最好，保水、保肥、透气有利于红豆杉的生长。粘土虽保水、保肥，但不透气，不利于红豆杉根系的生长发育。砂土虽透气，但保肥、保水性差，也不利于红豆杉生长。也可选择草炭土、珍珠岩等与壤土配成混合基质。 二、“水分要求”浇水要适量，浇水次数因土壤干湿程度而定，在华中地区，每年的四月初至十月底为其生长期，这期间在室外摆放的每15天至20天浇水一次，在室内的每20天至25天浇一次。盆栽土壤水分含量以40%左右为宜。红豆杉浇水过多过勤会引起烂根，导致死亡，（室内养植盆景死亡的原因大多是浇水过多引起的）。特别是夏天雨水大时，室外摆放的要把多余的雨水及时排出去，以防止红豆杉在水中长期浸泡；盆栽土壤含水量太少，长期保持干旱缺水，也不利于红豆杉的正常生长。 三、“土壤肥力”红豆杉适生在土壤肥沃、疏松、湿润、排水良好、有机质含量高的泥土中，有机质含量3%以上生长特别良好。因此，对盆景土壤必须施肥，施肥量以有机肥每株0.2斤和复合肥0.02斤左右，也可视情况适量施一些农家肥、饼肥（如棉籽饼、花生饼、麻饼），施肥时应尽量沿盆壁施，且勿接近红豆杉根部。 四、“花盆选择”花盆选择要适当大点，盆下部要多打几个孔，主要是增强花盆的渗水性和透气性。 五、“移栽换盆要求”盆景种植两年后，树苗逐渐长大，根系更加发达，原来的花盆就不能适应生长的需要，必须换大盆栽培，移栽换盆一般选择红豆杉休眠期，抓住阴天进行盆景移栽和换盆定植，这时移栽成活率较高。移栽过程中必须保持幼树的根系完整和根毛的含水率，定植时保证根系和土壤紧密结合，最好把旧盆打烂，不要损坏原来的土球，将其慢慢移入新盆中，并浇水定根，确保成活率。如有条件，可把红豆杉树苗移植到大田生长，其生长速度会更快。南方红豆杉保护现状分析(初稿)1 -1(1)
紫杉醇提炼步骤
红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化
南方红豆杉栽培技术
紫杉醇的合成
已看：红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究
南方红豆杉的鉴别研究
紫杉醇提取工艺原理及操作技术
内生真菌研究进展
综诉利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇的技术路线及其影响因素
紫杉醇的提取和性能
提取紫杉醇初分离工艺的研究
从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究
红豆杉 南方红豆杉盆景日常养护知识.
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