西南交通大学
硕士学位论文
SAAT法介导铁皮石斛遗传转化及NAC启动子的克隆与载体构建
姓名：尤超
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：王万军
20110515
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。 （这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。） 其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字，命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补，因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence（GCCACC）, Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境， 避免 ribosome 出现 leaky scan ） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细 胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector ）。2. 载体的分类 按功能分成：（ 1）克隆载体 : 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（ 1 ）原核载体（ 2）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ）指在两种宿 主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中，质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 （一）质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA （ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性： ? 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。
一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃
第4章 人工染色体载体
黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性
载体
黏粒 P1 PAC BAC YAC
容量（kb） 复制子
30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS
宿主
拷贝数
重组DNA导入 宿主的方式
转导 转导 电转化 电转化 转化
筛选标记
— sacB sacB α-互补 ade2
克隆DNA 获取方法 碱抽提
大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1
脉冲场电 泳
1
4.1 黏粒载体
4.1.1 黏粒的结构特征和用途
o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。 o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。 o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理
图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤
2
4.1.3 黏粒克隆载体
1．黏粒pJB8
o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体
o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。 o 装载容量3346.5kb
图4-3 黏粒载体c2RB图谱
3
一部分：概念解析 二部分：问题解答 克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs
为什么要先构建克隆载体再用表达载体 构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。 为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为： ①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。 先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。 很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。 先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。 怎么构建克隆载体和表达载体？ 首先根据你的实验需要选择相应的载体。 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
.克隆载体及其主要功能 载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。 质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。 在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。 和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。 3.重组克隆筛选 3.1.抗性基因插入失活筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。 3.2. 蓝白斑筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基
第四章克隆策略与体外重组 一、填空题 1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—； (2)第二层涵义是—----------------—； (3)第三层涵义就是-------------------- 。 2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)—-----------------—(2)——------------------ (3)—------------------—。 3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。 4．受体细胞的感受态是—--------------—。 5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------— (3)————————————（4)—--------------------—。 6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。 7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。 8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。 10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。 11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。 12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。 14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 （4） P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。
分子克隆质粒载体去磷酸化实验方法步骤 对单酶切后的产物去磷酸化是指5…端的磷酸基团，（3?端是-OH）。 用CIAP去磷酸化，它能将5…端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不 能形成闭合的环状结构。 单酶切的末端能够发生载体自连。 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，简称CIAP，中文名称为小牛肠碱性磷酸酶，是一种可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′末端或3′末端磷酸基团的酶。Calf Intestinal Alkaline Phosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。 经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒发生自连，可以使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase去除5'末端磷酸基团。脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。 用途：去除DNA、RNA 5′或3′末端的磷酸基团；通过去除载体或DNA片断5′末端的磷酸基团，防止载体或DNA片断自连；通过5′末端脱磷，为5′末端磷酸化放射性标记准备模板；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。 载体单酶切过夜，然后65度失活，直接加CIAP去磷酸化后，建议用酚、氯仿抽提或者用胶回收后做连接，因为CIAP去磷酸化酶在螯合剂存在下，经65度30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有外），用胶回收可以除去酶蛋白。最好做个对照，检验你的去磷酸化是否成功。 -------------------------------------------------------------------------------- 前些天才做完载体单酶切连接，现将自己的经验介绍如下： 1. 载体单酶切三个小时足以，时间长并不一定好。 2. 如果不需要连接效率的话，可以不用去磷酸化，但载体单酶切纯化后最好马上与你新制备的具相同粘末端的目的片段进行连接反应，也就是说一定要保 持单酶切后的载体与目的片段的“新鲜”。 3. 载体和目的片段单酶切后建议直接用柱纯化，我用的promega的柱，回 收率很高。我的目的片段2KB，载体13KB。 4. 连接反应目的片段与载体的摩尔比要高，最好10-20:1，因为单酶切后的载体与目的片段具有相同的粘末端容易出现自连，过量的目的段可以促进两者的 反应，有利于出现重组子。 5. 我的单酶切的载体没有去磷酸化，单酶切目的片段也没有磷酸化，4度 24小时连接，挑24个单菌落有3个重组子。 分子克隆载 通常在基因工程中选作载体的有： ①质粒——环状双链小型DNA 分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti 质粒常用作植物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派生
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎ 实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 ※ 基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化— 涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。