1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
评估方案 一、荧光粉的分析测试方法 1、发射光谱和激发光谱的测定 把样粉装好后，放到样品室里，选定一个激发波长，作发射光谱扫描，读出发射光谱的发射主峰。给定发射光谱的发射主峰，作激发光谱扫描，读出激发光谱峰值波长。重新装样，测试3次，各次之间峰值波长的差值不超过±1nm，取算术平均值。 2、外量子效率的测定 把样粉装好后，放到样品室里，选定一个激发波长，激发荧光粉发光，利用光谱辐射分析仪测试得到荧光粉的发射光谱功率分布。计算荧光粉在该激发波长下的外量子效率。重新装样，测试3次，各次之间的相对差值不大于1%，取算术平均值。 3、相对亮度的测定 将试样和参比样品分别装满样品盘，用平面玻璃压平，使表面平整。用激发光源分别激发试样和参比样品。用光电探测器将试样和参比样品发出的光转换成光电流，并记录数值。试样和参比样品连续重复读数3次，各次之间相对差值不大于1%，取算术平均值。 4、色品坐标的测定 把试样装好放入样品室中。选定激发光源的发射波长，使其垂直激发样品室里的荧光粉样品。利用光谱辐射分析仪按一定的波长间隔（不大于5nm）测试得到荧光粉的发射光谱功率分布。按GB 3102.6-1993中“6.39 色品坐标”的公式求出荧光粉的色品坐标。 重复测试3次，各次之间x、y的差值均不超过±0.001，取算术平均值。 5、温度特性的测定 把试样装好放入样品室中，于室温下测试其激发、发射主峰波长，相对亮度及色品坐标等。每一试样按测定步骤平行测3次，各次之间激发、发射主峰波长的差值均不超过±1 nm，相对亮度的差值不超过±1%，色品坐标的差值不超过±0.001。启动加热装置，将被测的荧光粉试样加热并稳定在设定的温度值10min。稳定在预定的温度下，测定荧光粉试样的激发、发射主峰波长，相对亮度及色品坐标等。每一试样按测定步骤平行测3次，各次之间激发、发射主峰波长的差值均不超过±1nm，相对亮度的差值不超过±1%，色品坐标的差值不超过±0.001。冷却荧光粉试样至室温，测试其激发、发射主峰波长，相对亮度及色
荧光检测器技术规格 一、采购内容 *2.1灵敏度：蒽（LOD）为10fg，Ex 250nm/Em 400nm Raman（水），单波长模式：Ex 350nm/Em397nm Raman（水），双波长模式：Ex 350nm/Em397nm和Ex 350nm/Em450nm 2.2光源：闪烁氙灯 2.3脉冲模式：单一模式296Hz; 经济模式74Hz 2.4激发光柵：凹型全息光柵, 200~1200nm波长范围, 狭缝宽度20nm 2.5发射光柵：凹型全息光柵, 200~1200nm波长范围, 狭缝宽度20nm 2.6实时信号：可同时输出4个激发或发射波长的实时检测信号 2.7时间编程参数：响应时间，PMT增益，基线归零，光谱参数 2.8光谱采集：激发和发射光谱，扫描速度28ms/数据点 2.9最快采样速率：74Hz 2.10步进：10nm 2.11波长重现性： 2.12波长准确性： 2.13流通池：8μL，最高耐压20bar（2MPa），石英材质 2.14离线荧光光谱采集流通池：8μL，选配1mL注射器 2.15 能与安捷伦（Agilent）的高效液相色谱（HPLC1290）联用，和安捷伦MassHunter软件 B06版本兼容 三、技术服务要求 3.1设备安装调试 在采购人指定的地点完成安装调试，并配合采购人进行测试验收。 3.2技术培训
卖方须到买方提供的现场免费安装调试，并进行操作试验，直到运转正常，为买方的使用操作人员提供免费的操作及维护培训。 3.3质保期 整机保修1年终身维修。保修期自验收签字之日起计算。 3.4维修响应时间 接到维修通知后，2小时内作出响应，24小时内到场排除故障。 注：该设备办理免税，如不能办理免税，所有费用由中标厂家承担。
X荧光分析仪的检测器的种类及原理 X射线检测器又称探测器，是种能量转换器，能对光子进行计数。在与光电子作用时，它可以储存每次入射光子的全部能量。光子流越弱，检测器工作的精度越高。目前常用的Ⅹ射线检测器有气体能量转化器、半导体能量转换器和闪烁计数器。 一、气体能量转化器 气体能量转化器也称充气型正比计数器（gas proportion counter ，PC），分为气流型和封闭型两种，气流型适用于轻元素的检测，而封闭型常用于高原子序数的元素，探测波长较长。以波长色散谱仪为例，气流型和封闭型充Xe气的正比计数管常常串联使用以提高Ti ~ Cu的K系线和La ~ W的L系线的灵敏度。气流型正比计数管通常用90%氩气和10%甲烷混合气体，其中甲烷起猝灭作用。对于原子序数很低的元素也可以用96%氦气和4%丁烷混合气体。封闭型正比计数管则可分别充氖、氪和氙气。 二、闪烁计数器 闪烁计数器适用于重元素的检测。闪烁计数器结构是由一片用tuo激活的且密封于Be窗口的dianhuana晶体和光电倍增管组成。当一入射X射线光子被Na晶体吸收时，便产生若千个数量的可见光子（闪烁），可见光子轰击光电倍增管，产生光电流。因此，每个入射X射线光子能在光电倍增管的输出端形成一个很大的脉冲电流。 闪烁计数器用于测量大于6kcV的X射线，对于低于6keV的X射线光子，由于光电倍增管极的噪声脉冲较大，对弱光子脉冲的检测会很困难。在闪烁计数器前附加一个气体正比计数器构成复合检测器，这时长波长的X射线用正比计数器检测，短波长的X射线则由闪烁计数器检测。闪烁计数器装在气体正比计数器旁边，缩短了它与晶体之间的距离达三倍，有效地提高了灵敏度， 三、半导体能量转换器 能量色散荧光光谱仪通常采用半导体能量转换器。硅中掺入少量的其他元素可形成晶体二极管。当探测器加上300~400V的电压时，无电流通过。当一个X射线光子射
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供 检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 1.紫外可见吸收检测器(ultraviolet－visibledetector，UVD) 紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。 (1)紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽 (190nm～800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。
局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 (2)光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector，PDAD) 也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。 单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。 2．荧光检测器(fluorescencedetector，FD) 荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测
荧光粉通用测试方法 1 水溶性氯化物的测定 1.1仪器 架盘天平：感量为0.1g； 烧杯：100m1； 比色管：25m1或50m1。 1.2 试剂和溶液硫酸锌溶液：5%，称取5.0g分析纯硫酸锌，用去离子水稀释至100m1，摇匀。 硝酸：5N，按GB 603—77《化学试剂制剂及制品制备方法》配制。 硝酸银：0.1N，按GB 603—77配制。 氯化物标准液：见GB 602—77《化学试剂杂质标准液制备方法》。 1.3 测定 称取2.0g试样，放人烧杯中，加入20m1去离子水及l一2滴5%硫酸锌溶液，加热至沸，冷却至室温。然后用定性滤纸过滤，乳液盛于比色管中，并用少量热去离子水洗涤滤渣2或3次，洗液并人滤液中，用去离子水稀释至25ml。加0.5ml 5N硝酸及2ml 0.1N硝酸银，摇匀，放置10min，所呈浊度不应大于标准。 标准是按产品技术标准要求取一定数量的氯化钠标准液，加入1—2滴5%硫酸锌溶液，用去离子水稀释至25m1后，与试样同时同样处理。 2 机械杂质的测定 称取10g试样，在白色瓷板上摊开，用目测或放大镜观测。 3 密度的测定 3.1 定义 单位体积荧光粉的质量，称作密度。 3. 2 仪器分析天平：感量不小于0.00lg； 温度计：分度不大于0.5℃， 比重瓶：25m1或50ml。
3.3 测定步骤3.3.1 称量比重瓶。 3.3.2 将3-5g干燥的试样，放入比重瓶中，称量。 3.3.3 往瓶中注入约2/3体积的去离子水，排除气泡，再注满水，并擦干瓶的外表面，称量。然后测量瓶中的水温t 。 3.3.4 将比重瓶洗净，用相同温度的去离子水注满比重瓶，擦干瓶的外表面，称量。 3.4 计算 荧光粉密度按式(1)计算： 计算结果取至小数点后两位。 每个试样做两次，平行结果之差不应大于0.02，取算术平均值。 4 粒度分布的测定4.1 定义 荧光粉颗粒的数目或团粒的重量按粒径的分布，称作粒度分布。 4.2 测定方法 4.2.1 观察法 取少量试样，分散在载片上，用显微镜按垂直投影法依次测量单个颗粒的尺寸。每批试样的颗粒读数不应少于300粒。 4.2.2 沉降法 4.2.2.1 仪器 粒度分布测定仪： 要求测定范围从l—100μ，误差不大于3%。 4.2.2.2 测定 按仪器规定的要求将一定量的试样放人搅拌器内，按产品技术标准的要求加入不同的分散溶液，搅拌一定时间后，立即用仪器进行测定(具体操作按不同仪器测定方法的要求进行)，记录试样在不同粒径的累积重量曲线。 4.3 粒度分布的表示方法 4.3.1 百分比表示法一定粒径间隔内荧光粉的重量(或颗粒数)对总量之比，用百分数表示。 4.3.2 对数正态分布参数表示法
2475荧光检测器更换CPU Board 电池 如果2475主板的电池没电，开机会报错，提示诸如PMT not calibrated 或者Units not normalized。与2487主板电池没电不同，2475电池没有电以后，仪器是无法正常工作的。所以要尽快更换之。 更换所需要的工具有：T20，小扳手，十字螺丝刀。事先购得的电池。 步骤如下： 1. 关闭检测器。并拔下电源线。 2. 用十字螺丝刀将检测器两侧的4个螺丝拧开，将检测器顶盖稍后推数厘米，然后上移，取下顶盖，置 于平稳之处。 3. 更换电池。此时有两种方式可选： i. 直接将手深入检测器内部，从板上将电池拔下，直接更换。此方法直接，但是对操作人员的技 术有较高要求。稍有不慎，可能会将新电池的插脚折断，或者用力过猛时导致碰到电路板的其 他地方。 ii. 将电路板(CPU board)拆下后更换电池，具体操作： l将检测器后部的I/O信号连接器拔下。 l用小扳手将固定IEEE接口的两个螺丝（黑色六角形）拧下。 l用T20 将固定电路板的两个螺丝拧松。注意，这两个螺丝是固定在机壳底部的，不必拆下，拧松即可。 l沿着电路板底部的螺丝固定槽方向后推，直至可以完全将电路板取出。此时注意电路板上的连线，如果觉得取出有困难，可以适当拔下几个插槽上的连线。可能需要拔下在电路板的靠 近检测器后部的风扇插头。 l观察电池的摆放方向。将电池取下，必要时可以借助其它工具，轻轻将其撬动后拔下。 l将新电池从外包装内取出，注意方向――错了将不能装上，并且可能将插脚折断――安装到电路板上，并用手将其压紧，防止接触不良。 l恢复拔下的连线，将电路板复位，拧紧固定螺丝，接上仪器后部的I/O信号连接器，并用小扳手将固定IEEE接口的两个螺丝装好拧紧。 4. 将机盖复位。插上电源线。 5. 开机。 6. 拆下色谱柱，用洁净、脱气过的水做流动相，以1ml/min的流速冲洗至少15min。 7. 按面板上的Diag 键，进入诊断菜单中的service模式，选择“calibrate PMT”。稍后在液晶屏上出 现PMT校正结果。相关系数应至少大于0.999，然后转到步骤8。如果未能达到，继续用水冲洗流动池。 8. 开机并冲洗约1小时以后，在Diag菜单中选择“Normalize Units”，注意此时继续保持流速。如 果归一化的结果无误，则出现以下画面，进入步骤9。
R esearch Progress of Cooling System for Modern V ehicle Engine CH EN G Xiao 2bei ,Pan Li ,J V Hong 2ling (School of Energy &Power Engineering ,Huazhong University of Science &Technology ,Wuhan 430074,China ) Abstract :The development status ,influencing factors and existing problems of cooling system were briefly analyzed ,and the f ront design concept and research method like the intelligent electronic 2controlled coolin g ,precise cooling ,split cooling ,air 2side flow and vehicle thermal management for engine cooling system were also introduced.The hig h efficiency and low consumption realized with modern engine cooling system were discussed ,it was pointed out that the integration of precise cooling and split cooling with electronic 2controlled elements was the feasible method ,and the vehicle thermal management would be the main method to improve the cooling performance entirely. K ey w ords :automobile engine ;cooling system ;intelligent control ;thermal management ;prediction of development trend [编辑:潘丽丽] 收稿日期:2007210218;修回日期:2008201211 作者简介:马 骁(1983— ),男,四川省荥经市人,在读博士,主要研究方向为内燃机燃烧的激光诊断;max @https://www.doczj.com/doc/a37576070.html, 。激光诱导荧光法用于内燃机燃烧可视化的研究进展 马 骁,何 旭,王建昕 (清华大学汽车安全与节能国家重点实验室,北京 100084) 摘要:阐述了激光诱导荧光法用于内燃机可视化的基本原理。结合研究实例中典型的试验装置重点介绍了激光诱导荧光法在内燃机可视化研究中的应用情况,包括燃烧组分和温度场的激光诱导荧光测量、高度挥发性燃料的喷雾与混合气形成的平面激光诱导荧光法测量以及内燃机喷雾中气液两相的复合激光诱导荧光测量。 关键词:内燃机;激光诱导荧光;可视化;混合气形成;喷雾 中图分类号:T K464 文献标志码:A 文章编号:100122222(2008)0120007207 近年来控制汽车尾气排放和燃油经济性的法规 日益严格,对内燃机的研发,尤其是在缸内混合气组织、燃烧控制方面提出了更高的要求。可视化技术能够直观地提供缸内混合气形成和燃烧状态的信息,,因而可视化研究作为内燃机基础研究的重要一环一直受到国内外内燃机界的重视。 以激光诱导荧光(L IF )法为代表的现代光学诊断方法用于内燃机可视化技术是近年来的研究热点。L IF 法可以以非侵入的形式定量测量主要污染物及中间产物浓度分布、流场温度、混合气浓度分布等参数,采用不同的试验装置可以进行单点、一维、二维及准三维的测量[1],是一种灵活而有效的测试手段。随着激光器、增强型电荷耦合器件(ICCD )及光电倍增管等技术的不断发展,L IF 法正被更多的 研究者用于内燃机可视化研究。 1 L IF 法的基本原理 当激光光子的能量(表征为波长λ)符合分子特 定两个能级之间能量间隔时,受照射分子可以吸收光子从基态跃迁至高能态。由于处于高能态的分子不稳定,故在一定时间内受激分子将通过辐射和非辐射的方式释放能量返回基态,在此过程中分子的自发辐射发光称为荧光。荧光的特性随荧光物质的种类、环境温度、压力以及周围物质氛围的不同而呈现出较大的差异[2]。在满足一定条件时,通过荧光的强度可以得到包括浓度、温度、组分在内的多种物理参数。 在用L IF 法进行内燃机可视化研究中,作为观察对象的受激分子通常是以NO 为代表的燃烧产物 第1期(总第173期)2008年2月车 用 发 动 机V EHICL E EN GIN E No.1(Serial No.173) Feb.2008
检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 1.紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD） 紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。 （1）紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190nm～800nm）。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。 局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 （2）光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PDAD） 也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。 单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。 2．荧光检测器（fluorescence detector，FD） 荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。 3. 示差折光检测器（differential refractive Index detector，RID） 示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。
LIF测量原理 一、光致发光物理基础 发光可以定义为原子或分子从激发态到较低能态经历的辐射发射过程。如果激发态是通过吸收入射辐射产生的，那么源于这种激发态的发射就称为光致发光。 1. 分子轨道理论 根据分子轨道理论，两个原子轨道结合时既可以形成成键分子轨道（bonding molecular orbit），又可以形成反键分子轨道（anti-bonding molecular orbit）。基态时分子中的电子占据成键轨道，有机分子中原子间电子云以头碰头形式形成的单键分子轨道叫做σ轨道，相应的电子叫σ电子；肩并肩形式形成的分子轨道叫π轨道，相应的电子叫π电子。相应的反键轨道分别用σ*和π*表示。另外还有很多物质还含有非键轨道（non-bonding electron），即未共用电子或孤电子对，用n表示。当吸收一定能量后，一定能级之间的电子可发生下图所示的四种跃迁：σ->σ*、n->σ*、n->π*、π->π*。 σ* 反键轨道 π* 反键轨道 n 非键轨道 π成键轨道 σ成键轨道 分子轨道及电子能级跃迁 2. 单线态和三线态 电子的自旋状态可以用自旋多重度表示，对于基态的原子，对于一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反的自旋方向，因此自旋多重度总等于1，称为单线态；当一个电子被激发到能量较高的电子态时，激发态可能是单线态，也可能是三线态。从单线态激发称为三线态的概率是相当低的，较单线态要低若干个数量级，三线态的寿命比单线态长得多。 3 激发光谱和发射光谱 荧光现象属于光致发光，涉用到两种辐射，即激发光（吸收）和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。这是荧光定性和定量分析的基本参数及依据。 1）激发光谱 通过测量荧光体的发光通量（即强度）随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法，是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光体，发出的荧光通过固定
1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。
1.磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于 细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 AnnexinV可以与多种荧光标记链接 Annexin V-Biotin
Annexin V-Cy3 Annexin V-Cy5 Annexin V-EGFP Annexin V-FITC Annexin V-PE Annexin V-PE-Cy5 2.线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子 均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123（Ex：507nm；Em：529nm）、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）](Ex：482nm；Em：504nm)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)、MitoCapture tm（EX:488nm;Em:530nm+30nm）、等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 3.TUNEL法细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端， 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。 4.荧光分析Caspase-3活性Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。 活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
三种荧光定量PCR检测方法比较 定量pcr：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类： (1) SYBR Green I 检测模式 SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA 结合后， 荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA 相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。 (2) 水解探针模式(taq man探针) TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射释放随着扩增循环数的增加，一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。荧光。． 出来的荧光基团不断积累。因此Taqman 探针检测的是积累荧光。PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
荧光分析法 原理：根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，具有吸收光子能力的 物质在特定波长光（如紫外光）照射下可在瞬间发射出比激发光波长长的光，即荧光。荧光强度与物质浓度的关系可表示为：I=kC，因此紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。 两种测定方法： 直接测定法:利用物质自身发射的荧光进行测定分析。 间接测定法：由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，这种络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。 不管是直接测定，还是间接测定，一般的采用标准工作曲线法，取各种已知量的荧光物质，配成一系列的标准溶液，测定出这些标准溶液的荧光强度，然后给出荧光强度对标准溶液的浓度的工作曲线。在同样的仪器条件下，测定未知样品的荧光强度，然后从标准工作曲线上查出未知样品的浓度（即含量）。 一般常用的荧光分析仪器有：目测荧光仪（荧光分析灯），荧光光度计和荧光分光光度计三种。 荧光分析是一种先进的分析方法，它比电子探针法、质谱法、光谱法、极谱法等都应用的较广泛和普及，这同荧光分析具有很多优点分不开的。荧光分析所用的设备较简单，如目测荧光仪和荧光光度计构造非常简单完全可以自己制造。比起质谱仪、极谱仪和电子探针仪来它在造价上要便宜很多倍，而且荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便。同时具备这三大特点的仪器并不多. 激光诱导荧光分析（LIF） 激光的特点：亮度高，方向性好，单色性好，相干性好 仪器组成：与普通的荧光检测器一样，激光诱导荧光检测器主要由光源、光学系统、检测池和光检测元件组成，两者最重要的区别是激光诱导荧光检测器的光源是激光器。 激光器：激光器是激光诱导荧光检测器的重要组成部分，用脉冲激光为光源，采用时间分辨技术可消除瑞利散射光（半径比光或其他电磁辐射的波长小很多的微小颗粒对入射光束的散射）和拉曼散射光（光波在被散射后频率发生变化）对测定的干扰，同时增加被测成分之间测定的选择性。以上这些特性使激光诱导荧光检测器的信噪比大大增强，显示出最高的灵敏度和较好的选择性。
我对荧光检测器的认识 荧光检测器是高效液相色谱仪常用的一种检测器。其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多。能发射荧光的物质或能用柱前或柱后衍生法转变成荧光衍生物的物质均可以使用荧光检测器进行分析。极高灵敏度和良好选择性是它最大的优点，因而在某些领域如药物和生化分析中起着不可替代的作用。 一、工作原理 在实验条件固定时，荧光强度与样品浓度呈线性关系，因此可直接用于定量分析。它属于浓度型检测器，可用于梯度淋洗。 二、荧光检测器的光路 由激发光源发出的光通过透镜和滤光片得到特定波长的单色光，再经透镜聚焦在流通池上，组分吸收光能量后发射的荧光经过透镜和滤光片，光电倍增管在与激发光成90度的方向对特定波长的荧光进行检验。 三、优缺点 优点：○1选择性高，只对荧光物质有响应。○2灵敏度高，荧光检测器的灵敏度比紫外-可见光检测器的灵敏度约高两个数量级。最低检出限可达10-13g/ml，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析，也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。○3线性范围较宽。虽然比紫外吸收检测器窄，但对大多数痕量分析，该线性范围已足够宽。○4受外界条件的影响较小。 缺点：○1与紫外-可见光检测器相比，应用范围较窄。因为不是所有的化合物在选择的条件下都能发生荧光，所以荧光检测器不属于通用型检测器。○2对通
常发生在荧光测量中的一些干扰非常敏感，如背景荧光和猝灭效应等。 四、应用 近年来，荧光衍生试剂衍生化后高效液相色谱分离以检测多种化学与生物分子的方法已经广泛应用于临床、医药、食品、环保、生物化学等方面。 例如：尿中单萜醇、苹果饮料中的氨基甲酸乙酯、中药中的赭曲霉毒素A、玉米中的玉米赤霉烯酮、咖啡中赭曲霉毒素A、血清中的芳香族氨基酸、食品残留的喹诺酮类药物、猪肌肉中的多巴胺、花生油中游离脂肪酸、动物肝脏中10种喹诺酮类药物残留、血浆中羧甲司坦、血浆中硫酸阿米卡星、黄酒中尿素含量、血清犬尿氨酸和色氨酸等等。 由此我们可以看出，检测器的选择是实验分析的重要环节之一，在以后的实验学习中，我们要统筹考虑检测器的工作原理，适用范围，优缺点等等，借鉴他人的经验以选择合适的检测器对待测物进行分析。
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析检测器的作用就是将柱流出物中样品组成与含量的变化转化为可 供检测的信号,常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 1、紫外可见吸收检测器(ultraviolet－ visibledetector,UVD) 紫外可见吸收检测器(UVD)就是HPLC中应用最广泛的检测器之一,几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点就是灵敏度较高,线性范围宽,噪声低,适用于梯度洗脱,对强吸收物质检测限可达1ng,检测后不破坏样品,可用于制备,并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似,实际上就就是装有流动地的紫外可见光度计。 (1)紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源,氘灯则发射出紫外-可见区 范围的连续波长,并安装一个光栅型单色器,其波长选择范围宽 (190nm～800nm)。它有两个流通池,一个作参比,一个作测量用,光源发出的紫外光照射到流通池上,若两流通池都通过纯的均匀溶剂,则它们 在紫外波长下几乎无吸收,光电管上接受到的辐射强度相等,无信号输出。当组分进入测量池时,吸收一定的紫外光,使两光电管接受到的辐射强度不等,这时有信号输出,输出信号大小与组分浓度有关。
局限:流动相的选择受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶 剂不能做流动相,每种溶剂都有截止波长,当小于该截止波长的紫外光 通过溶剂时,溶剂的透光率降至10%以下,因此,紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 (2)光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector,PDAD) 也称快速扫描紫外可见分光检测器,就是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件,构成多通道并行工作,同时检测由光栅分光,再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号,然 后对二极管阵列快速扫描采集数据,得到吸收值(A)就是保留时间(tR) 与波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据,从而迅速决定具有最佳选择性与灵敏度的波长。 单光束二极管阵列检测器,光源发出的光先通过检测池,透射 光由全息光栅色散成多色光,射到阵列元件上,使所有波长的光在接收 器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号学的方法快速扫描提取出来,每幅图象仅需要10ms,远远超过色谱流出峰的速度,因此可随峰扫描。 2.荧光检测器(fluorescencedetector,FD) 荧光检测器就是 一种高灵敏度、有选择性的检测器,可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物,再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0、1ng／ml,适用于痕量分析;一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级,但其线性范围不如紫外检测
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类 完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应