A分类号学号M080647 U D C密级
学位论文
猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及其对小鼠的
致病性
范群平
指导教师：高崧教授，扬州大学，江苏扬州，225009
刘秀梵教授，扬州大学，江苏扬州，225009
申请学位级别：硕士学科专业名称：预防兽医学
论文提交日期：2011年4月论文答辩日期：2011年5月
学位授予单位：扬州大学学位授予日期：2011年6月
答辩委员会主席：刘秀梵
论文评阅人：茅翔
丁壮
2011年5月
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析1猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及其对小鼠的
致病性
本文受国家重点基础研究发展规划项目（973计划，No.2011CB505003）和国家科技重大专项课题（No.2008ZX10004-013、2009ZX10004-214）
资助
Isolation and identification of H1N1swine influenza virus in Jiangsu Province and pathogenicity on mice
This work was supported by the Major State Basic Research Development Program(973Program)(No.2011CB505003),the Important National Science&Technology Specific Projects(No.2008ZX10004-013,
2009ZX10004-214)
研究生：范群平
专业：预防兽医学
导师：高崧教授
刘秀梵教授
2011年5月
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扬州大学硕士学位论文
猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定及其对小鼠的
致病性
摘要
猪流行性感冒（swine influenza，SI）是由正粘病毒科A、B、C型流感病毒属的猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、传染性呼吸系统疾病。A型猪流感病毒可以引起世界性大流行。猪的呼吸道上皮细胞不仅有禽流感病毒吸附所需要的α-2，3唾液酸受体，还具有人流感病毒吸附所需要的α-2，6唾液酸受体。因此猪既可以感染禽流感病毒也可以感染人流感病毒，猪就像一个“混合器”，不同来源的流感病毒在猪体内发生重排、突变的概率大大提高。因此，猪被认为是新流感病毒产生的中间宿主。人类历史上的三次流感病毒世界大流行（1918年的西班牙流感病毒H1N1大流行、亚洲流感病毒H2N2大流行、香港流感病毒H3N2大流行）后来证明都跟猪流感有关。因此对猪流感病毒的流行情况进行监测具有重要的公共卫生意义。
2009年3月墨西哥新甲型流感病毒H1N1爆发，并迅速形成世界性大流行，发病人群主要是学生以及青壮年人。后来的研究证明，此次大流行的新甲型H1N1流感病毒是混合了禽源流感病毒、人源流感病毒和猪源流感病毒特征的重组病毒。对猪群中猪源H1N1流感病毒进行流行病学监测对于防止重大疫情的发生，最大程度降低经济损失，具有重要的意义。
为了解江苏省猪群中甲型H1N1流感的流行病学现状及其病原学特征，2010年1月～2010年5月对江苏地区的苏北（盐城）、苏中（扬州）、苏南（无锡）三个监测点的屠宰场、养殖场及发病猪群进行样品的采集与病毒分离，累计采集猪鼻拭子1029份，并从中分离鉴定了11株H1N1亚型猪流感病毒与2株H9N2亚型猪流感病毒。我们对其中的8株H1N1亚型的猪流感病毒进行了全基因测序和遗传进化分析，发现8株猪源H1N1亚型流感病毒均为低致病性甲型流感病毒，分离于无症状猪群，属于三重重组病毒，可能源于北美新毒株
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析3
A/California/04/2009。各基因与其来源毒株相比均尚未再发生基因重排，但HA 蛋白中决定唾液酸(SA)受体结合类型的相关位点：225位有3个毒株由D突变为G，240位有5个毒株由Q突变为R，增强了对Saα2,3Gal受体的结合能力；NA 蛋白8个潜在的糖基化位点中，也有2个毒株的第50位NQS氨基酸替换为NPS 使其潜在糖基化位点缺失，这些都可能是病毒在猪群中适应的结果，推测新甲型H1N1流感病毒在猪体内经过一段时间适应后很有可能在我国猪群中成为新的优势流行株。
为了对分离到的猪源甲型H1N1流感病毒的致病性有进一步的了解，随机选取一株分离毒株：A/Swine/Jiangsu/48/2010，50μl，1×107.68EID50/只，滴鼻接种ICR 小鼠，并设接触组与对照组，以研究病毒的水平传播能力。接种后每天收集体重数据，并在第3、7、11、14天捕杀小鼠，观察心、肝、脾、肺、肾、气管的组织病理学变化，并进行病毒分离。结果表明：攻毒组小鼠与接触组小鼠体重早期有不同程度的下降，后期逐渐恢复。攻毒小鼠出现了以肺损伤为主要特征的病理变化，接种第3天、7天捕杀的小鼠分离出了病毒，第11天与14天捕杀的小鼠未能分离出病毒。接触组小鼠也出现类似的病理变化，只是症状轻相对较轻，但是接触组整个实验过程都没有分离到病毒，说明本次分离到的病毒可能可以在ICR 小鼠间传播，但是更多证据有待进一步研究。
关键词:猪流感病毒；H1N1亚型；基因组测序；进化；致病性
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Isolation and identification of H1N1swine influenza virus in Jiangsu Province and its pathogenicity on
mice
Abstract
Swine influenza(SI)is a highly contagious respiratory disease caused by A,B,C swine influenza virus.Several pandemic influenza viruses originated from pigs.S wine are susceptible to infect with both avian origin and human origin influenza viruses, because they haveα-2,3sialic acid receptors andα-2,6sialic acid receptors.Novel reassortant influenza viruses can be generated in pigs by reassortment of influenza viral gene segments that leads to the“mixing vessel”theory.The three pandemic events of influenza in humans(H1N1pandemic in Spain;H1N2pandemic in Asia; H3N2pandemic in Hong Kong)are related to swine and SI.Therefore,the public health concern calls for careful surveillance to H1N1influenza viruses.
The novel swine-origin A influenza virus outbreaks in Mexico in March2009and soon becomes pandemic around the world.Susceptible population is mainly students and https://www.doczj.com/doc/ab7699372.html,ter researches found that there is substantial evidence that the influenza viruses in Mexico Pandemic in March2009are novel reassortant influenza viruses of avian,swine and human influenza viral RNA segments.For the above reason, that surveillance of swine influenza virus H1N1in Jiangsu Province has important significance to prevent the occurrence of major epidemic and reduce the pecuniary loss.
In order to surveille H1N1epidemic in pigs in Jiangsu and discover whether it contributes to epidemic or pandemic potential,and to real the characteristics and the pathogenicity of the viruses,one thousand and twenty-nine nasopharyngeal swabs of swine in northern,middle and southern of Jiangsu Province(i.e.Yancheng,Yangzhou
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析5
and Wuxi)were collected in slaughterhouse,farms and infected swinery to isolate viruses from Jan2010to May2010.There were eleven strains of H1N1subtype and two of H9N2subtype swine influenza viruses(SIV)isolated and identified.Here,we sequenced the entire genomics of eight strains of H1N1SIVs and analyzed the evolution of them,finding that all the eight SIVs were low pathogenic,triple Reassortants and similar to A/California/04/2009.The results suggested that the H1N1 influenza virus in2009might present in swine population.Furthermore,compared with the strain A/California/04/2009,all genes have not recombined,but two sites of hemagglutinin(HA)protein bond with the sialic acid(SA)receptors have mutated (D225G of three strains,Q240R of five strains)resulting in enhancement of the ability of binding with the Saα2,3Gal receptor,and the eight potential glycosylation sites of NA protein of two strains have mutated(Q50P)leading to the deficiency of the potential glycosylation sites.All of those may be the virus adoption in swinery and the novel H1N1SIV may become the main population in swine of our country by mutation s for adoption.
To explore the pathogenicity of H1N1influenza viruses isolated from swine,we carried out experiments on ICR mice with a randomly selected strain of H1N1 influenza viruses namely A/Swine/Jiangsu/48/2010.Each mouse was inoculated intranasally with50μl at a dose of1×107.6850%embryo infectious dose(EID50)H1N1 virus as challenged group and with50μl PBS buffer as the control group,we also set an exposed group to investigate the horizontal transmission of the test H1N1virus. Collected data of the body weight of each mouse was recorded for an interval of24h post-challenge,and in the3,7,11and14days post-challenge,one mouse of each group was euthanized,the histopathology of heart,liver,spleen,lung,kidney was observed and virus isolation was done.the data showed that mice from challenged group and exposed group had weight loss in different degree at early period and began
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to recover at later period.The lesions mainly in the lung of the challenged mice were observed.The H1N1virus was recovered from the tissues of euthanized mice from3to 7days post-challenge,while was not recovered after11days post-challenge.A similar, moderate histopathological changes were observed in the mice of the exposed group, and no virus was isolated in the mice for the whole period.These results showed that the H1N1virus had a tendancy to be transmitted among ICR mice,however,the direct evidence for this transmittion need further study.
Key words:swine influenza virus,H1N1subtype,genomic sequencing,evolution, pathogenicity.
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析7
目录
摘要 (2)
Abstract (4)
符号说明 (9)
综述：猪源甲型流感病毒H1N1的研究进展 (12)
1猪源甲型流感病毒H1N1的概况及其历史 (14)
2猪流感病毒的病原学 (15)
2.1猪流感病毒的形态 (15)
2.2流感病毒的分类和命名 (16)
2.2.1流感病毒的分类 (16)
2.2.2流感病毒的命名 (17)
2.3猪流感病毒的分子生物学特性 (17)
2.3.1猪流感病毒的基因组结构 (17)
2.3.2猪流感病毒各基因编码的蛋白的功能 (17)
2.3.2.1血凝素（Hemagglutinin,HA） (17)
2.3.2.2神经氨酸酶（Neuraminidase,NA） (18)
2.3.2.3非结构蛋白（Nonstructural Protein,NS） (19)
2.3.2.4核蛋白（Nucleoprotein,NP） (19)
2.3.2.5基质蛋白（matrix protein,MA） (20)
2.3.2.6聚合酶蛋白（Polymerse,P） (20)
3猪流感病毒抗原的遗传变异 (21)
3.1.1抗原转变 (21)
3.1.2抗原漂移 (21)
3.1.3RNA片段重组 (22)
4猪流感病毒的发病机理 (22)
5猪流感病毒的临床症状与病理变化 (23)
5.1猪流感病毒的临床症状 (23)
5.2猪流感病毒的病理变化 (23)
6猪流感的流行病学 (23)
7猪流感病毒的防制 (24)
参考文献 (25)
第一章江苏猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析 (28)
1材料和方法 (28)
1.1实验材料 (28)
1.1.1禽流感阳性抗原与阳性血清 (28)
1.1.2SPF鸡胚 (29)
1.1.3生物试剂 (29)
1.1.4主要仪器设备 (29)
1.1.5相关溶液的配制 (30)
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1.1.5.1病毒保护液的配制 (30)
1.1.5.21%的SPF鸡红细胞的制备 (31)
1.1.5.3LB培养基的制备 (31)
1.1.5.4AIX固体培养基的制备 (31)
1.2猪鼻咽拭子 (32)
2方法 (32)
2.1病毒的分离及初步鉴定 (32)
2.1.1血凝试验（HA） (32)
2.2病毒的鸡胚克隆纯化 (33)
2.3病毒亚型的鉴定 (33)
2.3.1血凝抑制实验（HI） (33)
2.3.1.14单位抗原的稀释与校正 (33)
2.3.1.2血凝抑制试验 (33)
2.4病毒基因的克隆、序列测定和遗传演化分析 (34)
2.4.1病毒RNA的提取 (34)
2.4.2病毒RNA的反转录 (34)
2.4.3PCR扩增 (35)
2.4.4CaCl2法制备感受态细胞 (36)
2.4.5连接产物的转化 (37)
2.4.6蓝白斑筛选 (37)
2.4.7SDS碱裂解法小量制备质粒DNA (37)
2.4.8重组克隆质粒的酶切鉴定 (38)
2.4.9病毒全基因序列的遗传进化分析 (38)
3结果 (38)
3.1病毒的分离及鉴定 (38)
3.2H1N1亚型的猪流感病毒全基因分析 (39)
3.2.1HA基因分析 (39)
3.2.2NA基因分析 (42)
3.2.3NP基因分析 (44)
3.2.4PA基因分析 (45)
3.2.5PB1基因分析 (46)
3.2.6PB2基因分析 (47)
3.2.7M基因分析 (48)
3.2.8NS基因分析 (49)
4讨论 (59)
参考文献 (61)
第二章一株猪源甲型H1N1流感病毒对ICR小鼠的致病性 (64)
1实验材料 (64)
1.1生物材料 (64)
1.1.1试验动物 (64)
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1.1.2饲料 (65)
1.1.3实验毒株 (65)
1.1.4麻醉剂与苏醒剂 (65)
1.1.5实验场所 (65)
1.2实验仪器 (65)
2实验方法 (65)
2.1试验用病毒的大量制备 (65)
2.2实验动物的分组 (65)
2.3血凝试验（HA） (66)
2.4麻醉、攻毒 (66)
2.5病理切片的制作 (66)
2.6病毒的分离 (66)
2.8数据采集 (67)
3结果与分析 (67)
3.1实验小鼠的死亡情况及攻毒后的临床症状 (67)
3.2解剖病理变化 (68)
3.3显微组织病理变化 (69)
3.3.1肺组织的病理变化 (69)
3.3.2脾脏的病理变化 (71)
3.3.3肝脏的病理变化 (72)
3.3.4肾脏的病理变化 (74)
3.3.5心脏的病理变化 (76)
3.3.6气管的病理变化 (77)
3.4病毒分离结果 (77)
4讨论 (78)
参考文献 (79)
致谢 (80)
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符号说明
符号英文全称中文名称
A alanine丙氨酸
AIV avian influenza virus禽流感病毒AI avian influenza禽流感BSA bovine serum albumin小牛血清白蛋白CDC Centers for Disease Control疾病预防控制中心
D aspartic acid天冬氨酸DNA deoxyribonucleotide acid脱氧核糖核酸dNTPs deoxynucleoside triphosphate三磷酸脱氧核苷DEPC diethyl pyrocarbonate焦炭酸二乙酸
E glutamic acid谷氨酸EDTA ethylene diaminetetra acetic acid乙二胺四乙酸EID5050percent embryonating egg infection dose鸡胚半数感染量ELD5050percet embryonating egg lethal dose鸡胚半数致死量
G glycine甘氨酸
H histidine组氨酸
HA hemagglutinin血凝素
HI hemagglutinin inhibition test血凝抑制实验
I isoleucine异亮氨酸
IV influenza virus（人）流感病毒IFN interferon干扰素
K lysine赖氨酸
L leucine亮氨酸
M methionin蛋氨酸
M matrix protein基质蛋白
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析11
MDCK madin-darby canine kidney犬肾细胞N asparagin天冬酰胺
NA neuraminidase神经氨酸酶
NI neuraminidase inhibition test神经氨酸酶抑制试验NS1nonstructual protein1非结构蛋白1
NS2nonstructual protein2非结构蛋白2
NP nucleoprotein核衣壳蛋白
OD optical density光密度
OIE Office Iernational des Epizooties国际兽医局P proline脯氨酸
PA polymerase acidic protein酸性聚合酶蛋白PB1polymerase basic protein1碱性聚合酶1
PB2polymerase basic protein2碱性聚合酶2 PBS phosphate buffer saline磷酸盐缓冲液PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应Q glutamine谷氨酰胺
R arginine精氨酸
RNA ribonucleic acid核糖核酸RNasin RNase inhibitor RNA酶抑制剂RT reverse transcription反转录
S serine丝氨酸
SA sialic唾液酸
SI swine influenza猪流感
SIV swine influenza virus猪流感病毒SPF specific pathogen free无特定病原体V valine缬氨酸
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WHO world health organization(联合国)世界卫生组织aa amino acid氨基酸
ml milliliter毫升
mg milligram毫克
μl microliter微升
μg microgram微克
s second秒
min minute分钟
h hour小时
rpm rotation per minute转/分钟
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析13综述：猪源甲型流感病毒H1N1的研究进展
猪流行性感冒（swine influenza,SI）是由正粘病毒科A、B、C型流感病毒属的猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）引起的人畜共患的一种急性、传染性呼吸器官疾病。其特征为突发，咳嗽，呼吸困难，发热及迅速转归。
SI通常呈地方性流行和全球大流行两种传播方式，感染猪只24小时内出现流感症状并通过咳嗽、流鼻涕等形式排毒，感染猪只如果没有发生继发性的细菌感染会很快康复，传染性很高但通常不会引发死亡。秋冬季属高发期，但全年可传播。
SI是规模化猪场普遍存在的群发性疾病，患猪生产性能下降，推迟上市时间，加重饲料成本，并影响猪群的群体健康状态，更值得重视的是SIV由于对呼吸道上皮有高度特异亲嗜性而使呼吸道上皮受损，而导致其他呼吸道细菌和呼吸道病毒的继发或并发感染，[1,2,3]有继发或并发感染的患猪甚至会导致猪的死亡。猪流感病毒对养猪业危害极大。目前，亚欧美非等地均有本病的发生，是一种世界性的猪呼吸道传染病[4,5,6]。自从1930年从猪中分离到第一株流感病毒以来，猪就是流感病毒的病原的重点研究对象之一。
SI不仅危害猪群，具有重要的兽医公共卫生学意义，而且具有重要的人类公共卫生学意义。猪的呼吸道上皮细胞不仅具有禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）吸附所需要的α-2,3唾液酸受体，还具有人流感病毒（influenza virus,IV）吸附所需要的α-2,6唾液酸受体。因此猪既可以感染禽流感也可以感染人流感，猪就像一个大的“混合器[7]”。各种来源的、各种型的、各种HA和NA亚型的流感病毒在猪的呼吸道上皮细胞里面复制，增殖，也增大了基因重排和重组的机会，自然条件下产生对人高致病性的新型重组流感病毒的概率提高。
2009年4月，传出猪流感在墨西哥突然爆发的消息，美联社报道这次流感的病原为H1N1,这次流行的毒株是混合了猪流感病毒、人流感病毒、与禽流感病毒特征的重组病毒。虽然后来因为病毒并未在猪群中流行，以及考虑到对猪肉进出口
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的巨大影响，美国疾病预防控制中心（Centers for Disease Control,CDC）宣布更名为“甲型H1N1流感病毒”，但是不可否认的是，猪以及猪流感病毒在此次流感大流行中扮演了极为重要的角色。
因此，开展猪源甲型流感病毒H1N1的病原学检测和对流感病毒的全基因组进行遗传进化化分析以及对猪源甲型流感病毒H1N1的致病性进行研究，具有重要的公共卫生学意义。
1猪源甲型流感病毒H1N1的概况及其历史
流行性感冒简称流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病。甲（A）、乙（B）、丙（C）不仅反映了病毒被发现的先后顺序，更主要的是反映了对人类的危害程度。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，在动物中广泛分布。乙型流感病毒常常引起流感局部暴发，至今为止，只发现在人类中流行，没有证据证明在其他动物中存在，不引起世界大流行。丙型流感病毒以零散形式存在，主要侵袭幼儿，一般不引起流行，过去认为人是丙型流感的唯一天然宿主，但是郭元吉等人于1982年从我国猪群中分离到多株丙型流感病毒，并且得到全世界的公认[8]。
猪源甲型流感病毒(H1N1）有不同的来源，一种是传统的猪流感，来源于猪，称为古典型毒株；一种可能来源于人，称为类人型毒株；还有一种可能来源于禽类，称为类禽型毒株。
美国于1918年首次报道了猪流感，巧合的是，当时人群中正在暴发流感病毒的世界性大流行，全球20亿人感染，两千多万人死亡，且绝大多数为青壮年。而美国猪群中出现的流感的临床症状和病理变化与当时人群中流行的流感有许多相似之处。而后经过血清学追溯研究认为，1918年人群中流行的病原为猪源H1N1流感病毒[9]。
美国人R.E.Shope于1930年分离出了世界第一株猪流感病毒H1N1，即古典型H1N1的代表株A/Swine/Iowa/15/31，此举开创了猪流感病毒的新纪元。1933
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析15
年英国的Smith等人使用R.E.Shope的方法首次将从人体中分离到的流感病毒称之为甲型流感病毒，1936年将此病毒的动物传代毒感染人，证实了病毒的存在。1918年以后，北美洲、欧洲、亚洲等地区相继分离出猪源的H1N1流感病毒，1976年，在美国的Fort Dix事件中，一名士兵因感染猪源甲型H1N1流感病毒而死于肺炎，此次发病是人类历史上首次发现猪流感致人发病的病例。1979年发生于猪群中的类禽型H1N1亚型的流感病毒在抗原上与古典型的H1N1亚型的猪流感病毒存在明显的差异，在欧洲则是完全取代了以往的古典型H1N1亚型[10,11,12]。1988年，从死于原发性病毒性肺炎的怀孕妇女体内检测到唯一致病原为A/Wisconsin/3523/88(H1N1)，病毒8个片段的全长cDNA与当是流行的猪流感H1N1有很高的同源性[13]。1994年在荷兰分离到两株人禽重组流感病毒，其抗原性和遗传性相关的病毒已在欧洲猪中分离到，编码其内部蛋白的6个基因来源于禽类[14,15]。
2猪流感病毒的病原学
2.1猪流感病毒的形态
猪流感病毒属于正粘病毒科，典型的病毒粒子呈球状，直径80～120nm。某些毒株，特别是初次分离时，常呈丝状，长短不一。流感病毒毒的多形性在动物病毒中是比较突出的。病毒粒子从宿主细胞膜释放时，从宿主获得病毒囊膜，但是囊膜缺乏宿主细胞的蛋白质。囊膜表面有棒状的HA糖蛋白多聚体和蘑菇状的NA糖蛋白多聚体以及M2蛋白，三种突起均插入并以疏水性氨基酸为锚定在类质膜上，一个流感病毒粒子大约有500个纤突，包括大约90%的HA和大约10%的NA[16]。中间层为基质蛋白（M1）构成的一个或若干个分子厚的球形蛋白壳。里层是核衣壳，呈螺旋型对称，直径9～15nm，含有核蛋白（NP）、三种聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）和病毒的分节段的单链RNA。非结构蛋白NS1仅在感染细胞中出现，NS2存在于病毒粒子中。
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图1流感病毒的的结构示意图
Fig.1The structure of influenza virion
2.2流感病毒的分类和命名
2.2.1流感病毒的分类
流感病毒可按照血清型、亚型进行分类，最近又根据基因型进行分类，根据流感病毒基质蛋白（M）和核蛋白（NP）的不同，流感病毒可分为A、B、C型流感病毒，只有A型流感病毒作为猪流感的病原具有临床意义。
根据A型流感病毒那个膜表面的糖蛋白基团血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的性质，可以将A型流感病毒分成不同的亚型。根据这个分类方法，现在共发现16种HA亚型以及9种NA亚型，不同的HA与NA亚型组成病毒的亚型[16,17]。
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析17
2.2.2流感病毒的命名
1980年，WHO专家小组提出了甲型流感病毒新的分类和命名方法，根据新的命名方法，一株流感病毒名称中包括以下几项内容：型别/宿主/分离地点/毒株序号/分离年代（亚型）。
2.3猪流感病毒的分子生物学特性
2.3.1猪流感病毒的基因组结构
猪源甲型流感病毒的基因组含有8个单股负链RNA片段，属于分节段基因组。其基因组的8个片段具有共同的特点：具有高度保守的3'端和5'端。每个片段的5'端均由13个核苷酸序列组成，每个片段的3'端由12个核苷酸序列组成，靠近3'端的第四个碱基，有些毒株为U，有些毒株为C。其序列如下：3'-OH-UCGU/CUUUCGUCC-5'（5'端保守序列）
3'-OH-UCGU/CUUUCGUCC-5'（3'端保守序列）。
3'端与5'端部分序列互补，形成锅柄形的环状结构，该结构是病毒RNA聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点，这对病毒的复制非常重要。
甲型流感病毒的8个分节段的RNA片段中，1～6节段分别编码一个病毒蛋白，7、8节段各编码2个病毒蛋白，所以甲型流感病毒具有10种蛋白多肽[16-20]。
2.3.2猪流感病毒各基因编码的蛋白的功能
2.3.2.1血凝素（Hemagglutinin,HA）
血凝素（HA）是流感病毒的主要表面糖蛋白，借助HA对细胞受体的作用，使病毒附着于细胞，在穿膜过程中起关键作用。
HA具有凝集多种动物红细胞的性质，这种结合在4℃条件下相当稳定，但在
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37℃时，由于NA对受体的破坏作用，使病毒迅速从红细胞上释放。
HA由流感病毒RNA片段4编码，是典型的Ⅰ型糖蛋白，大小为75kD，含有566个氨基酸残基。HA呈细长的棒状结构，HA的羧基端在囊膜内，氨基端在囊膜外。HA由两个肽链由二硫键连接在一起。HA可以水解为HA1和HA2,前者含有319～328个氨基酸残基，后者含有221～222个氨基酸残基。HA水解是流感病毒感染的先决条件[8,16,20,21]。HA含有4个结构域：信号肽、胞浆域、跨膜域、和胞外域。另外HA通常含有6～10个糖基化位点[22]。HA产生后要经过3个加工处理过程才可以发挥作用，包括裂解酶的裂解、糖基化和脂肪酸的乙酰化过程。HA在细胞内质网内合成，合成后被运送到高尔基复合体，最后被运送到细胞膜，然后嵌入细胞膜的脂质双分子层，病毒出芽时带到病毒的囊膜上。
HA是一种糖蛋白，每一个HA单体分子上带有7个寡糖链，其中6个在HA1，1个在HA2，这些寡糖链都通过N-葡萄糖苷键与天冬氨酸残基相连。
HA的变异型很强，是病毒发生抗原变异的主要原因。
目前，对大多数亚型的HA已经进行了测序，序列比较发现半胱氨酸残基在所有亚型中都比较保守，这从遗传学上表明，他们可能从同一个祖先级的HA型进化而来。H1和H3亚型的同源性差别较大，仅为25%；H2和H5之间的同源性相差最小，高达80%。相同亚型的不同毒株之间，HA亚型的序列同源性都在90%以上。
2.3.2.2神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
神经氨酸酶是流感病毒粒子表面又一个比较重要的抗原，其数量比HA少，并且成簇存在。当前已知的NA亚型有9个，它们在血清学上不存在交叉反应。神经氨酸酶神经氨酸酶有流感病毒基因组的RNA片段6编码，该RNA片段约1443-1492bp，编码459个氨基酸，NA分子量大约为200kD，由两个相同的并由二硫键链接的55kD糖蛋白的二聚物，即由4个单位的NA组成，呈蘑菇形。神经氨酸酶可以水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸，是一种
范群平：江苏省猪源新甲型H1N1流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析19
特异性的外切糖苷酶，能识别特异的唾液酸，可以从α糖苷键上除去唾液酸残基。这一功能对于病毒粒子的释放和防止病毒粒子的聚集是非常重要的。
NA属于Ⅱ类糖蛋白，即氨基端在囊膜内而羧基端在囊膜外，与HA正好相反。其一级结构包括4个区域：头部序列、颈部序列、非极性跨膜区和氨基端胞浆尾。氨基端胞浆尾包括6个氨基酸残基：MNPNOK。非极性跨膜区包括7到35位的氨基酸残基，前六个比较保守，其余氨基酸变异较大。颈部的主要功能是帮助形成四聚体，关于颈部是否具有其他功能目前尚不清楚[23]。
2.3.2.3非结构蛋白（Nonstructural Protein,NS）
非结构蛋白片段（NS）由片段8编码，该片段编码8990个氨基酸，包括两个编码区，分别编码NS1和NS2。第一个编码区起始于第28位核苷酸，终止于648位氨基酸，编码NS1。NS1由207个氨基酸组成，分子量位25kD。第二个编码区起始于27～56终止于529～864，编码NS2。NS2包括121个氨基酸残基，分子量为12kD。NS主要在宿主的细胞浆内，成熟的病毒粒子内部不含有NS。
NS1在流感病毒早期就可以在宿主细胞的细胞核内发现有大量聚集，而NS2出现的比较晚，主要存在于胞浆内。在宿主细胞中发挥多种调节功能，促进细胞内病毒mRNA的合成与翻译，并阻止细胞RNA的转录语翻译，并抑制宿主细胞的干扰素通路。NS2可能在NS蛋白合成中起调节作用[24,25]。
2.3.2.4核蛋白（Nucleoprotein,NP）
NP是由病毒基因组的片段5编码的主要结构蛋白。NP是病毒核衣壳的主要主要组成部分。NP具有型的特异性，根据其抗原性的不同可以将流感病毒划分为甲、乙、丙三种类型。另外核蛋白还是一种多功能蛋白，在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用，在确定病毒的宿主特异性方面也有作用，NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。