目的基因的克隆
摘要
基因克隆是经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。本实验以水稻基因为模板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，用SacI、KpnI将片段进行双酶切，与pUC18载体连接获得重组子，将其转化到大肠杆菌感受态细胞中并提质粒酶切验证进行筛选鉴定。
关键词：基因克隆；扩增；连接；转化；酶切
1 引言
蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物细胞感受各种环境信号及其信号传导与放大过程中起着重要作用，其中促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的作用受到广泛重视。本实验旨在筛选并鉴定出水稻MAPK的阳性克隆。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 试剂和缓冲液
Tag酶，10×PCR Buffer，dNTPs，引物，模板，琼脂糖，溴酚蓝，TE，TAE，EB，
DNA marker，质粒，SacI，KpnI，无菌水，乙醇，NaAc，T
4 连接酶，E.coli，CaCl
2
（灭
菌），LB固液体培养基，氨苄青霉素（Amp），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，70%乙醇。
2.1.2 仪器耗材
PCR仪，掌上离心机，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，移液枪一套，微波炉，水浴锅，灭菌锅，Tip，eppendorf管，控温摇床(37℃)，冷冻离心机，冰箱（-20℃、‐70℃），超净工作台，培养箱(37℃)，分光光度计，三角瓶，6cm平皿，酒精灯，三角玻棒，酒精棉球，火柴，制冰机，试管，培养皿，试剂瓶，超净工作台。
2.2 实验方法
2.2.1 目的基因的获得
按如下反应体系加入下列各成分：
模板DNA （5ng/μL ） 0.5 μL Primer1 0.3 μL Primer2 0.3 μL 10×PCR buffer 1.5 μL dNTPs （2.5mmol/L ） 1.2 μL Taq 酶 (5U/μL ) 0.3 μL ddH2O
10.9 μL
总体积为15μL ，混匀后，加入10μL 石蜡油覆盖，然后按以下程序进行扩增：
94℃ 2 min 94℃ 0.5 min 60℃ 0.5 min 72℃ 1 min 72℃ 8 min 4℃
hold
反应结束后取出PCR 反应管，纯化PCR 产物（将PCR 产物加入H 2O 补足体积至100μL ，然后加入1/10体积的3mol/L 的NaAc （pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀DNA 。12000 rpm/min 4℃ 离心15min ，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加10 μLddH 2O 溶解）的同时用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物(取PCR 产物2μL 与上样缓冲液混合，点样)，电泳结束后，溴化乙锭染色5-10分钟，用凝胶成像仪观察、拍照。 2.2.2 载体和目的片段的酶切 2.2.2.1 载体和外源DNA 的酶切
按如下反应体系加入下列各成分： 反应体系1
质粒（20ng /μL ） 2 μL buffer 5 μL SacI (10U/μL ) 0.5 μL KpnI (10U/μL )
0.5 μL
28 cycles
ddH2O 42 μL
反应体系2
PCR产物（50ng/μL）10 μL
buffer 10 μL
SacI (10U/μL) 0.5 μL
KpnI (10U/μL) 0.5 μL
ddH2O 79 μL
37℃酶切2至4个小时，65℃，10分钟终止反应。
2.2.2.2 电泳检测
取10μL质粒载体酶解液，电泳检测。PCR产物酶切后不必电泳检测，直接回收即可。
2.2.2.3 酶切片段的纯化及回收
将酶解液加入H2O补足体积至100μL，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc （pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀DNA。12000 rpm/min 4℃离心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加4 μLddH2O溶解。
2.2.3 DNA重组技术
质粒酶切产物 4
PCR酶切产物 4
T4 ligase 1
10×bf 1
H2O 3
-------------------------------
Total 10 μL
16℃连接4-5h。
2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
2.2.4.1 感受态细胞制备
1. 第一天：从大肠杆菌TOP10平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 第二天：取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养。2-3 h，测定OD600 ≤ 0.4-0.5，细胞数务必≤108／mL。（此为实验成功的关键)
3. 将菌液转移到50 mL离心管中，冰上放置10 min。
4. 离心10 min，4000r/min，4℃，倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽，回收细胞。
5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 10 mL悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。
6. 4℃ 6000 r/min，离心10 min，回收细胞。
7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2 mL悬浮细胞，务必放在冰上。此细胞为感受态细胞。
8. 分装，每管200 μL。可以加入15%甘油-70度保存。
2.2.4.2 质粒转化
1. 取200 μL新鲜制备的感受态细胞，加入连接产物10μL（~50 ng ）混匀冰上放置30 min。
同时作2个对照管：
对照1：200 μL感受态细胞＋10μL无菌水（不含氨苄皿）
对照2：200 μL 感受态细胞＋1μL 标准质粒DNA溶液（50ng/μL）
2. 将管放到42℃循环水浴90-120sec。
3. 冰浴2 min。（提前准备好）
4. 每管加600 μL LB液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。
5. 将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。注意对照2离心后涂10-50μL。（提前倒好平板）
6. 倒置平皿37℃培养12-16 h，出现菌落。
7. 计算阳性对照的转化效率，记录样品的转化子总数。
2.2.5 重组克隆的筛选与鉴定
1. 从实验四获得的平板上，挑取单克隆，加入含有3mL LB+Amp100的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。
注：剩余培养物放置4℃，用于保菌。
3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100 μL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5 min。
5. 加200 μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰
上5 min 。
6. 加入150 μL 溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min 。
7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。350μL
8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min ，离心10 min ，将上清转移到另一离心管中。该步骤可以不做。
9. 向上清加入2倍体积乙醇700μL ，混匀后，室温放置15-30min 。10000r/min 离心10 min 。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10. 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA 沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11. 加入适量（20-50 μL ）的无菌水，室温使DNA 完全溶解，-20℃保存。 12. 取2μL 质粒进行双酶切，酶切体系如下：10×bf 2μL ，限制酶各0.5μL ，H 2O 15μL 。37度，2-4hr 。
13. 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
3 结果与分析
3.1 PCR 扩增产物检测结果
以水稻DNA 为模板，经PCR 扩增和电泳检测，获得大小约1.0 kb 的特异性片段（图1），与目标基因的片段大小（1059bp ）相吻合。
3.2 质粒酶切检测结果
将质粒载体pUC18进行双酶切，电泳检测，获得大小约4.5kb 的片段（图2），结果正确可以进行连接。
图1 PCR 产物电泳图
1000 bp
13
M
13 M
3.3 转化子总数和转化频率
将连接产物转化到感受态细胞中，13组含氨苄的平板上转化数为40个。依据两组对照计算转化子总数和转化频率：
转化子总数=菌落数×稀释倍数（转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积）=7.7×104
转化频率（转化子个数/每ug 质粒DNA ）= 对照2转化子总数 / 质粒DNA 加入量（ug ）=60×转化数/10×10-3=60×8/10-2=4.8×104
3.4 酶切验证检测结果
重组子经单酶切后片段大小应为5.5kb 左右，可本组电泳检测却显示重组子单酶切片段与质粒单酶切片段大小一致（图3），推测失败可能原因是目的片段与质粒载体连接时出现问题，转入大肠杆菌的是自连的质粒；但是其它做双酶切组挑取的克隆是本组的单菌落，并且双酶切正确，所以还可能是酶切体系有问题。
4 讨论
基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、
图3 单酶切验证电泳图
5000 bp
Z
M
连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
近年来，植物中MAPK级联及其功能已有不少研究，分离鉴定了几十个编码MAPK 的基因，并发现大多数MAPK参与激素应答、环境胁迫反应以及植物抗病反应。在植物抗病反应的调控方面，发现MAPK可以参与抗病基因介导的抗病反应、过敏性反应中细胞死亡以及植物的先天性免疫性，并且证明拟南芥的MAPK级联MEKK1-MKK4/5-MPK3/6是先天性免疫抗病性所必需的。本实验利用已知引物扩增出水稻MAPK基因，对其在水稻生长发育以及抗逆性反应中的作用的研究打下基础。
5 结论
以水稻基因为模板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，计算转化子总数为7.7×104，转化频率为4.8×104，但最终酶切验证错误。
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/a89445834.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液 氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/a89445834.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/a89445834.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
疾病基因克隆的策略及主要方法 申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042） 摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。 关键词基因；定位克隆；消减杂交 学科分类号Q785 Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (C enter of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Milit ary Medical University, Chongqing 400042) Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome stu dy, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Tw o strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the obje ctive gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppressio n subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PC R), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), com parative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly. Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization 基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~10万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）： 目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星D NA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法 一、特值法： 先按照碱基比例假设DNA片段中碱基总数为100或200等整百数，再根据碱基互补配对原则（A－T，C－G）图解分析求解。 例：一个DNA分子中，G和C之和占全部碱基数的46％，又知在该DNA分子的一条链中，A和C分别占碱基数的28％和22％，则该DNA分子的另一条链中A和C分别占碱基数的（）。 A．28％、22％B．22％、28％C．23％、27％D．26％、24％ 【解析】假设DNA每条链的碱基数为100，依题意得：（图略） ∵甲链: A=28, C=22,G+C=46, ∴甲中G=24, T=100-28-46=26。则乙中A=26，C=24。故选D。 练习：分析某生物的双链DNA，发现腺嘌呤与胸腺嘧啶之和占全部碱基的64％，其中一条链上的腺嘌呤占该链全部碱基的30％，则对应链中腺嘌呤占整个DNA分子碱基的比例是（） A．17％B．32％C．34％D．50％
二、首尾法： 根据DNA复制的过程与特点可以知道：一DNA分子复制n次后，将得到2n个DNA分子，其中保留原来母链的DNA 数目为2个。在处理与此相关的计算题过程中，我们只需要考虑开始和结尾的差异就可以顺利求解，笔者习惯于称之为首尾法。 例：假如一个DNA分子含有1000个碱基对（P元素只是32P）,将这个DNA分子放在只含31P的脱氧核苷酸的培养液中让其复制两次,则子代DNA分子的相对分子量平均比原来( )。 A.减少1500 B.增加1500 C. 增加1000 D.减少1000 【解析】每个碱基对应一个脱氧核苷酸，含1个磷酸基，即1个磷原子。复制两次后形成4个DNA分子，8条单链。其中两条含32P，6条含31P，因而相对分子量减少6000，4 个DNA平均减少1500。故选A。 练习：已知14N-DNA和15N-DNA的相对分子量分别为a和b。现让一杂合DNA分子在含14N的培养基上连续繁殖两代，则其子代DNA的平均相对分子量为（） A.(3a+b)/4 B.(a+3b)/4 C.(7a+b)/8 D.(a+7b)/8 三、公式法： 基于DNA的半保留复制，我们可以归纳出公式：X=m(2n-1)。
第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。