化
工 进 展
·392·
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS
2012年第 31卷第 2期
进展与述评
微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展
张昕欣 1，吴翰桂
1
，奚立民
1，王玲萍 2
（1台州职业技术学院生物与化学工程系，浙江台州 318000；2浙江海正药业股份有限公司，浙江台州 318000） 摘 要：微生物发酵生产紫杉醇由于其环境友好、工艺简单、成本低廉的优势，近年来被认为是解决紫杉醇生 产原料来源危机的良好方法。由于单位发酵液中紫杉醇产量太低，迄今为止尚没有一株可以进行工业化生产的 产紫杉醇菌株问世。本文就微生物发酵法生产紫杉醇的研究现状进行了总结分析，主要包括紫杉醇产生菌的筛 选、发酵培养基的优化、微生物体内紫杉醇合成相关酶基因的克隆及产紫杉醇菌种的改良。 关键词：紫杉醇产生菌；培养基优化；菌种改良 中图分类号：Q 939.79
文献标志码：A
文章编号：1000–6613（2012）02–0392–05
Recent research and prospect on microbial producing taxol
ZHANG Xinxin 1，WU Hangui 1，XI Limin 1，WANG Lingping 2
（1 Departement of Biological and Chemical Engineering ，Taizhou Technical College ，Taizhou 318000，Zhejiang ，China
； 2
Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.，Taizhou 318000，Zhejiang ，China ）
Abstract ： F o r its environmentally acceptable ， r e latively simple and inexpensive features ，
microor-ganisms fermentation has been investigated as a potential alternatives to solve the crisis of raw material. No commercial fermentation strain has been used so far ，because of the low production. The aim of this study is to review and analysis the present status of research on paclitaxel-producing by microorganisms ，screening of paclitaxel-producing microorganisms ，optimization of the culture medium ，genes of the paclitaxel biosynthesis and improvement of the taxol-producing microorganisms. Key words ：taxol-producing microorganisms ；optimization of the culture medium ；improvement of strain
紫杉醇（taxol ）是在 20世纪 60年代早期从太 平洋紫杉中分离出来的一种二萜类生物碱（图 1）， 经研究发现其具有广泛的抗癌活性[1]。自 1993年第 一株产紫杉醇真菌被发现并报道后 [1]，微生物发酵 法生产紫杉醇逐渐被认为是一种环境友好、成本低 获得能够适用于发酵生产的工业菌株是实现 发酵生产紫杉醇的前提，但是目前已知的微生物生 产紫杉醇产量很低，不能够满足产业化生产要求（产 率高于 1 mg/L ）[4]，需要进行一系列的优化改良。 主要通过以下两个途径来解决：一是从自然界中继 续寻找更适合发酵的原始菌株；二是对现有的菌株 进行遗传改造，提高其发酵紫杉醇产率。目前报道 的产紫杉醇菌株主要是红豆杉内生菌 [5]，人工培养 时菌体往往生长缓慢，从而影响其最终紫杉醇的产 量；因此新菌株的筛选与现有菌株的遗传改造都需
廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的方法[2-3]
。
收稿日期：2011-08-03；修改稿日期：2011-09-16。 基金项目：台州市科技计划项目（092KY01）。
第一作者及联系人：张昕欣（1980—），女，讲师，主要从事微生物
药物方面的研究。E-mail zhangxinxinshx@https://www.doczj.com/doc/ad8185634.html, 。
图 1 紫杉醇的化学结构
第 2期 张昕欣等：微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展 ·393·
要进行更深入的研究。
因的部分编码序列被报道用做探针，检测菌株是否 具有合成紫杉醇的潜力[13-15]。Zhou [12]2007年报道， 分别以待检的 38株菌株的基因组序列为模板，利用 ts 基因特异性引物作 PCR 。经后续检测，PCR 结果 为阳性的 12株菌株中，有 3株为明显产紫杉醇的菌 1 紫杉醇产生菌的鉴定筛选
自从短叶红豆杉（ Taxus brevifolia ）中分离到
第一株产紫杉醇的内生真菌 Taxomyces andreanae 后[6-7]，至 2010年，已有近百株产紫杉醇的菌种被 分离鉴定出来，其中，超过 80%为真菌，其余为细 菌和放线菌[5]。据报道，除一株异角状拟盘多毛孢 （Pestalotia heterocornis ）采自红豆杉树林的泥土中 外[8]，其余菌株皆为采自红豆杉及其相近种属的植 物内生菌。经鉴定，这些已报道的产紫杉醇内生 真菌大都属于真菌中的子囊菌纲和半知菌纲 [5]。 在产紫杉醇菌种筛选过程中，除传统的分离菌种， 利用色谱、质谱、核磁共振等方法鉴定菌种产物 结构的工作外，还有酶联免疫法及分子探针法两 种高通量的筛选方法被引入了紫杉醇产生菌的初 筛鉴定中。 [13-15]的研究结果也 株。Miao 、Kumaran 、Zhang 等 [14]
利用 dbat 部
证实了这种方法的可行性。Miao 等 分序列作探针，确定了其课题组从中国红豆杉中获 得的几十株内生真菌中的 4株具有合成紫杉醇的能
[13]
力。2009年，Kumaran 等利用 TS 的基因中的保 守区部分序列作探针，对 3株高产紫杉醇真菌进行 检测，结果全部都呈阳性。该结果进一步证实了利 用 ts 的部分序列作探针，进行紫杉醇产生菌筛选的
[15]
可行性。Zhang 等利用 BAPT 和 DBAT 的部分编 码序列作探针，从近百株植物内生菌中筛选得到了 3株产紫杉醇的菌株。Zhang 称，dbat 、bapt 作为探 针所获的菌株初筛结果将更为准确可靠。由于此种 方法是对待筛菌株的紫杉醇合成途径中相关酶类 的基因进行检测，得到的结果只能作为菌株是否 能够产生紫杉醇的依据；因此更适用于原始采集株 的初筛，不适用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株 的筛选。
1.1 酶联免疫吸附法
20世纪 90年代已有抗紫杉醇抗体被纯化制备 的报道[9]，现今商业化的紫杉醇免疫试剂盒已在出 售。2000年，Caruso [10]利用此方法从 221株原始采 集株中获得了 15株产紫杉醇真菌、10株产紫杉醇 放线菌。经后续鉴定检测，这些菌株发酵液中紫杉 醇的含量在 10～100 ng/L 不等，可见这种利用含有 抗紫杉醇抗体的酶联免疫试剂盒来检测不同采集菌 种的液体培养基中紫杉醇的含量，以此来对原始采 集株进行初筛的方法具有较高的准确度和灵敏度。 此外，在树状多节孢（Nodulisporium sylviforme ） 原生质体诱变实验中发现：随着突变株对制霉菌素 抗性的提高，其紫杉醇产量也随着相应地提高，但 其机理并不清楚[16]
。因此推测，若已知某产紫杉醇
菌种体内某些抗生素抗性基因与紫杉醇合成某一相 关基因存在相互的调控影响，则该特性可被用于产 紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的初筛。
Li 等[11]
也有类似报道，利用特定的抗紫杉醇抗体，
对落羽杉（Taxodium distichum ）中分离得到的内生 菌培养物进行检测，筛选得到了紫杉醇产生菌。 鉴于其对菌株培养物中紫杉醇的含量具有较高的 灵敏度，酶联免疫吸附法既可用于原始采集株的初 筛，也可以用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的 筛选。
2产紫杉醇微生物的发酵培养基优化
目前关于真菌产紫杉醇发酵条件的研究报道 不是很多。可以肯定的是，由于植物内生真菌脱离 其宿主体后次生代谢会停止或延缓，因此在产紫杉 醇内生真菌的发酵液中加入红豆杉针叶提取物，可 以提高紫杉醇的产量[4]。另外，培养基中其它一些 影响紫杉醇代谢途径的物质的加入也会影响紫杉醇 的最终产量。
1.2 关键酶基因部分序列作分子探针
迄今已有紫杉二烯合成酶（taxadiene synthase ， TS ；其相应的编码基因 ts ）、3-氨基-3-苯基丙酰 转移酶（ C-13phenylpropanoylsidechain-CoA acyltransferase ，BAPT ；其相应的编码基因 bapt ）、 脱乙酰巴卡亭Ⅲ -10β-O 乙酰转移酶（ 10-deacetyl baccatinIII-10-O -acetyltransferase ，DBAT ；其相应的 编码基因 dbat ）3种紫杉醇合成途径中的关键酶基
2.1 代谢途径的诱导物
提供紫杉醇代谢途径的诱导物可以帮助启动 紫杉醇的合成，提高其产量。例如，在小孢拟盘 多毛孢（Pestalotiopsis microspora ）发酵液中加入
·394· 化 工 进 展 2012年第 31卷
适当的 Mn 2+、Mg 2+、Zn 2+离子有助于紫杉醇的积 累[17]
。但是在不同菌株不同发酵条件的情况下， 由于大多产紫杉醇菌株为植物内生菌，因此某 些植物生长调节剂会对其产紫杉醇有一定的调节作 用。例如，植物光合作用促进剂氯化氯胆碱
（Chlorocholine chloride ，CCC ）对于内生真菌产紫 杉醇有抑制作用；而促进花芽形成的 N -二甲氨基琥 珀酸（N -dimethylamino succinic acid ）对其有提高产 微生物生理代谢所需营养物质会有很大不同，而 且紫杉醇的代谢途径会有所差异，所以这些添加 物的成分很难确定，具有针对性的研究还有待于 深入进行。
量的作用[6，20]
。
2.2 代谢合成的前体
研究产紫杉醇内生真菌的代谢机理和紫杉醇 的合成机制，进而找到其代谢合成的前体，并且将 这些前体有目的地加入紫杉醇发酵液中，能够进一 3微生物体内紫杉醇代谢途径相关基
因的克隆与应用
步提高其产量。根据 Eisenreich 等[18]
的研究，紫杉 紫杉醇的生物合成大约要经过 19个酶促反应 醇分子的双萜类母核合成所用的异戊二烯是由葡萄
糖的初级代谢产物磷酸丙糖与丙酮酸脱羧产物二碳 单位缩合进而分子内重排后产生的。因此，产紫杉 步骤[21-23]
。合成起始物为一种常见的二萜前体牛儿
基牦牛儿基焦磷酸（ geranylgeranyl diphosphate ， GGPP ），GGPP 经 TS 催化环化生成紫杉二烯 醇菌的发酵过程中应尽量地使用以葡萄糖为碳源的 [taxa-4(5),11(12)-diene][22-23] 。紫杉二烯经官能化反 培养基。Fleming 等[19]证实紫杉醇的 C 13侧链是由苯 应后生成 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ
（10-deacetyl-baccatinIII ），进而经过酰化酯化反应 丙氨酸 C 2位羟基化和氮原子的酰基化作用而形成， 故在发酵过程中，应考虑添加苯丙氨酸提高紫杉 醇的含量。
生成紫杉醇（图 1）[24-25]
。这些结论主要来自于对 2.3 竞争性代谢途径抑制剂
植物体内紫杉醇合成途径的研究，微生物相关的代 谢研究则较少。目前已报道从产紫杉醇微生物体内 克隆得到的紫杉醇代谢途径相关基因序列除紫杉二
烯合成酶的编码基因 ts 外，还有参与催化紫杉二烯 生成 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的 3-氨基-3-苯基丙酰转移 酶基因 bapt 以及参与催化巴卡亭Ⅲ生成紫杉醇的 脱乙酰巴卡亭Ⅲ-10 -O 乙酰转移酶基因 dbat ，具体 Li 等[20] 在研究小孢拟盘多毛孢发酵生产紫杉 醇时发现，麦角固醇的合成会竞争紫杉醇合成的前 体，进而证实小孢拟盘多毛孢发酵液中如果有甾醇 类物质合成途径的抑制剂的加入，会提高紫杉醇的 积累量。其中，以戊唑醇和三唑酮的效果最为明显， 分别可以将紫杉醇的积累量提高 50倍和 25倍，但 由于二者在发酵液中的存在会影响小孢拟盘多毛孢 菌丝体的生长，所以在发酵开始 8～10天后加入效 果最佳。由此可见，寻找产紫杉醇菌株体内与紫杉 醇合成存在竞争关系的物质合成途径，并对其加以 抑制，则可以显著提高紫杉醇的发酵产率。
情况如表 1所示[12-14，26-29]
。
4改良产紫杉醇菌种的方法与应用
通过利用各种生物工程技术，对产生紫杉醇的 菌株进行遗传改造，进而构建高产紫杉醇内生真菌
表 1 微生物体内紫杉醇合成相关途径基因序列
基因 来源 序列大小、完整性 植物寄主
ts
鲁氏毛霉 （Mucor rouxianus ）
枝状枝孢酶
632 bp ，部分序列
中国红豆杉（Taxus chinensis ）
dbat dbat
bapt
1546 bp ，完整序列
1545 bp ，完整序列
未知
曼地亚红豆杉（Taxus media ）
曼地亚红豆杉（Taxus media ）
短叶红豆杉（Taxus brevifolia ）
（Cladosporium cladosporioides ）
亮白曲霉
（Aspergillus candidus ）
安氏紫杉菌 （Taxomyces andreanae ）
第 2期 张昕欣等：微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展 ·395·
的工程菌株，是微生物发酵法生产紫杉醇可以工业
化应用的主要途径。目前已有原生质体诱变技术、
基因改组技术（gene shuffling ）、相关酶基因的异源 表达等方法被应用。
些早期研究结果虽然只获得了具有体外催化活性的 相关酶蛋白，但为后续的紫杉醇合成相关酶类的异 源宿主体内表达提供了一定基础。
2001年，Huang 等[35] 的研究表明，在大肠杆菌 中同时表达红豆杉的异戊烯二磷酸异构酶 （isopentenyl diphosphate isomerase ）GGPP 合成酶、 TS 会有紫杉二烯产生，产量可达到每升发酵液 1.3 mg 。由此，证实了在不产生紫杉醇的异源宿主中表 达、生产紫杉醇的可行性。另有报道在酿酒酵母中
同时表达来源于中国红豆杉和嗜酸热硫化叶菌
（Sulfolobus acidocaldarius ）的紫杉醇合成相关途径
4.1 原生质体诱变
微生物诱变育种目前仍是发酵工业的菌种选
育的主要办法，国内外发酵工业中采用的各种生产
菌大多是诱变所得。对产紫杉醇的内生真菌进行原
生质体诱变，也是获得可能的工业化紫杉醇生产菌
株的一个主要办法。例如，赵凯等[16] 报道：对紫杉
醇产生菌树状多节孢的原生质体进行了紫外线和氯
化锂复合诱变，其紫杉醇产量从出发菌株的 314.07 g/L 提高至 418.24 g/L 。
酶类基因，紫杉醇产量可达到 8700 ng/L [36]
；在酿酒 酵母中表达来源于安氏紫杉菌紫杉醇合成相关途径 酶类基因，紫杉醇产量为 1000 ng/L [26]
。由此可见，
4.2 基因改组技术
虽然异源表达紫杉醇的产量很低，远不能满足生产 要求，但是用于异源表达的宿主大肠杆菌与酿酒酵
母大规模工业发酵生产条件发展成熟，在实际工业
生产中将比植物内生菌更易操作控制，因此不应因
为其现阶段产量不理想而放弃相关研究。
产紫杉醇菌种诱变改良后，为获得更高产量菌
株，可采用基因改组技术（gene shuffling ）对诱变
的正向突变株的原生质体进行融合、重组，进行进
一步的菌种优化改良[30]。2005年，Zhao 等[31]
利用 随机扩增多态性 DNA 标记法（random amplified
polymorphic DNA ，RAPD ）对诱变而得的两株紫杉 醇高产株及其相应的母本进行分析，结果发现诱变
株与其母本之间的紫杉醇合成相关基因的差异十分
明显。由此可见，利用基因改组技术对紫杉醇产生
菌进行提高产量的优化改良是切实可行的。
5 结语 利用微生物生产紫杉醇具有如下优点：生长速 率较高，生产周期短；培养基构成简单，培养条件 容易达到，易于降低成本；规模化发酵生产技术比 较成熟。但是从目前研究水平来看，紫杉醇微生物
发酵的产量仍然远低于商业化生产的要求。因此，
筛选高产菌株与提高紫杉醇发酵产率的工作今后仍
要进行一段相当长的时间，具体有以下几方面的工
作：①分离筛选新的紫杉醇产生菌；②紫杉醇产生
菌的遗传和生理代谢特点的摸索；③针对微生物合 成紫杉醇的代谢途径的研究，为进行紫杉醇合成的 代谢调控提供必要前提，尤其可提高紫杉醇产量的 前体物、诱导物及支路代谢抑制剂的筛选；④关键 酶基因的克隆表达及紫杉醇产生菌的遗传转化系统 的确立，为构建高产基因工程菌株打下基础。 由于产紫杉醇的微生物菌株多为植物内生菌， 大多数在发酵培养过程中生长状况不理想，因此， 构建高产工程菌株是实现紫杉醇的微生物发酵法 生产的关键。除文中所述的原生质体诱变、基因
改组两种方法外，构建成熟的针对某紫杉醇产生 菌的遗传转化系统，进行基于紫杉醇代谢途径的 定向遗传改造的方法，也应得到相关研究人员足 够的重视。 Zhao [32] 对树状多节孢的不同诱变株进一步进行融
合与基因改组，将紫杉醇的产量在原有基础上又提
高了 48%左右。
4.3 异源表达 在其它微生物宿主体内进行紫杉醇的全合成 也是一条将微生物发酵生产紫杉醇的工业化的途 径。目前已应用于该研究中的微生物宿主有大肠杆 菌（Escherichia coli ）和酿酒酵母（ Saccharomyce scerevisiae ）两种。早在 1996年，Wildung 等[33]
将
太平洋红豆杉的紫杉醇合成相关基因在大肠杆菌中 进行表达，检验证实，所表达的蛋白具有催化 GGPP 生成紫杉二烯的活性。经搜索比对，该蛋白的氨基 酸序列与植物中萜类化合物代谢相关酶类具有较高 的相似性。两年后，Hefner 等[34] 将加拿大红豆杉中 的 GGPP 合成相关酶类基因在酵母中进行表达，也
获得了成功。与 Hefner 同时，Huang 等[35]将 TS 的
cDNA 序列在大肠杆菌中进行异源表达，所得的重
组酶经纯化检测，发现其与植物中表达的 TS 酶类
结构相似度很高，且具有相同的体外催化活性。这
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食品微生物学 1、具有菌丝体的原核微生物是（B ） A、细菌 B、放线菌 C、酵母菌 D、霉菌 2、病毒的主要繁殖方式是（B ） A、裂殖 B、复制 C、芽殖 D、接合生殖 3、细菌细胞壁的主要成分是（A ） A、肽聚糖 B、甘露聚糖 C、几丁质 D、果胶 4、下列结构中，属于细菌运动器官的是（A ） A、鞭毛 B、荚膜 C、芽胞 D、纤毛 5、下列微生物中，能在血平板上产生溶解圈的是（C ） A、肉毒杆菌 B、伤寒沙门氏菌 C、金黄色葡萄球菌 D、粪链球菌 6、霉菌接种时，通常采用的接种方法是（B ） A、倾注法 B、点植法 C、划线法 D、涂布法 7、下列杀菌方法中，不属于冷杀菌的是（C ） A、超声波 B、紫外线 C、R-射线 D、红外线 8、某苹果罐头，因真空度不足出现胖听现象，下列腐败微生物中最有可能的是（B ） A、嗜热脂肪芽孢杆菌 B、纯黄丝衣霉 C、嗜热解糖梭状芽孢杆菌 D、致黑梭状芽孢杆菌 9、冰冻过程中，下列不同的温度范围，杀菌效果最好的是（B ） A、0～＋3℃ B、－1～－3℃ C、－10～13℃ D、－10～－20℃ 10、食品根据PH值的范围特点，以PH值4。5作为酸生食品与非酸性食品的分界线，其主要决定于（D ）的生活习性。 A、伤寒沙门氏菌 B、嗜热脂肪芽孢杆菌 C、致黑梭状芽孢杆菌 D、肉毒杆菌 11、不同种类的细菌，革兰氏染色后呈现不同的颜色，其主要是由于（A ）结构不同。 A、细胞壁 B、细胞质 C、细胞膜 D、荚膜 36、下列微生物中，不能在人工合成培养基上生长的是（C ） A、细菌 B、放线菌 C、病毒 D、酵母菌 37、自然界中微生物数量最多的地方是（C ） A、田野上空的空气 B、河流 C、土壤 D、海洋 38、霉菌接种时，通常采用的方法是（B ） A、倾注法 B、点植法 C、划线法 D、涂布法 6 39、下列属于化能异养型的微生物是（C ） A、绿硫细菌 B、氢细菌 C、青霉菌 D、蓝藻 40、在微生物实验操作中，防止微生物进入培养物的方法叫（D ）。 A、灭菌 B、无菌 C、消毒 D、无菌技术 41下列哪些微生物，产生的抗生素种类最多（B ） A、细菌 B、放线菌 C、霉菌 D、病素 44.细菌细胞的哪一部分结构与其抗原性相关？ab a. 鞭毛 b. 荚膜 c. 芽孢 d. 液泡d. 菌体体积减小 20下列微生物中，_____属于革兰氏阴性菌。 a. 沙门氏菌 b. 溶血性链球菌 c. 巨大芽孢杆菌 d. 肺炎双球菌 22下列属于原核生物的有_____。Acd a. 苏云金芽孢杆菌 b. 啤酒酵母 c. 链霉菌 d. 恶臭醋酸杆菌 二、填空题（每题2分，共16分） 6、要使玻璃器皿达到无菌状态，一般用干热方法灭菌，而培养基则采用湿热方法来灭菌。
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
环境工程微生物学 第三版_周群英 课后习题目录 第一篇微生物学基础 ............................................................ 1.第一章非细胞结构的超微生物——病毒........................................ 1.第二章原核微生物.......................................................... 3.第三章真核微生物.......................................................... 6.第四章微生物的生理........................................................... 8.第五章微生物的生长繁殖与生存因子. (12) 第六章微生物的遗传和变异 (16) 第二篇微生物生态 (20) 第一章微生物生态 (20) 第二章微生物在环境物质循环中的作用 (22) 第三章水环境污染控制与治理的生态工程及微生物学原理 (26) 第四章污、废水深度处理和微污染源水预处理中的微生物学原理 (28) 第五章有机固体废弃物与废气的微生物处理及其微生物群落 (31) 第六章微生物学新技术在环境工程中的应用 (34)
第一篇微生物学基础 第一章非细胞结构的超微生物一一病毒 1病毒是一类什么样的微生物？它有什么特点？ 答：病毒没有合成蛋白质的机构——核糖体，也没有合成细胞物质和繁殖所必备的酶系统，不具独立的代谢能力，必须专性寄宿在活的敏感宿主细胞内，依靠宿主细胞合成病毒的化学组成和繁殖新个体。其特点是：病毒在活的敏感宿主细胞内是具有生命的超微生物，然而，在宿主体外却呈现不具生命特征的大分子物质，但仍保留感染宿主的潜在能力，一旦重新进入活的宿主细胞内又具有生命特征，重新感染新宿主。 2病毒的分类依据是什么？分为哪几类病毒？ 答：依据是：病毒是根据病毒的宿主、所致疾病、核酸的类型、病毒粒子的大小、病毒的结构、有或无被 膜等进行分类的。根据转性宿主分类：有动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体）线菌体）、藻 、放线菌病毒（噬放 类病毒（噬藻体）、真菌病毒（噬真菌体）。按核酸分类：有DNA病毒和RNA病毒。 3病毒具有什么样的化学组成和结构？ 答：病毒的化学组成有蛋白质和核酸。还含有脂质和多糖。整个病毒体分两部分：蛋白质衣壳和核酸内芯，两者构成核衣壳。蛋白质衣壳是由一定数量的衣壳粒按一定的排列组合构成的病毒外壳。核酸内芯有两种： 核糖核酸（RNA ）和脱氧核糖核酸（DNA）。 4叙述大肠杆菌T系噬菌体的繁殖过程。 答：大肠杆菌T系噬菌体的繁殖过程有：吸附、侵入、复制、聚集与释放。首先，大肠杆菌T系噬菌体以 它的尾部末端吸附到敏感细胞表面上某一特定的化学成分，或是细胞壁，或是鞭毛，或是纤毛。噬菌体侵入宿主细胞后，立即引起宿主的代谢改变，宿主细胞内的核酸不能按自身的遗传特性复制和合成蛋白质，而由噬菌体核酸所携带的遗传信息所控制，借用宿主细胞的合成机构复制核酸，进而合成噬菌体蛋白质，核酸和蛋白质聚集合成新的噬菌体，这个过程叫装配。大肠杆菌T系噬菌体的装配过程如下：先合成含 DNA的头部，然后合成尾部的尾鞘、尾髓和尾丝，并逐个加上去就装配成一个完整的新的大肠杆菌T系噬菌体。噬菌体粒子成熟后，噬菌体的水解酶水解宿主细胞壁而使宿主细胞破裂，使菌体被释放出来重新感染新的宿主细胞一个宿主细胞可释放10到1000个噬菌体粒子。 5什么叫毒性噬菌体？什么叫温和噬菌体？ 答：侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体称作毒性噬菌体。 侵入宿主细胞后，不引起宿主细胞裂解的噬菌体称作温和噬菌体。 6什么叫溶原细胞（菌）？什么叫原噬菌体？ 答：含有温和噬菌体核酸的宿主细胞被称作溶原细胞。在溶原细胞内的温和噬菌体核酸，称为原噬菌体。 7解释Escherichia coli K12 （X）中的各词的含义。
环境工程微生物学 绪论 1、何谓原核微生物？它包括哪些微生物？ 答：原核微生物的核很原始，发育不全，只有DNA链高度折叠形成的一个核区，没有核膜，核质裸露，与细胞质没有明显界限，叫拟核或似核。原核微生物没有细胞器，只有由细胞质膜陷形成的不规则的泡沫体系，如间体核光合作用层片及其他折。也不进行有丝分裂。原核微生物包括古菌（即古细菌）、真细菌、放线菌、蓝细菌、粘细菌、立克次氏体、支原体、衣原体和螺旋体。 2、何谓真核微生物？它包括哪些微生物？ 答：真核微生物由发育完好的细胞核，核由核仁核染色质。由核膜将细胞核和细胞质分开，使两者由明显的界限。有高度分化的细胞器，如线粒体、中心体、高尔基体、质网、溶酶体和叶绿体等。进行有丝分裂。真核微生物包括除蓝藻以外的藻类、酵母菌、霉菌、原生动物、微型后生动物等。 3、微生物是如何分类的？ 答：各种微生物按其客观存在的生物属性（如个体形态及大小、染色反应、菌落特征、细胞结构、生理生化反应、与氧的关系、血清学反应等）及它们的亲缘关系，由次序地分门别类排列成一个系统，从大到小，按界、门、纲、目、科、属、种等分类。种是分类的最小单位，“株”不是分类单位。 4、生物的分界共有几种分法，他们是如何划分的？ 答：1969年魏泰克提出生物五界分类系统，后被Margulis修改成为普遍接受的五界分类系统：原核生物界(包括细菌、放线菌、蓝绿细菌)、原生生物界（包括蓝藻以外的藻类及原生动物）、真菌界（包括酵母菌和霉菌）、动物界和植物界。 我国王大教授提出六界：病毒界、原核生物界、真核生物界、真菌界、动物界和植物界。 5、微生物是如何命名的？举例说明。 答：微生物的命名是采用生物学中的二名法，即用两个拉丁字命名一个微生物的种。这个种的名称是由一个属名和一个种名组成，属名和种名都用斜体字表示，属名在前，用拉丁文名词表示，第一个字母大写。种名在后，用拉丁文的形容词表示，第一个字母小写。如大肠埃希氏杆菌的名称是Escherichia coli。 6、写出大肠埃希氏杆菌和桔草芽孢杆菌的拉丁文全称。 答：大肠埃希氏杆菌的名称是Escherichia coli，桔草芽孢杆菌的名称是Bacillus subtilis。 7、微生物有哪些特点？ 答：（一）个体极小 微生物的个体极小，有几纳米到几微米，要通过光学显微镜才能看见，病毒小于0.2微米，在光学显微镜可视围外，还需要通过电子显微镜才可看见。 （二）分布广，种类繁多 环境的多样性如极端高温、高盐度和极端pH造就了微生物的种类繁多和数量庞大。
食品微生物学课程 期末考试试题 一二三四总分阅卷人复核人 得分阅卷人复核人 一、填空题（每空1分，共30分） 1、食品微生物检验的指标有、和三项。 2、细菌的特殊结构包括、、和等。 3、细菌主要以方式繁殖，酵母菌主要以方式进行繁殖。 4、霉菌营养体的基本单位是，其中根据是否含有而分为单 细胞和多细胞。 5、微生物的营养物质可分为六大类，分别是、、、、 和。 6、微生物的营养类型可分为、、和。 7、正常体液和组织中的抗菌物质主要有和。 8、细菌毒素中的外毒素主要有、和。 9、是最丰富的“菌种资源库”。 10、食品污染可分为、和三类。 得分阅卷人复核人 二、判断改错题（每题2分，共20分） 1、对于微生物来讲，灭菌和消毒的效果是一样的。（） 2、F值是在一定温度和条件下，细菌死亡90%所需的时间。（） 3、大肠菌群是指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧革兰氏阳性芽孢杆菌。（） 4、霉菌、酵母菌、放线菌均适合在碱性培养基中生长繁殖。（） 5、芽孢是繁殖体，细菌可以通过产生芽孢进行繁殖。（） 6、放线菌的培养基是查氏培养基，霉菌的培养基是牛肉膏蛋白胨。（） 7、一种微生物在生命活动中产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制或杀死另一种微生物的现象称为竞争。（） 8、我国规定：细菌总数< 100个/ L。（） 9、酶溶液适合用高压蒸汽进行灭菌。（） 10、实验室中常用合成培养基进行菌种的培养。（） 得分阅卷人复核人 三、问答题（共34分） 1、培养基的分类方法有哪些？（5分） 2、烈性噬菌体对细菌的侵染过程？（5分） 3、细菌革兰氏染色的机理及染色的现象？（6分）
环境工程微生物学考试复习资料
精品文档 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 6、微生物有哪些特点？1.个体极小 2.分布广，种类繁多。3.繁殖快4.易变异 7、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构有什么异同？各有哪些化学组成？ 1.革兰氏阳性菌含大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖。革兰氏阴性菌含极少的聚糖，独含脂多糖，不含磷壁酸。 2.革兰氏阳性菌的细胞壁厚，结构较简单，含肽聚糖、磷壁酸、少量蛋白质和脂肪。革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，结构较复杂，分外壁层和内壁层，外壁层分为三层：最外层脂多糖，中间层磷脂层，内层脂蛋白；内壁层含肽聚糖，不含磷壁酸。 8叙述革兰氏染色的机制和步骤 革兰氏染色的机制有以下两点：(1) 革兰氏染色与等电点的关系G+菌的等电点低于G-菌，所带负电荷更多，因此，它与结晶紫的结合力较大，不易被乙醇脱色。(2) 革兰氏染色与细胞壁的关系G+的细胞壁脂类少，肽聚糖多，G-则相反，故乙醇容易进入G-细胞，进行脱色。 8、藻类的分类依据是什么？它分为几门？ 根据藻类光合色素的种类、个体形态、细胞结构、生殖方式和生活史等，将藻类分为10门：蓝藻门、裸藻门、绿藻门、轮藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、红藻门和褐藻门。 9、真菌包括那些微生物？它们在废水生物处理中各起什么作用？ 真菌包括酵母菌、霉菌及各种伞菌。酵母菌既处理了废水，又可得到酵母菌体蛋白，用作饲料。还可以用酵母菌监测重金属。美军在对废水中氰化物的去除率达90%以上，有的霉菌还可以处理含硝基化合物的废水。真菌在处理有机废水可以用于培养食用菌的菌丝体，这样既处理了废水和固体废物，还获得了食用菌。 10、酵母菌有哪些细胞结构？有几种类型的酵母菌？ 酵母菌的细胞结构有细胞壁、细胞质膜、细胞核、细胞质及内含物。酵母菌有发酵型和氧化型两种。 11、霉菌有几种菌丝？如何区别霉菌和放线菌的菌落？ 整个菌丝体分为两部分：即营养菌丝和气生菌丝 放线菌菌落：是由一个孢子或一段营养菌丝生长繁殖出许多菌丝，并相互缠绕而成的，有的呈戎状或密实干燥多皱，整个菌落像嵌入培养基中，不易被挑取。霉菌菌落：呈圆形、绒毛状、絮状或蜘蛛网状，比其他微生物的菌落都大，菌落疏松，与培养基结合不紧，用接种环很容易挑取。 12、什么叫定向培育和驯化？ 定向培养是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。驯化是经过长时间地定向培养后，微生物改变了原来对营养、温度、PH 等要求，产生了适应酶，利用各营养，改变了代谢途径。 13、什么叫水体自净？可根据那些指标判断水体自净程度？ 河流接纳了一定量的有机污染物后，在物理的、化学的和水生生物等因素的综合作用后得到净化，水质恢复到污染前的水平和状态，这叫水体自净。1、P\H 指数，2、氧浓度昼夜变化幅度和氧垂曲线。 14、水体污染指标有哪几种？污化系统分为那几“带”？各“带”有什么特征？1.BIP 指数2.细菌菌落总数3.总大肠菌群 多污带：位于排污口之后的区段，水呈暗灰色，很浑浊，含有大量有机物，BOD 高，溶解氧极低，为厌氧状态。 α-中污带：在多污带下游，水为灰色，溶解氧少，为半厌氧状态，有机物减少，BOD 下降，水面上有泡沫和浮泥，有氨、氨基酸及H2S ，生物种类比多污带稍多。 β-中污带：在α-中污带之后，有机物较少，BOD 和悬浮物含量低，溶解氧浓度升高，NH3和H2S 分别氧化为NO3-和SO42-，两者含量均减少。 寡污带：在β-中污带之后，标志着河流自净作用完成，有机物全部无机化，BOD 和悬浮物含量极低，H2S 消失细菌极少，水的浑浊度低，溶解氧恢复到正常含量。 15、什么叫水体富营养化？评价水体富营养化的方法有几种？ 人类将富含氮、磷的城市生活污水和工业废水排放入湖泊、河流和海洋，使水体中的氮、磷营养过剩，促使水体中的藻类过量生长，使淡水中发生水华，使海洋中发生赤潮，叫富营养化。观察蓝细菌和藻类等指示生物、测定生物的现存量、测定原初生产力、测定透明度和测定氮和磷等导致富营养化的物质。 16、什么叫活性污泥？它有哪些组成和性质？ 活性污泥(activesludge)是由各种微生微、真菌、原生动物、微型后生动物和各种有机无机的固体物质混凝交织在一起的一种绒粒.即生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称．微生物群体主要包括细菌，原生动物和藻类等．由外到内水解细菌、发酵细菌、氢细菌和乙酸菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、厌氧原生动物其中产甲烷丝菌是厌氧活性污泥的中心骨架。 17、叙述好氧活性污泥净化污水的机理？1.在氧化的条件下，活性污泥绒粒中的絮凝性微生物吸附污水中的有机物。2.活性污泥绒粒中的水解性细菌水解大分子有机物为小分子有机物，同时，微生物合成自身细胞。污水中的溶解性有机物直接被细菌吸收，在细菌体内氧化分解，其中间代谢产物被另一群细菌吸收，进而无机化。3.原生动物和微型后生动物吸收和吞食未分解彻底的有机物及游离细菌。 42、叙述氧化塘和氧化沟处理污水的机制 氧化塘和氧化沟一般用于三级深度处理，用以处理生活污水和富含氮、磷的工业废水。有机污水流入氧化塘，其中的细菌吸收水中的溶解氧，将有机物氧化分解为H2O 、CO2、NH3、NO3-、PO43、SO42-。细 菌利用自身分解含氮有机物产生的NH3和环境中的营养物合成细胞物质。在光照条件下，藻类利用H2O 和CO2进行光合作用合成糖类，再吸收NH3和SO42-合成蛋白质，吸收PO43-合成核酸，并繁殖新藻体。 43、菌胶团、原生动物和微型后生动物在水处理过程中有哪些作用。菌胶团的作用： 1、有很强的生物絮凝、吸附能力和氧化分解有机物的能力 2、菌胶团对有机物的吸附和分解，为原生动物和微型后生动物提供了良好的生存环境 3、为原生动物、微型后生动物提供附着栖息场所 4、具有指示作用 原生动物和微型后生动物的作用 1、指示作用 2、净化作用 3、促进絮凝作用和沉淀作用 44、叙述生物膜法净化污水的作用机制 生物膜在滤池中是分层的，上层生物膜中的生物膜生物和生物膜面生物及微型后生动物吸附污水中的大分子有机物，将其水解为小分子有机物。同时生物膜生物吸收溶解性有机物和经水解的小分子有机物进入体内，并进行氧化分解，利用吸收的营养构建自身细胞。上层生物膜的代谢产物流向下层，被下层生物膜生物吸收，进一步被氧化分解为CO2和H2O 。老化的生物膜和游离细菌被滤池扫除生物吞食。通过以上微生物化学和吞食作用，污水得到净化。 45、什么叫活性污泥丝状膨胀？引起活性污泥丝状膨胀的微生物有哪些？ 由于丝状细菌极度生长引起的活性污泥膨胀称为活性污泥丝状膨胀。经常出现的有诺卡氏菌属、浮游球衣菌、微丝菌属、发硫菌属、贝日阿托氏菌属等 46、促使活性污泥丝状膨胀的环境因素有哪些？ 1、温度 2、溶解氧 3、可溶性有机物及其种类 4、有机物浓度 47、为什么丝状细菌在污水生物处理中能优势生长？ 因为几乎所有的丝状细菌都能吸收可溶性有机物，尤其是低分子的糖类和有机酸。在运行过程中，有机物因缺氧不能降解彻底，积累大量有机酸，为丝状细菌创造营养条件，使丝状细菌优势生长。 48、如何控制活性污泥丝状膨胀？ 1、控制溶解氧 2、控制有机负荷 3、改革工艺 49、污水为什么要脱氮除磷？ 在水体中氮、磷量过多，危害极大，最大的危害是引起水体富营养化，在富营养化水体中，蓝细菌、绿藻等大量繁殖，有的蓝细菌产生毒素，毒死鱼、虾等水生生物和危害人体健康，由于它们的死亡、腐败，引起水体缺氧，使水源水质恶化。不但影响人类生活，还严重影响工、农业生产。 50、微生物脱氮工艺有哪些？ A|O 、A2\O 、A2\O2、SBR 等 51、叙述污水脱氮原理？ 脱氮是先利用好氧段经硝化作用，由亚硝化细菌和硝化细菌的协同作用，将NH3转化为NO2--N 和NO3--N 。再利用缺氧段经反硝化细菌将NO2--N （经反亚硝化）和NO3--N （将反硝化）还原为氮气，溢出水面释放到大气，参与自然界氮的循环。水中含氮物质大量减少，降低出水的潜在危险性。 52、什么叫捷径反硝化？何谓短程硝化-反硝化？在生产中它有何意义？ 捷径反硝化：即通过限制充氧量和缩短曝气时间等条件，抑制硝化细菌生长，促使亚硝化细菌优势生长，迅速将氨氧化为HNO2 后，随即利用有机物将HNO2 还原为N2的过程。捷径反硝化不仅可缩短曝气时间，减少能耗，还节省碳源，从总体上节省运行费用。 Q10：温度每升高10度酶促反应速率相应升高的因数。
1、何谓原核微生物？它包括哪些微生物？ 答：原核微生物只有 DNA链高度折叠形成的一个核区，没有核膜，核质裸露，与细胞质没有明显界限，叫拟核或似核。原核微生物没有细胞器，只有由细胞质膜内陷形成的不规则的泡沫体系。不进行有丝分裂。原核微生物包括古细菌、真细菌、放线菌、蓝细菌、粘细菌、立克次氏体、支原体、衣原体和螺旋体。 2、何谓真核微生物？它包括哪些微生物？ 答：细胞核具有核膜，能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的微小生物。真核微生物包括除蓝藻以外的藻类、酵母菌、霉菌、原生动物、微型后生动物等。3、微生物是如何分类的？ 答：各种微生物按其客观存在的生物属性及它们的亲缘关系，由次序地分门别类排列成一个系统，从大到小，按界、门、纲、目、科、属、种等分类。种是分类的最小单位。 4、生物的分界共有几种分法，他们是如何划分的？ 答：①原核生物界(包括细菌、放线菌、蓝绿细菌)、②原生生物界（包括蓝藻以外的藻类及原生动物）、③真菌界（包括酵母菌和霉菌）、④动物界、⑤植物界。 5、微生物是如何命名的？举例说明。 答：微生物的命名是采用生物学中的二名法，即用两个拉丁字命名一个微生物的种。这个种的名称是由一个属名和一个种名组成，属名和种名都用斜体字表示，属名在前，用拉丁文词表示，第一个字母大写。种名在后，用拉丁文的形容词表示，第一个字母小写。如大肠埃希氏杆菌的名称是 Escherichiacoli。 6、写出大肠埃希氏杆菌和桔草芽孢杆菌的拉丁文全称。 答：大肠埃希氏杆菌的名称是 Escherichiacoli，桔草芽孢杆菌的名称是 Bacillussubtilis。 7、微生物有哪些特点？ 答：（一）个体极小：（二）分布广，种类繁多：（三）繁殖快：（四）易变异： 8、什么是病毒，有什么化学组成？结构是什么样的？ 没有细胞结构，专性寄生生活的敏感宿主体内，可通过细菌过滤器，大小在0、2μm以下的超小微生物。 化学组成有蛋白质和核酸。 结构：没有细胞结构，分两部分：蛋白质衣壳核酸内芯。 9、什么叫毒性噬菌体？什么叫温和噬菌体？ 答：毒性噬菌体：就是指侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体；是正常表现的噬
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
《环境工程微生物学》课程综合复习资料 一、填空题 1、我国大耜提出的六界分类系统为：、、、、、。 2、病毒的分类依据有多种,按照核酸分类，病毒可分为、。 3、细菌的原生质体包括，和三大部分。 4、根据古菌的生活习性和生理特性，古菌可分为、、三大类型。 5、在《伯杰氏系统细菌学手册》中，将古菌分为五大类群：、、、、。 6、放线菌的革兰氏染色反应：除为外，其余均为。 7、在废水生物处理中起重要作用的三种原生动物包括，和。作为指示生物，指示处理效果差的是和。 8、真菌中的、和在有机废水和有机固体废物的生物处理中都起着积极作用。 9、从化学组成来看，酶可分为和两类。 10、、、、四种元素是所有生物体的有机元素。 11、微生物最好的碳源是，尤其是、，它们最易被微生物吸收和利用。 12、环境工程微生物学中,根据形态特点，细菌可分为四种形态,即、、、。 13、按培养基组成物的性质不同，可把培养基分为、、。 14、好氧活性污泥的组成中，微生物成分主要是。 15、菌种复壮法有、、三种。 16、污水生物处理法很多，根据微生物与氧的关系分为和两类。 17、原生动物可划分为四个纲，即、、和。 18、在污废水生物处理中，原生动物和微型后生动物的作用体现在：、和。 19、现在普遍接受的五界分类系统为：、、、、。 20、部分细菌有特殊结构：、、、、和。 21、20世纪70年代开始在水平上研究生物的研究生物的进化和系统发育。沃斯以的相关性，将一类有别于细菌的、在特殊环境的单独列出，与细菌和真核生物并列于系统发育树中。 22、细胞质膜的化学组成包括、、。 23、微生物学家根据rRNA序列的不同，将所有细胞生物分为三大域，即、、。 24、根据专性宿主分类，病毒可分为、、、、、。
《环境工程微生物学》期末考试试卷（A卷） （2002-2003年度上学期） 姓名班级学号成绩 一、选择题（单选或多选，20×2=40） 1、对微生物的概念，以下最正确、最完整的叙述是。 A、微生物是一类个体微小、结构简单，必须借助显微镜才能观察清楚的生物。 B、微生物是一类结构简单，具有单细胞结构，必须借助显微镜才能观察清楚其结构的生物。 C、微生物是一类个体微小、结构简单，具有单细胞结构，必须借助显微镜才能 观察清楚其结构的最低等生物。 D、微生物是一类个体微小、结构简单，具有单细胞、简单多细胞结构或非细胞 结构，必须借助显微镜才能观察清楚其结构的最低等的生物 2、生物五界分类系统包括。 A、原核生物界、原生生物界、真菌界、动物界、植物界。 B、病毒界、原核生物界、真核生物界、动物界、植物界。 C、原核生物界、真核生物界、真菌界、动物界、植物界。 D、病毒界、原核生物界、真核生物界、动物界、植物界。 3、以下微生物属于环境工程微生物范畴的是。 A、病毒、蓝细菌、真细菌、粘细菌。 B、原生动物、蓝细菌、真核藻类、放线菌、粘细菌。 C、微型后生动物、酵母菌、霉菌、真细菌。 D、病毒、螺旋体、细菌、放线菌、 真菌、原生动物、微型后生动物。
4、关于细菌的形态和大小的描述，以下正确的是。 A、细菌的形态包括球菌、杆菌、螺旋菌、丝状菌。 B、杆菌有长杆菌、短杆菌、弧杆菌、链杆菌和芽孢杆菌之分。 C、在任何情况下，细菌的形态都是稳定的。 D、多数球菌的直径为0.5~2.0μm。 5、以下物质属于细胞质内含物的是。 A、细胞膜 B、核糖体 C、荚膜 D、异染粒 E、气泡 6、荚膜具有的功能包括。 A、荚膜可以维持细菌的细胞形态。 B、荚膜为鞭毛提供支点，使鞭毛运动。 C、荚膜是细菌在其表面分泌的一种粘性物质，它可以保护细菌免受干燥的影响； 当营养缺乏时可以作为碳源和氮源被利用。 D、细菌的荚膜有生物吸附的作用，将废水中有机物、无机物及胶体吸附在细菌体表面上。 7、细菌在固体培养基上的菌落特征是细菌分类鉴定的重要依据，描述菌落特征应包括。 A、菌落的形态 B、菌落的大小 C、菌落的光泽 D、菌落的颜色 E、菌落的质地及透明度 F、菌落的边缘特征 8、古菌具有的特点有。 A、古菌有精确的方角和垂直的边构成直角几何形态的细胞； B、古菌的细胞膜组分大多数是脂蛋白，蛋白质是酸性的；
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
环境工程微生物学复习 考试必备 文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
绪论1、微生物的含义：微生物是肉眼看不到的，必须在电子显微镜或光学显微镜才能看见的所有微小生物的统称。 2、分类地位：五界系统：1969年魏克提出微生物五界分类系统：（1）原核生物界：细菌、放线菌、蓝绿细菌（2）原生生物界：蓝藻以外的藻类及原生动物（3）真菌界（酸性土壤中真菌较多）：酵母菌、霉菌（4）动物界（5）植物界。三域系统：（1）古菌域（Archaea）：“三菌”产甲烷菌、极端嗜盐菌、嗜热嗜酸菌（2）细菌域（Bacteria）：细菌（化）、蓝细菌（光）、放线菌（化）、立克次氏体（寄生）、支原体（人工培养基，最小）、衣原体（寄生）、螺旋体（原核，是细菌与原虫的过度）“三体”支原体、立克次氏体、衣原体（3）真核生物域（Eukarya）：真菌、藻类、动物、水生植物（原生动物、真菌、藻类） 3、按细胞结构的有无分为分为：非细胞结构微生物（病毒、类病毒：类病毒是比病毒小的超小微生物）和细胞结构微生物。 按细胞核器、有丝分裂的有无分为：原核和真核 4、分类单位：域界门纲目科属种（柱） 5、微生物的特点：（1）体积小，比表面积大（2）分布广，种类繁多（3）吸收多，转化快（4）生长旺，繁殖快（5）适应性强（6）易变异 6、解释EscherichiacoilK12（λ）中的各词的含义。 答：溶原性噬菌体的命名是在敏感菌株的名称后面加一个括弧，在括弧内写上溶原性噬菌体λ。大肠杆菌溶原性噬菌体的全称为EscherichiacoilK12
（λ），Escherichia是大肠杆菌的属名，coil是大肠杆菌的种名，K12是大肠杆菌的株名，括弧内的λ为溶原性噬菌体。解释EscherichiacoilK12（λ）中的各词的含义。 答：溶原性噬菌体的命名是在敏感菌株的名称后面加一个括弧，在括弧内写上溶原性噬菌体λ。大肠杆菌溶原性噬菌体的全称为EscherichiacoilK12（λ），Escherichia是大肠杆菌的属名，coil是大肠杆菌的种名，K12是大肠杆菌的株名，括弧内的λ为溶原性噬菌体。 第一章：病毒 1、病毒的特点以及分类： （1）大小在微米以下，故在光学显微镜下看不见，必须在电子显微镜。（小） （2）可合成蛋白质的机构——核糖体，也没有合成细胞物质和繁殖所必备的酶系统，不具独立的代谢能力。（简） （3）必须专性寄生在活的敏感宿主细胞内，依靠宿主细胞合成病毒的化学组成和繁殖新个体。（寄） （4）在宿主体外却呈现不具生命特征的大分子物质，但仍保留感染宿主的潜在能力，一旦重新进入活的宿主细胞内又具有生命特征，重新感染新的宿主。 2、病毒的分类依据是什么分为哪几类病毒 答：病毒是根据病毒的宿主、所致疾病、核酸的类型、病毒粒子的大小、病毒的结构、有或无被膜等进行分类的。 根据专性宿主分类：有动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放线菌体）、藻类病毒（噬藻体），真菌病毒（噬真菌体）。
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。