中国农业科学 2007,40(10):2361-2367
Scientia Agricultura Sinica
遗传转化过程中水稻愈伤组织的内源植物激素变化动态研究
刘 清1，朱允华2，吴 顺1，沈革志3，萧浪涛1
（1湖南农业大学湖南省植物激素与生长发育重点实验室，长沙 410128；2南华大学生命科学与技术学院，衡阳 421001；
3上海市农业科学院作物所，上海 201106）
摘要：【目的】通过对遗传转化过程中水稻愈伤组织本身的3种内源激素含量变化动态研究，探讨水稻愈伤组织生长发育过程中内源激素变化规律和激素间的相互关系，旨在为水稻遗传转化体系中合理使用植物生长物质提供参考依据。【方法】以广粳1号、特青、V20B为遗传转化供试材料，采用高效液相色谱法（HPLC）测定了遗传转化过程中4个主要时期愈伤组织中的内源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）和玉米素核苷（Z）的含量。【结果】IAA主要存在于种胚诱导出的愈伤组织上及芽中，且过高的IAA含量不利于愈伤组织的诱导和生长；Z主要存在于种胚中，对愈伤组织诱导的启动有决定性作用，如果外植体中的Z含量太低，即使有较高的IAA含量也不能诱导出愈伤组织；过高的ABA对愈伤组织的诱导不利，但在继代培养时适量升高ABA含量有利于胚性愈伤组织的形成。
【结论】内源激素对愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响，其种类、含量及协调平衡是水稻愈伤组织形成和分化的关键。同时，诱导培养基中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度与水稻愈伤组织培养物中的培养力（愈伤组织质量，芽长和诱导率）有一定的相关性，且在培养基中加入2,4-D等生长调节剂类物质会对愈伤中的内源激素含量有一定的影响。
关键词：内源激素；2,4-D；水稻；愈伤组织；高效液相色谱
Studies on the Content Changes of Endogenous Phytohormones in Rice Calli for Genetic Transformation
LIU Qing1, ZHU Yun-hua2, WU Shun1, SHEN Ge-zhi3, XIAO Lang-tao1
(1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;
2 College of Bioscience and Biotechnology Nanhua University, Hengyang 421001; 3Crop Institute, Shanghai Academy of Agricultural
Sciences, Shanghai 201106)
Abstract: 【Objective】In order to provide some reference frames for rational utilization of phytohormones or plant growth regulators in tissue culture, the dynamic changes of endogenous phytohormones in rice calli from four main processes of genetic transformation were studied. 【Method】Using Guangjing No.1,Teqing and V20B as materials,endogenous ABA,IAA and Z in rice calli in four main stages of genetic transformation were analyzed by HPLC. 【Result】IAA was found to be more abundant in the callus buds than in the mature embryos. High content of IAA reduced callus induction and growth. Z was found to be mainly existed in seed embroys, being crucial for callus induction. Calli could not be induced when Z content was too low, even the IAA levels were relatively high. High content of ABA was negative to callus induction,but might increase embryogenic callus in the process of callus regeneration. 【Conclusion】The kinds, contents and harmonious balance of endogenous phytohormones are key factors to callus induction and differentiation for rice. The concentration of 2,4-D could influence the culture’s strength of callus and the levels of endogenous phytohormones.
Key words: Endogenous; Phytohormones; 2, 4-D; Rice; Calli; HPLC
收稿日期：2006-07-03；接受日期：2006-11-14
基金项目：国家自然科学基金项目（30600049，30670190）、湖南省科技应用基础研究计划重点项目（2007FJ3003）、湖南省科技计划项目（06FJ3079）作者简介：刘清（1974-），男，湖南茶陵人，研究方向为植物生理学。Tel：0731-*******-8000；E-mail：lqing2003@https://www.doczj.com/doc/ac4220351.html,。通讯作者肖浪涛（1963-），教授，研究方向为植物生理与分子生物学。E-mail：ltxiao@https://www.doczj.com/doc/ac4220351.html,
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0 引言
【研究意义】转基因技术在水稻遗传改良上已经有很多的研究报道[1~5]。其中采用较多的是农杆菌介导法，该转化体系以获得高质量的水稻愈伤组织为前提，而在影响水稻愈伤组织质量的诸多因素中[6~8]，植物激素有着极其重要的影响，且外源植物生长物质除直接作用外还可通过影响植物内源激素水平来发挥作用[9,10]。【前人研究进展】组织培养中常用的外源激素有2，4-D、6-BA、KT、NAA和IAA等。在进行组织培养时，籼稻比粳稻要求更高的激素水平[11]。培养基中添加外源激素的种类和含量对愈伤组织的质量有着重要的影响[12]。但人们对植物组织培养过程中外源生长物质的添加往往只是凭经验进行，一般很难达到预期目标。随着内源激素检测手段的不断改进，国内外科学工作者近年来已对植物组织培养过程中内源激素的变化，内源激素对培养过程中脱分化、分化及再生的作用以及内源激素与外源生长物质之间的关系进行了研究，结果表明内源IAA、GA、ABA、多胺等对愈伤组织形成和分化有着重要作用[13,14]。【本研究切入点】内源激素与植物生长调节剂在调节愈伤组织体细胞的作用上具有密切的关系。因此，在进行组织培养时，不仅要考虑外源植物生长物质的种类和配比，还要注意外植体及各阶段愈伤本身的内源激素的含量变化。【拟解决的关键问题】本试验对水稻遗传转化过程中内源激素含量的变化动态进行研究，探讨愈伤组织生长发育与各内源激素变化规律间的相互关系，旨在为水稻遗传转化体系中根据所培养材料自身内源激素含量情况而有针对性地合理使用植物生长物质提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株以及主要试剂
带目的基因和抗性基因的载体由上海植物生理生态研究所王宗阳研究员惠赠，经冻融法，融合于根癌农杆菌菌株EHA105。
IAA、Z和ABA激素标样（Fluka公司产品），聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝胶（DEAE），色谱纯乙腈和三乙胺。
1.2 供试材料
水稻品种广粳1号、特青、V20B均由湖南农业大学水稻科学研究所严钦泉研究员提供。参照Hiei等[15]的方法进行水稻遗传转化，在愈伤组织诱导、继代、抗性筛选以及分化这4个阶段分别采样，液氮处理、冷冻干燥后于-40℃超低温冰箱保存备用。
1.3 内源激素的测定
高效液相色谱法（HLPC）。激素的提取参照王若仲等[16]方法，稍作修改。准确称取冻干样品的重量，加入预冷的80%甲醇水溶液10 ml，在弱光下冰浴研磨，置4℃冰箱中浸提过夜。4℃，5 000 g离心10 min，收集上清液，残渣加入预冷的80%甲醇水溶液浸提2次，离心后合并上清液，真空冷冻浓缩至干后再用0.1 mol·L-1醋酸铵（pH 9.0）8 ml复溶，4℃，15 000g离心20 min后取上清液。上清液依次经过PVPP、DEAE柱，以Sep-Pak C18柱收集样品的内源激素，用50%甲醇洗脱，真空冷冻浓缩至干。检测时样品用20%的乙腈，80%的0.4%三乙胺溶液（pH3.5）80 μl进行复溶后过0.45 μm滤膜进样。以乙腈和0.4%的三乙胺溶液（pH 3.5）作流动相；起始浓度为100%的三乙胺(pH 3.5)溶液梯度洗脱，6 min后三乙胺溶液为82%，乙腈由0%变为18%，18 min后三乙胺溶液为64%，乙腈达到36%；流速1 ml·min-1；检测IAA的波长为212 nm，ABA、Z为270 nm；柱温35℃，进样量10 μl，根据外标法定量测定IAA、ABA、Z的内源激素含量，结果中各内源激素含量数值为2次平行样的均值。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导时期的内源激素含量情况
2.1.1 不同生长状况愈伤组织中的内源激素水平前人研究表明，2，4-D是水稻等禾本科植物组织培养中一种有效的生长素类调节剂[8,17,18]，在合适的2，4-D 浓度下，添加其它外源生长物质虽能够改善愈伤组织的胚性状态、提高愈伤组织的质量，但不能显著提高愈伤组织的诱导率[9,19]。水稻的幼胚和成熟胚在进行愈伤组织诱导时，一般是先长出小芽，然后才启动愈伤组织的诱导，萌芽率的高低是外植体培养力强弱的反映，但芽的过分生长不利于愈伤组织的诱导。本试验中利用不同质量浓度的2，4-D（0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1）处理水稻成熟胚和幼胚，使其诱导出具有不同生长状况（芽长，诱导率，每100个愈伤组织重量）的愈伤组织，分别采样测定其内源激素的含量，详见表1和表2。
成熟胚经不同浓度2，4-D处理（表1），粳型稻广粳1号在2，4-D质量浓度为2.0 mg·L-1时愈伤组织的诱导率高且胚性较好，而籼型稻特青的愈伤组织诱
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导率高、胚性好时的2，4-D 质量浓度为2.5 mg·L -1，内源激素含量分析表明，在外源2，4-D 为0时广粳1号的水稻愈伤组织内源激素IAA 、ABA 含量都明显高于特青，反映出不同基因型水稻间的内源激素含量存在较大差别，这可能是造成不同品种水稻材料在进行愈伤组织诱导时所需最适2，4-D 浓度不同的原因。数据分析表明，2，4-D 对愈伤组织的芽长影响显著（P =0.0011）；内源激素含量与愈伤组织培养力相关性分析表明，广粳1号愈伤组织内源IAA 、ABA 的含量对愈伤组织诱导率有负效应（分别为R =-0.8857，P =0.0456和R =-0.7024，P =0.1860），而对愈伤组织的芽长表现出正相关性（分别为R =0.7891，P =0.1126和R =0.8858，p =0.0455）。特青愈伤组织诱导率与内源ABA 的含量呈负相关性（R =-0.5267，P =0.3619），
内源IAA 、ABA 、Z 对特青愈伤组织芽的生长都有促进作用（分别为R =0.8117，P =0.0953和R =0.7220，P =0.1684以及R =0.9699，P =0.0062）。
特青、广粳1号的幼胚经不同浓度2，4-D 处理后（表2），同品种内的芽长和每100个愈伤组织培养物的重量相差不大，但品种间差异显著（分别为P =0.0001和P =0.0071）。相关性分析表明：特青每100个愈伤组织重量与Z 含量负相关（R =-0.9403，P =0.0152），特青愈伤组织上的芽长与ABA 的含量呈正相关性（R =0.8235，P =0.0866），而与IAA 、Z 含量呈负相关（R =-0.6540，P =0.2312和R =-0.5671，P =0.3188）；内源激素ABA 对广粳1号愈伤组织培养物重量有正效应（R =0.6096，P =0.2750），而对芽长产生抑制作用（R =-0.7591，P =0.1367）。
表1 2，4-D 浓度对成熟胚愈伤组织诱导的影响
Table 1 The influence of different 2,4-D concentration on callus induction of mature embryos
诱导率(%)
芽长 (cm) IAA (nmol·g -1) ABA (nmol·g -1) Z (nmol·g -1)
2,4-D -1特青 Teqing
广粳1号 Guangjing No 1 特青 Teqing 广粳1号 Guangjing No 1
特青 Teqing 广粳1号 Guangjing No 1特青 Teqing 广粳1号 Guangjing No 1
特青 Teqing 广粳1号 Guangjing No 1
0 0.60 0.69 0.43 1.20 0.47 1.00 0.133 0.024 0.007 0.026 1.0 0.62 0.85 0.32 0.99 0.96 2.22 0.053 0.105 0.009 0.047 1.5 0.60 0.83 0.24 1.10 0.91 0.32 0.038 0.027 0.012 0.140 2.0 0.55 0.92 0.28 0.90 0.54 0.29 0.098 0.092 0.030 0.109 2.5
0.57
0.78
0.25
1.10
1.19
0.51
0.050
0.087
0.024
0.130
2.1.2 愈伤组织诱导培养物上不同部位的内源激素水平 籼稻特青的成熟胚在诱导培养基上培养6 d 后按如下4种方式对培养物的不同部位分别取样：未能诱导出愈伤组织的种胚、诱导出了愈伤组织的种胚（包括种胚、愈伤组织及芽）、去除愈伤组织和芽后的种胚、去除种胚和愈伤组织后的芽。测得内源激素含量
如图1。从图可以看出，各内源激素含量在培养物的不同部位上存在明显的差异性：IAA 主要存在于芽中而去除愈伤组织后的种胚中比较少，但在诱导出了愈伤组织和未能诱导出愈伤组织的种胚中含量相差不明显；Z 主要存在于剥离的种胚中而芽中的含量相对较少，且在诱导出了愈伤组织的种胚中的Z 含量远高于
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未能诱导出愈伤组织种胚；ABA在未能诱导出愈伤组织的种胚中的含量高，而诱导出了愈伤组织的种胚中的含量少且主要存在于芽中。从所测定的3种内源激素的含量及分布特性可知过高的ABA含量对愈伤组织的诱导不利，IAA含量对维持较高培养力有着重要作用，但如果诱导愈伤组织的外植体中的Z含量太低，即使有较高的IAA含量也不能诱导出愈伤组织，说明Z含量是决定愈伤组织诱导启动与否的关键。
1：未能诱导出愈伤组织的种胚；2：去除愈伤组织后的种胚；3：去除种胚后的芽；4：诱导出了愈伤组织的种胚
1: Seed embryo without induced callus; 2: Seed embryo that stripped of callus; 3: Buds; 4:Seed embryo with induced callus
图1 诱导愈伤组织培养物的不同部位内源激素含量
Fig. 1 The content of endogenous phytohormones in different parts of inducing explant
2.2 愈伤组织继代过程中内源激素含量的变化
有研究表明，愈伤组织培养时间的长短对植株再分化率有影响[20]。为了探明愈伤组织在继代培养过程中内源激素的变化特性，在水稻品种V20B的成熟胚诱导出愈伤组织后，将愈伤组织从盾片剥离进行继代培养，每隔6 d采样测得内源激素含量如图2。水稻愈伤组织继代培养时，0～12 d为快速生长期，12～24 d 生长速度变慢，部分愈伤组织还出现了长根的现象，24 d以后开始老化直至褐化。在此过程中，IAA含量在整个继代培养中始终维持较高的水平，最高值与最低值相差不大；内源激素ABA含量的变化随着IAA 的升高而迅速升高，IAA降低时ABA也迅速降低，ABA与IAA的含量之间存在一定的相关性（R=0.5469，P=0.2615），罗琼等[9]认为内源IAA过高影响愈伤组织培养力的表达，而ABA可以减小这种不利影响。Z含量在前期呈上升趋势，第18天时达到最高值，而后急剧下降，第24天时达到较低值，但在第30 d时又有所回升，而后又急剧下降，Z含量的变化幅度与趋势和此时愈伤组织正在进行的生理生化反应密切相关，在前期愈伤组织处于旺长期，需要较高的Z以维持细胞的快速分裂，而后愈伤组织的生长速度减缓，Z含量相应的降低，但在愈伤组织老化过程中会伴有长根长芽的情况，此时又需要较高含量Z 以促进分化，30 d以后愈伤组织褐化严重，愈伤组织生理活性减弱，使得各内源激素的含量都有下降趋势。
图2 继代培养不同时间愈伤组织中内源激素的含量
Fig. 2 The content of endogenous phytohormones in calli at different stages of secondary culture
2.3抗性筛选过程中愈伤组织培养物的内源激素含
量
抗性愈伤组织的再生能力是转化频率高低的决定因素，取广粳1号和特青经过14 d抗性筛选后的愈伤组织测定内源激素含量如图3。ABA含量在两种水稻中相差不大，IAA的含量特青比广粳1号多0.0571 nmol·g-1，Z的含量广粳1号是特青的3倍多。因此，粳型稻广粳1号愈伤组织中的内源细胞分裂素类物质Z的含量相对较高，有利于愈伤组织的增殖与分化，从而使得其愈伤组织的增殖和再生能力比籼型稻特青强，该试验结果为周玲艳等[21]的观点提供有力佐证,他们认为籼型稻的抗性愈伤组织再生能力比粳型稻差是造成籼型稻比粳型稻遗传转化率低的主要原因。
图3 筛选培养中的愈伤组织内源激素的含量
Fig. 3 The content of endogenous phytohormones in calli after selective culture
10期刘清等：遗传转化过程中水稻愈伤组织的内源植物激素变化动态研究 2365
2.4愈伤组织分化培养过程中内源激素水平
水稻品种V20B成熟胚的愈伤组织进行分化培养，每隔3 d采样，测得内源激素含量如图4。愈伤组织分化时首先形成大量的幼芽，随后芽生长成为小植株。IAA在整个分化过程中都保持较高的水平，0～9 d 含量逐渐增高，第9 d达到最高值，以后随着培养时间的延长，IAA的含量呈递减的趋势，这与已报道[22]的大豆愈伤组织分化时观察到的结果完全一样，说明内源IAA水平与愈伤组织的分化和发育紧密相关，并可能起着主导作用；Z含量呈先升后降的趋势，在第12天时达到最大值，此时正是愈伤组织分化最强的时期，表明内源细胞分裂素的高低是影响愈伤组织分化成芽的重要因子；在愈伤组织分化的前期，ABA含量逐渐降低，而在第9～12天时急剧升高，随后又急剧下降，其间ABA/IAA相对比值变化趋势在0～9 d逐渐降低，9～12 d时上升至高峰，此时正是幼芽大量分化时期，说明较高的ABA/IAA相对比值有利于愈伤组织分化形成芽。
图4 愈伤组织分化培养过程中内源激素含量
Fig. 4 The changes of endogenous phytohormones in calli during differential induction
3 讨论
水稻愈伤组织的诱导率和质量除了与品种基因型有关外，还与不同培养基成分尤其是添加外源生长物质的种类和配比有关[1,23,24]。研究表明，在外植体分化与脱分化过程中，内源激素的变化趋势与使用的外源生长物质的种类和含量有一定的相关性[25,26]。因此，探讨水稻愈伤组织生长发育过程中各内源激素变化规律及互作关系，可为水稻遗传转化中有针对性地使用外源生长物质提供依据。
水稻遗传转化过程中，各内源激素有着不同的作用：IAA主要存在于愈伤组织的芽中而剥离后的种胚中比较少，且过高的IAA不利于愈伤组织的诱导和生长，可以通过ABA来消除它的不利影响；Z主要存在于诱导愈伤组织的种胚中，有促进分裂和生长的作用，对愈伤组织诱导时的启动有决定性作用，如果外植体中的Z含量太低，即使有较高的IAA也不能诱导出愈伤组织，籼稻愈伤组织在抗性筛选后愈伤组织中Z含量偏低可能是造成籼稻转化率不高的原因之一，过高的ABA对愈伤组织的诱导不利，但在继代培养时适量升高ABA有利于胚性愈伤组织的形成，愈伤组织分化时较高的ABA/IAA相对比值有利于芽的形成。
罗琼等[9]发现内源生长素的含量相对于内源分裂素过高的水稻品种的愈伤组织培养力较差，在培养基中增加外源KT浓度后其培养力后有所提高，说明可以通过植物生长物质的调整，协调内源激素间的不平衡性而提高培养力，特别是对于那些难培养的或培养力低的材料通过比较其与高培养力的材料之间在内源激素上的差异，通过植物生长物质类的调整有可能获得新的突破。本试验中不同基因型的籼型稻特青和粳型稻广粳1号之间，以及同属于籼型稻不同品种V20B 与特青的相同外植体间内源激素含量相差都很大，意味着在遗传转化时根据试验材料自身的内源激素含量水平有针对性的加入不同类型及配比的外源生长物质有可能获得较高的遗传转化率，是否可行还有待进一步的研究。
目前，水稻特别是籼型稻的遗传转化受愈伤组织胚性差、再生不良等问题的困扰，Abe等[27]发现水稻成熟胚的愈伤组织生长和再生分别由不同的基因控制。只有借助于生物工程等技术对控制水稻愈伤组织的诱导、分化、发育等相关基因的结构、功能进行深入研究，阐明其作用机理，才能找出问题所在。
4 结论
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内源激素对水稻遗传转化愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响，愈伤组织的诱导、继代、抗性筛选、分化等阶段中IAA、ABA、Z 3种激素的含量和所起的作用各不相同，各内源激素的含量和协调平衡对水稻愈伤组织形成与分化有着决定性的作用。在培养基中添加2，4-D等生长调节剂类物质对水稻愈伤组织中的质量、内源激素含量和遗传转化效率有一定的影响。
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（责任编辑赵利辉）