万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC0750 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂80mg×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入6mL蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。 试剂三：液体1mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体2mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：液体3mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。操作步骤： 一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min。 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、操作表： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）200 蒸馏水（μL）500300 试剂一（μL）300300 试剂二（μL）100100 试剂三（μL）2020 试剂四（μL）3030 试剂五（μL）5050在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴1min，拿出迅速擦干测定90s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、ALDH酶活计算 （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。 ALDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Crp）÷T=804×△A÷Cpr （2）按样本质量计算 酶活定义：每克样品每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到 大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
大鼠心肌缺血/再灌注损伤 【实验目的】 1.复制大鼠在体与离体心肌缺血/再灌注损伤模型； 2.观察缺血/再灌注过程中心功能的变化 【实验动物】成年Wistar 大鼠（体重200－300g） 【仪器药品】 电子天平，肾形盘，动物呼吸机，BL-420F记录装置，眼科开睑器，微血管钳，组织镊，眼科镊，组织剪，眼科剪，眼科止血钳，止血钳，动脉夹，眼科缝合针，1号及00缝合线。Langedroff灌流装置。 20%乌拉坦，1ml注射器，5ml 注射器，纱布块 实验1 在体模型 【实验步骤】 1.实验采用体重200-300ｇ健康雄性Wistar大鼠，20%乌拉坦腹腔注射麻醉（0.5ml/100g）； 2.颈胸部备皮及手术，分离气管及右侧颈总动脉 3.气管插管连接呼吸机（呼吸肌参数：潮气量9ml，呼吸比=3:2，呼吸频率55~60） 4.经右侧颈总动脉逆行插管至左心室, 再经BL-420F软件输入计算机,（一通道描记心 电，（右上黄、右下黑、左下红）二通道描记心室内压，三通道描记微分）持续监测心脏左心室内压力及心电的变化情况 5. 沿胸骨左侧剪开2，3肋骨，开睑器开胸暴露心脏；寻找冠状动脉左前降支，穿线备 用; 6.采用结扎5min后再放开5min两次,造成缺血预处置；采用结扎30mim再放开30min 复制缺血/再灌注模型； 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
实验2 离体模型 【实验步骤】 (1) 大鼠称重，腹腔注射20%乌拉坦（0.5ml/100g）麻醉，仰卧固定于鼠板，上腹部及前胸部剪毛。 (2) 舌下/阴茎背静脉注入1%肝素（0.05ml/100g）后，切开胸腹部皮肤，用剪刀横行剪开腹腔，向上剪断隔膜，沿两侧肋骨向上平行剪开，翻起前胸壁，把心脏及胸膈周围的结缔组织拨到一侧，充分暴露心脏。 (3) 用镊子提起心脏根部，暴露出主动脉和肺动脉，在距主动脉起始部0.5cm处用手术剪切断血管，迅速取出心脏至于4℃生理盐水平皿中使之停搏。 (4) 经主动脉将心脏悬挂在灌流装置上，用丝线结扎固定，打开灌流液行逆向灌流，待心脏恢复自主跳动，小心减去心脏周围附着组织。 (5)用眼科剪剪去左心耳，通过左心耳经房室瓣插入左心室一乳胶球囊，球囊连接一个内充生理盐水的导管，导管经三通管和换能器与BL-420F连接。 (6) 在BL-420F仪的监测下，通过向球囊内注入一定量的生理盐水是左心室的舒张末压调整在0~10mmHg之间。 (7)连接心电导线，心尖、右心耳和地线，一通道设置记录， (8) 预灌流10~20分钟，观察心率，二通道记录心室内压、三通道取微分记录±dp/dtmax 等心动指标，同时描记ECG，待上述各指标平衡后开始以下实验。 心肌缺血-再灌注损伤 (1) 心脏用正常灌流液预灌流15分钟后完全停灌40分钟，然后恢复灌流20分钟，观察心脏在正常，停灌初期和再灌期的心功能变化。 (2) 分别收集正常灌流时，再灌流后3分钟时的心脏冠脉流出液1ml，测定其中乳酸脱氢酶的活性。 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤第一作者：XXX 学号专业 第二作者：XXX 学号专业 单位：南方医科大学第二临床医学院 地址：广州市广州大道北1838号 [摘要]尿生成包括肾小球的滤过作用、肾小管与集合管的重吸收和分泌作用。影响肾小球滤过的因素包括滤过膜的面积和通透性、有效滤过压、肾小球毛细血管压、血浆胶体渗透压、肾小囊内压、肾血流量（自身调节）。影响肾小管与集合管的重吸收和分泌作用包括小管液中溶质的浓度、肾小球滤过率（管球平衡）、影响肾小管上皮细胞对水对通透性和离子的重吸收作用的体液因子和药物。 [关键词]尿生成肾缺血再灌注 肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。 1材料与实验动物 主要试剂20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，蒸馏水，速尿剂，肌酐测定试剂（含试剂一、试剂三、试剂四）。 仪器医用计算机记录系统（PcLab）及计算机，家兔手术台，哺乳动物手术器械，动脉 静脉输尿管插管，压力换能器，三通管，注射器，兔绳，纱布，剪刀，分光光度计，恒温水浴箱，试管，微量加样枪带枪头，称重称。
实验动物家兔一只，体重2.4kg，由南方医科大学提供 实验前准备 家兔称重2.4kg，用20%乌拉坦12.0ml耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部备皮，沿甲状软骨下正中剪开皮肤，分离右侧颈总静脉并从右侧颈总静脉插入静脉导管。动脉插管用肝素充盈，分离左侧颈总动脉并左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录平均动脉压ABP。家兔耻骨下联合备皮后沿前正中线剪开皮肤，找到输尿管并进行输尿管插管并用有刻度的试管收集尿液。 实验方法 研究尿生成过程影响因素：静脉推注37℃，30ml生理盐水，用有刻度的试管收 集尿液并计算注射后每分钟尿量（ml/分钟）；一段时间后静脉输入37℃，10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。收集的尿液待测尿肌酐含量。 肾缺血再灌注损伤的实验：将家兔换成右侧卧位，游离左肾动脉，用动脉夹夹 闭，并观测平均动脉压和尿量变化，夹闭30min后观测平均动脉压和尿量变化。松开动脉夹，再灌注，同时静脉输入49ml 生理盐水加1ml速尿，再灌注30min后取尿测定尿肌酐浓度，记录平均动脉压和尿量变化。收集尿液待测尿肌酐含量。 尿肌酐测定方法： 取样：取尿液10μl与2ml蒸馏水按1：200比例稀释。 加样如下： 尿肌酐测定加Array 样量表
不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的 影响 作者：张晓丽夏世金严震文肖婧张振兴叶志斌 【摘要】目的探讨不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤（IRI）的影响及其机制。方法雄性C57BL/6N小鼠随机分为假手术组（sham组）、轻度低温IRI组（LTI）、常温IRI组（NTI）和高温IRI 组（HTI）。采用夹闭双侧肾蒂35 min再灌注48 h制成IRI模型。观察IRI小鼠肾脏组织病理学改变，检测肾功能、肾组织丙二醛（MDA）含量和肾小管上皮细胞凋亡数目。结果与Sham组相比，常温IRI组小鼠发生中等程度肾损伤，其Scr升高〔（237.0±41.2）μmol/L〕，肾组织形态学改变，肾组织中MDA含量升高〔（1.54±0.37）μmol·L-1·mg-1〕，肾小管上皮细胞凋亡数目增加。高温明显加重小鼠的IRI损伤（P＜0.05），轻度低温对小鼠IRI具有保护作用。结论缺血阶段体温的高低明显影响小鼠肾IRI的程度，轻度低温可能通过抑制脂质过氧化反应和细胞凋亡对小鼠发挥保护作用；高温则可能通过促进脂质过氧化反应和细胞凋亡加重肾IRI。 【关键词】高温；肾脏；缺血再灌注；凋亡 肾脏是一高灌注器官，对缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，IRI）异常敏感，故IRI成为急性
肾损伤的重要损伤环节〔1〕，也是影响肾移植中移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素〔2〕。鉴于肾IRI病理生理学机制复杂〔3〕，涉及此方面的研究一直走在移植学研究的前沿。肾IRI动物模型为急性缺血性肾损伤的发生机制和防治策略研究奠定了基础。制作肾IRI 动物模型的方法包括双侧肾蒂夹闭、双侧肾动脉夹闭、单侧肾切除+对侧肾动脉夹闭等。手术方法不同、血管夹闭的时间长短、手术操作过程中温度的控制均对实验结果有着重要影响，尤其是术中温度在此过程中起着不可忽视的作用。本文通过调控肾缺血过程中小鼠体温，观察不同温度对小鼠肾IRI的影响，以期为临床上辅助治疗IRI的新途径提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6N小鼠24只，22～26 g（SPF级，中科院上海实验动物中心），随机分假手术（Sham）组、轻度低温IRI组（LTI）、常温IRI组（NTI）和高温IRI组（HTI），每组6只。 1.2 模型制作 2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
人乙醛脱氢酶（ALDH)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中乙醛脱氢酶（ALDH)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人乙醛脱氢酶（ALDH)水平。用纯化的人乙醛脱氢酶（ALDH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙醛脱氢酶（ALDH)，再与HRP标记的乙醛脱氢酶（ALDH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙醛脱氢酶（ALDH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人乙醛脱氢酶（ALDH)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：90ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分
小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植、休克、动脉搭桥术后等普遍存在的问题。肾脏是发生IRI极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的IRI,肾脏缺血再灌损伤是急性肾衰的常见原因。对麻醉动物的肾动脉进行阻断和再通后，可引起肾脏缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基的增多等因素导致肾小管内皮细胞脱落，肾脏组织结构的破坏进而使肾脏功能发生障碍。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组，每组15只动物。 3.模型周期 24h、72h 4.建模方法 1. 选取20-22g左右小鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 3％戊巴比妥钠(80mg／kg)腹腔注射麻醉,小鼠背部去毛，消毒备皮。 3. 在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏,小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血45min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口,待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 5.模型的评价 1 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。
乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC0755 规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂40mg×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入3mL蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。 试剂三：液体0.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。 试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min。 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、操作表： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）40 蒸馏水（μL）10060 试剂一（μL）6060 试剂二（μL）2020 试剂三（μL）44 试剂四（μL）66 试剂五（μL）1010 在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱1min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定90s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、ALDH酶活计算 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。 ALDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Crp）÷T=804×△A÷Cpr （2）按样本质量计算
Journal of Physiology Studies 生理学研究, 2016, 4(3), 19-29 Published Online August 2016 in Hans. https://www.doczj.com/doc/ad12210011.html,/journal/jps https://www.doczj.com/doc/ad12210011.html,/10.12677/jps.2016.43003 文章引用: 王翔宇, 马云波. 肾脏缺血再灌注损伤机制及其影响因素的研究进展[J]. 生理学研究, 2016, 4(3): 19-29. The Research Progress of Kidney Ischemia-Reperfusion Injury on Mechanism and Its Influencing Factors Xiangyu Wang, Yunbo Ma Department of Urology, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng Shandong Received: Nov. 14th , 2016; accepted: Dec. 24th , 2016; published: Dec. 27th , 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/ad12210011.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when the blood flow to the particular organ is ob-structed, followed by the restoration of blood to the ischemic organ. In the kidney, IRI contributes to pathological conditions called acute kidney injury (AKI) that is a clinical syndrome with rapid kidney dysfunction and high mortality rates. Although the pathophysiology of IRI is very compli-cated and is not completely understood, several important mechanisms resulting in kidney failure have been mentioned. IRI usually is associated with an inflammatory reaction, oxidative stress, intracellular Ca 2+ overload, renin-angiotensin activation and microcirculation disturbance. Better understanding of the cellular pathophysiological mechanisms underlying kidney injury will hope- fully result in the design of more targeted therapies to prevent and treat the injury. In this review, we summarize some important potential mechanisms and therapeutic approaches in renal IRI. Keywords Ischemia-Reperfusion Injury, Kidney Injury, Free Radical, Ca 2+ Overload, Inflammation 肾脏缺血再灌注损伤机制及其影响因素的研究进展 王翔宇，马云波 Open Access
1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研 究进展
医学院检验系，广东广州510182;2.广州医学院第一附属医院，广东广州510120) 【关键词】全脑缺血再灌注动物模型实验研究进展 心脏骤停(CA)是急诊医学常见的急症之一，因其居高不下的致死率及致残率给社会和家庭造成严重威胁，所以心肺脑复苏是现代医学研究的热点课题。心搏骤停是指心跳及呼吸突然停止，血液循环终止。由于脑细胞对缺氧十分敏感，循环停止4～6 min脑组织即可出现不可逆性损害[1]。面对突如其来的心脏骤停，目前最有效的治疗方法是心肺复苏。但是即使复苏后，心脏恢复了搏动，但脑功能的恢复是心肺复苏成功的关键。一般心脏停止搏动，脑缺血、缺氧立即发生，如超过4～6 min就可以出现不可逆的大脑损害。心脏停搏时间长，如>8 min以上，大脑功能很难恢复，成功率极小。有学者研究认为，心脏停搏后，约50%左右患者死于中枢神经系统损害，即脑死亡。即使心、肺复苏成功，生命保留，仍约有20%～50%左右存在着不同程度的脑功能障碍，成为植物状态(植物人)或痴残等[2]。 在成功进行心肺复苏后有20%～40%的患者遗留下永久性神经损害[3]。鉴于脑保护和脑复苏的重要性，近年来对缺血性脑损伤的机制进行了大量的研究，脑是一个血流量大、代谢旺盛的器官，其功能几乎全靠葡萄糖的氧化代谢。心脏骤停后引起的脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血再灌注损伤，其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋亡等机制[4]。所以心肺复苏的最终目的是脑复苏。 大量研究旨在寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物，并且已经在动物模型上获得一定成功，但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注可预期的情况。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法，然而再灌注也可能加重损伤。在再灌注早期，大量活性氧自由基的产生和钙超载导致了缺血再灌注损伤。所以近年来围绕心肺脑复苏的保护机制及其方法成为专家学者们研究的热门，而建立有效、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有多种，包括：二血管阻断加低血压法、四血管阻断法、三血管阻断法、颈动脉负压分流法。国内文献报道用四血管阻断法比较多[5]，国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道，但更偏向于后者[6]。对比不同建模方法在实验过程中所显露出的特性，分析并总结各自的优缺点。选择能较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型的方法，为脑复苏的深入研究提供良好的实验基础。本文将从实验的可操作性、成功率、发展前景等方面对各类建模方法进行综述。 1制作全脑缺血再灌注动物模型及效果的判定 1.1全脑缺血再灌注模型模拟心搏骤停
货号：MS1009 规格：100管/96样乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 乙醛脱氢酶 (EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。主要作用是将乙醛氧化成乙酸，在酒精代谢中起主要作用。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 测定原理： 在辅酶Ⅰ存在的条件下，乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，在340nm处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体1mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。 试剂五：液体1mL×1支，4℃保存。 ALDH提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min。 2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细 胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.液体：直接检测。 测定操作表： 1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm。 2、操作表 第1页，共2页
肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明 ?原型物种人 ?来源缺血再灌注，双侧肾动脉夹闭法 ?模式动物品系SD大鼠，SPF级，雄性，体重220g~250g ?实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组，15只每组 ?实验周期24h or 72h ?建模方法1. 选取250g左右大鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 15％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉,大鼠背部去毛，消毒备 皮。 3. 在背部脊椎旁1cm、肋骨下缘1cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲 养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻 醉大鼠，下腔静脉取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 ?应用疾病模型
1. 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。 2. 肾系数检测 摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。 肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g） 3. 肾小管坏死的评分 每张切片×200 倍镜下取外髓质部10 个视野，按0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%) ，2= 轻度损伤(受损肾小管5 %～25 %) ，3 = 中度损伤(受损肾小管25 %～75 %) ，4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数 4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。 对照组大鼠肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。在模型组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究 马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1 （1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；） 摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。 ②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。 关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法 Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1 (1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious. Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture 脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。早在1986年，日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1995年，我国也出现了相关的报道。目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。国内一些学者对此方法又进行了改进，但仍存在一些问题，例如：手术操作过程复杂，实验动物死亡率较高，而模型成功率较低，并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点，就是对该模型的制作过程描述得过于简单，读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。本文旨在前人研究的基础上，建立一种操作简单，成功率高的 MCAO再灌注模型，并将此方法图文并茂的展现给读者，使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。 1 材料与方法 1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体重280-320g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为模型组和假手术组，每组20只。四氮唑红(TTC)染料，由沈阳市博尔美试剂公司提供。 1.2 栓塞线的制备栓塞线采用 2.5号钓鱼线，直径0.25-0.28mm。将其剪成4cm长，一端用细砂纸打磨成半球形（需在显微镜下筛选），再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm
利用耐高温乙醇氧化酶清除人体内的酒精 葛莘 随着生活水平的提高，人们消费酒精类饮料的数量也越来越大。科学研究及统计分析表明，酒精产品对人们的身体健康、家庭生活和社会活动都有诸多负面影响。在美国，平均每年有九千万人次急诊病患与饮酒有关，每年有一千人死于饮酒过量。据2000年10月14日《大连日报》报道，中国的酒精依赖患病率在过去十年中增长了近五倍，由0.12％增加到0.68％，其中因酒精中毒死亡者增长了10倍。流行病学研究也证实，在精神病院中，近年来因酒精中毒或酒精中毒障碍住院的病人明显上升。如吉林省延边地区，该比例从1964-1979年平均0%-4%上升至1979-1985年的8.0%-23.5% (沈渔邨，1987，1996)。 酒精对人体的危害 酒精对人体有害，对肝脏最为严重,胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等也会造成不同程度的损害。因此,世界卫生组织(WHO)在一份报告中提出: “酒精中毒是当今世界世界内第一公害,其毒性可累及全身主要脏器,对肝脏的影响最大。在西方国家， 80%肝硬变(liver cirrhosis)的原因是酒精中毒。酒精中毒对病毒性肝炎、肝癌的发生、发展及预后都有着重要影响。” 酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化，最终可演变为肝癌。在欧洲，饮酒量越高的国家，因肝硬化而导致的死亡率越高。比如，瑞典、丹麦、和英国等国家的人均年饮酒量在10升以下，他们的肝硬化死亡率在万分之十以下；而法国的人均年饮酒量高达27升，他们的肝硬化死亡率是上述国家的三倍。近年来随着生活水平的提高，酒精性肝病在我国也达到了不容忽视的程度。据统计，我国11亿中的酒民三亿多人，共中酒精性肝病的发病率在20%左右。由于肝脏的代偿能力极强，疾病早期一般没有症状或某些单一的症状不足以引起注意，因此，就诊时往往到了比较严重的程度，甚至到了肝脏的失代偿期。在肝硬化阶段，如果不积极治疗，继续酗酒的话,患者在2-4年内的存活率极低。 酒精的毒害主要来自乙醛 科学家早就证明，乙醛的毒性是乙醇的十倍，所以乙醛是导致酒后症状的主要化学物质(Brien and Loomis, 1983)。乙醛对大脑内胺代谢、ATP酶，细胞线粒体的呼吸功能、脂肪酸氧化功能，以及心肌蛋白质的合成都有很强的抑制作用。乙醛化学性质活泼，与儿茶酚胺结合能够形成吗啡类似物，是造成酒瘾的主要化学物质；乙醛使羟色胺代谢发生故障，产生有幻觉作用的四氢- -咔啉，造成酒后的种种精神障碍(Cunningham and Bailey, 2001; Eriksson, 2001)。 医学界也早就知道过分喝酒可能导致与上消化道有关的癌症。但是，科学试验证明，酒精本身并不致癌。那么，饮酒与上消化道癌的关系是怎么建立起来的呢？ 越来越多的研究表明，酒精的第一个代谢产物，乙醛，可能是致癌的凶手(Homann et al., 2000)。一项国际研究工作发现，族群中基因的一个主要区别可能导致唾液具有更高的致癌可能性(Vakevainen et al., 2000) 。这篇研究报告说，酒精一旦进入了身体，肝脏便开始通过代谢反应来清除毒物。研究显示，大约50%的日本人和华人的酒精代谢酶系统出现故障，使其中间产物乙醛快速、大量积累。因此，他们喝了酒会更容易出现脸红、晕眩、作呕等征兆。对这些人来说，他们的唾液中的乙醛含量要比含有健全酶系统的人高出两倍至三倍。科学家相信，乙醛随着唾液经过喉咙组织时可能导致癌症。此外，科学家也说，口腔内的细菌也可能具有把酒