作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1958?1963
https://www.doczj.com/doc/ad3857780.html,/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@https://www.doczj.com/doc/ad3857780.html,
基金项目: 国家烟草专卖局资助项目(国烟科[2005])
作者简介: 马红勃(1983–), 男, 河北邢台人, 福建农林大学作物科学学院硕士研究生, 从事烟草分子生物学研究。
*
通讯作者(Corresponding author): 祁建民, 男, 研究员, 博士生导师, 福建农林大学生命科学学院。E-mail: Qijm863@https://www.doczj.com/doc/ad3857780.html,; Tel & Fax: 0591-********
Received(收稿日期): 2008-03-23; Accepted(接受日期): 2008-05-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01958
烟草SRAP 和ISSR 分子遗传连锁图谱构建
马红勃1 祁建民1,* 李延坤1 梁景霞1 王 涛2 兰 涛1 陈顺辉3 陶爱芬1 林荔辉1 吴建梅1
(1 福建农林大学作物科学学院/生命科学学院, 福建福州350002; 2 福建省顺昌烟草公司, 福建顺昌353200; 3福建省烟草公司, 福建福州350003)
摘 要: 采用烤烟品种台烟7号与白肋烟品种白肋21杂交, 构建了187个单株的F 2遗传作图群体, 利用所筛选的68个能扩增出多态性条带的SRAP 和ISSR 引物, 对F 2作图群体进行PCR 扩增和遗传连锁分析, 初步构建了一张包含26个连锁群、112个(92个SRAP 和20个ISSR)标记位点的烟草遗传连锁图谱。该图谱覆盖长度为1 560.2 cM, 平均图距18.1 cM 。有16个标记未进入连锁群。26个连锁群包含2~20标记不等, 连锁群遗传距离0~291.0 cM 。连锁群上有24.1%的标记出现偏分离, 主要集中在LG1和LG4连锁群上, 其余分散在不同连锁群。该图谱为烟草重要农艺性状的基因定位、以及分子标记辅助选择等研究奠定基础。 关键词: 烟草; SRAP; ISSR; 遗传连锁图谱
Construction of A Molecular Genetic Linkage Map of Tobacco Based on SRAP and ISSR Markers
MA Hong-Bo 1, QI Jian-Min 1,*, LI Yan-Kun 1, LIANG Jing-Xia 1, WANG Tao 2, LAN Tao 1, CHEN Shun-Hui 3, TAO Ai-Fen 1, LIN Li-Hui 1, and WU Jian-Mei 1
(1 College of Crop or Life science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian; 2Fujian Shunchang Tobacco Company, Shun-chang 353200, Fujian; 3Fujian Tobacco Company, Fuzhou 350003, Fujian, China)
Abstract: High-density genetic linkage maps are useful tools for studying genome, phylogeny and evolution, and for mapping and Cloning genes of interest. In this study, a molecular genetic map was constructed with F 2 population consisting of 187 indi-viduals from a cross of flue-cured tobacco cultivar Taiyan 7 and burley tobacco cultivar Bailei 21 by using a total of 513 SRAP primers and 42 ISSR primers. Approximately 58 out of 513 and 10 out of 42 primers, respectively, showed polymorphisms. Each of this polymorphic primers produced at least one scorable polymorphic DNA band which was visible enough for detection and scoring. The map consisted of 26 linkage groups which included 112 (92 SRAP and 10 ISSR) markers, and covered 1 560.2 cM with an average distance of 18.1 cM. Sixteen markers were still unlinked. All 26 linkage groups consisted of 2–20 markers rang-ing in length from 0–291.0 cM. A total of 24.1% distorted markers distributed in the map, mainly concentrated in the LG1 and LG4 linkage groups, and the others were mapped on diverse linkage groups respectively. This map will provide the basis for gene mapping and marker-assisted selection of important agronomic traits in tobacco. Keywords: Tobacco; SRAP; ISSR; Genetic linkage map
DNA 分子标记已广泛应用于植物遗传连锁图谱构建, 烟草分子标记遗传连锁图谱的构建始于
2001年, Lin 等[1]利用RFLP 和RAPD 标记对来自烟草野生种间杂交(N. plumbaginifolia / N. longiflora )
第11期马红勃等: 烟草SRAP和ISSR分子遗传连锁图谱构建1959
的99个F2植株进行遗传连锁分析, 构建了第一张烟草种间杂交的分子标记遗传连锁图; Nishi等[2]利用来自白肋烟品种间杂交(W6×Michinoku)所产生的125个株系的DH群体, 构建了第一张白肋烟AFLP 分子遗传连锁图; 肖炳光等[3]利用烤烟品种Speight G-28和NC2326杂交得到的137个株系的DH群体为作图材料, 利用ISSR与RAPD标记, 构建了第一张烤烟遗传连锁图; Bindler等[4]利用SSR标记对烤烟品种Hicks Broad Leaf和Red Russian杂交产生的186个F2植株进行遗传连锁分析, 构建了第一张SSR 分子标记遗传连锁图。较高密度的分子图谱能有效地应用于烟草不同栽培类型若干数量性状的基因定位、基因图位克隆、比较基因组学和分子标记辅助育种等研究[5]。因此, 进一步构建烟草不同栽培类型高密度的遗传连锁图具有重要意义。
迄今, 国内外尚未见烤烟与白肋烟品种间杂交构建(栽培类型间)的遗传连锁图谱的报道。就分子标记而言, 烟草种内杂交遗传多态性相对较低, 而种间杂交则存在F1代不育或者F2代发生严重的偏分离现象, 因此烟草遗传作图有较大难度和局限性。现有的烟草分子连锁图谱的位点密度和分布均匀度还远不够。SRAP标记是Li和Quiros[6]发展起来的新型标记, 该标记通过独特的引物设计, 通过上游和下游引物的自由组合, 大大降低引物合成成本, 近年来在众多作物上成功应用, 非常适合遗传图谱的构建。本研究采用SRAP和ISSR标记, 在烟草种质资源分子标记分析的工作基础上, 选用遗传距离较大、亲缘关系较远、相对性状有明显差异的烤烟与白肋烟不同栽培类型品种(台烟7号和白肋21)进行亚远缘杂交, 建立了F2作图群体, 初步建成烤烟与白肋烟(栽培类型间)的分子标记遗传连锁图。
1材料与方法
1.1群体构建
在百份烟草遗传多样性与亲缘关系SRAP和ISSR分子标记分析的工作基础上[7-9], 选用不同栽培类型的烤烟品种台烟7号与白肋烟品种白肋21杂交, F1套袋自交建立了187个单株F2代作图群体, 并构建F2:3群体。台烟7号与其他栽培品种的遗传距离接近于野生种与栽培种的遗传距离, 是遗传作图的较理想品种[7]。
1.2基因组DNA提取
供试亲本及F2群体均在温室漂浮育苗, 在5～6叶期, 每份材料取幼嫩叶片5 g, 利用本研究室改良的CTAB法[7]提取基因组DNA, 即采集足量的烟草嫩叶、抽提时加入β-巯基乙醇、抽提过程中使用2.5% CTAB、最后用预冷的无水乙醇沉淀DNA。
1.3 SRAP分析
SRAP-PCR 扩增总体积20 μL, 其中包括1×buffer [10 mmol L?1 Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol L?1 KCl, 2.3 mmol L?1 MgCl2, 0.08% Nonidet P40], dNTP (各200 μmol L?1), 上下引物各33 ng, DNA模板20 ng, Taq酶1.5 U (Taq酶、1×buffer、SRAP引物和dNTP均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。扩增条件为94℃预变性5 min, 反应前5个循环在94℃ 1 min, 33℃ 1 min, 72℃ 1 min; 随后的30个循环复性温度提高到53℃, 最后72℃延伸5 min, 4℃保存[9]。PCR在PTC-100多功能PCR仪中进行。
采用北京六一仪器厂生产的DYY-5型稳压稳流电泳仪, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。电泳缓冲液为1×TBE, 电泳电压300 V, 时间2.5 h, 银染检测。
1.4 ISSR分析
ISSR-PCR扩增总体积25 μL, 其中包括1× buffer, (10 mmol L?1 Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol L?1 KCl, 1.5 mmol L?1 MgCl2, 0.08% Nonidet P40), DNA 模板20 ng, Taq酶1.5 U, 引物0.18 μmol L?1, dNTP 150 μmol L?1(Taq酶、1×buffer、ISSR引物和dNTP 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。ISSR 反应条件为94℃预变性5 min; 94℃变性45 s, 54℃退火1.5 min, 72℃延伸1.5 min, 41个循环; 72℃延伸7 min; 4℃保存。PCR在PTC-100多功能PCR仪中进行。扩增产物的检测同SRAP分析。
1.5标记命名及连锁分析
采用“引物组合+标记片段长度”的方法对标记进行命名, 如M9E9-540指用SRAP引物组合M9E9扩增出的大小为540 bp的扩增带, U826-860指用ISSR引物UBC826扩增出的大小为860 bp的扩增带, 其近似分子量用100 bp DNA ladder marker (100～5 000 bp)估计。如果该条带白肋21对台烟7号为显性, 则F2代中显性的计为D, 隐性的计为B; 如果该条带白肋21对台烟7号为隐性, 则F2代中显性的计为C, 隐性的计为A。由此得到分子标记的分离数据, 通过卡方测验(χ2)检验标记是否符合3∶1的分离比例。
应用软件Mapmaker/Exp Version 3.0b 在PC计算机上进行连锁图谱的构建。对于符合3∶1分离比
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例的标记, 先用Group命令进行标记间连锁分组(LOD=3.0, 最大距离37.2 cM); 然后在每个连锁群内使用Order和Compare命令进行排序。用Try命令插入不符合3∶1分离比例的标记; 后用Kosambi 函数将重组率转换成图距单位(cM), 用Map命令建立连锁图, 最后用MapDraw V2.1[10]画出连锁图。
2结果与分析
2.1分子标记的多态性
首先以亲本白肋21和台烟7号为材料进行引物筛选, 然后利用筛选出的多态性引物对187个F2代作图群体单株进行分子标记分型分析。在SRAP分析中, 513个引物组合中能在亲本间扩增出多态性的引物组合有108个, 利用这些引物对F2群体进行SRAP分析, 其中58个能在群体中扩增出多态性条带105个, 每个引物组合扩增的多态性条带数1～6个不等, 平均为1.8个。引物M13E7的扩增结果见图1。
图1引物组合M13E7的部分扩增结果
Fig. 1 Parts of amplifications using primer M13E7
M: marker; P1: 白肋21; P2: 台烟7号; 1~19: F2群体单株1~19。
箭头表示多态性片段。
P1: Bailei 21; P2: Taiyan 7; 1–19: F2 plants 1–19.
Polymorphic fragments are indicated by arrows.
在ISSR分析中, 42条引物中有10条能在亲本间表现多态性, 利用这10条引物对F2群体进行ISSR分析, 共产生多态性标记23个, 每条引物扩增出多态性条带数1～4个不等, 平均为2.3个。引物UBC835的扩增结果见图2。
图2引物UBC835的部分扩增结果
Fig. 2 Parts of amplifications using primer UBC835
M: marker; P1: 白肋21; P2: 台烟7号; 1~19: F2群体单株1~19。
箭头表示多态性片段。
P1: Bailei 21; P2: Taiyan 7; 1–19: F2 plants 1–19.
Polymorphic fragments are indicated by arrows.
2.2分子标记的分离分析
在P=0.05水平上的卡平方测验结果表明, 128个分子标记中(23个ISSR标记, 105个SRAP标记), 有31个标记分离不符合孟德尔比例(3∶1), 即表现偏分离(表1), 占标记总数的24.3%, 其中SRAP标记25个占SRAP总标记的23.8%, ISSR标记6个占ISSR总标记的26.1%。这些偏分离的标记中有23个偏向纯隐性带型(74.2%), 其余8个偏向显性(包括纯显性和杂合型)带型(25.8%)。另外还有50对在亲本间表现多态性而在F2群体中不分离并完全偏向某一亲本的引物组合。
表1构建遗传图谱所用的分子标记
Table 1 The molecular markers used for genetic map construction
分子标记Molecular markers
引物(对)数
Number of
primers or primer
combinations
多态性标记数
Number of poly-
morphic markers
偏分离标记数
Number of dis-
torted markers
连锁标记数
Number of linked
markers
未连锁标记数
Number of
unlinked
markers
ISSR 10 23 6 20 3 SRAP 58 105 25 92 13 Total 68 128 31 112 16
第11期马红勃等: 烟草SRAP和ISSR分子遗传连锁图谱构建1961
2.3遗传连锁图谱的构建
利用Mapmaker/Exp Version 3.0b和MapDraw V2.1软件, 将128标记中的112个标记位点定位在26个连锁群上, 覆盖长度为1 560.2 cM, 平均标记数为4.3个, 两个标记间平均图距为18.1 cM, 另有3个ISSR标记和13个SRAP标记未与这26个连锁群连锁。标记位点较多的连锁群为LG1、LG2、LG3和LG4, 分别包含20、10、12和10个标记, 标记数最少的连锁群只有2个。连锁群LG1遗传距离最长, 为291.0 cM, 遗传距离最短的为0 cM, 平均图距最大的连锁群为LG10, 间距为48.6 cM, 平均图距最小的连锁群为LG23和LG26, 间距为0 cM。在31个偏分离的标记中有27个表现出连锁遗传关系, 分布于9个不同的连锁群上, 每个连锁群各包含有1～8个偏分离标记, LG12和LG20群中仅有的两个标记全是偏分离的, 分布在LG4和LG1的偏分离标记明显偏多, 达到6个和8个, 形成了十分明显的偏分离标记密集区。表2和图3显示ISSR标记和SRAP标记在各连锁群中的分布情况, 连锁图中标有*的为偏分离标记。
表2 ISSR和SRAP标记在遗传连锁图上的分布
Table 2 Distribution of ISSR and SRAP markers on genetic linkage map
连锁群Linkage group
长度
Length
(cM)
标记数
Number of
markers
平均图距
Average
distance
(cM)
偏分离标记数
Number of
distorted markers
连锁群
Linkage
group
长度
Length
(cM)
标记数
Number of
markers
平均图距
Average
distance
(cM)
偏分离标记数
Number of
distorted markers
LG1 291.0 20 15.3 8 LG15 28.8 2 28.8 0 LG2 209.0 10 23.2 3 LG16 27.7 2 27.7 0 LG3 192.0 12 17.5 2 LG17 23.3 2 23.2 0 LG4 254.0 10 28.2 6 LG18 18.2 2 18.2 0 LG5 74.9 5 18.7 1 LG19 22.2 2 22.2 0 LG6 73.1 7 12.2 2 LG20 6.8 2 6.8 2 LG7 82.0 3 41.0 0 LG21 8.0 2 8.0 0 LG8 25.0 8 3.6 0 LG22 5.0 2 5.0 0 LG9 20.7 2 20.7 0 LG23 0 2 0 0 LG10 48.6 2 48.6 0 LG24 5.0 2 5.0 1 LG11 41.7 2 41.7 0 LG25 2.7 2 2.7 0 LG12 37.0 2 37.0 2 LG26 0 2 0 0 LG13 35.2 2 35.2 0 Total 1560.2112 18.1 27 LG14 28.6 3 14.3 0 amounts
3讨论
3.1关于烟草遗传连锁图
分子标记遗传连锁图谱构建的理论基础是交换和重组, 分子连锁群的数目应该同相应物种的染色体数目一致[3]。烟草栽培品种有24对染色体, 由于分子标记在染色体上分布的随机性及染色体不同区段交换的异质性, 连锁群上常常会产生较大的间隙, 严重者则出现小片段的连锁群[5]。本研究中有19个连锁群只包括2～4个标记, 在Lin等[1]的研究中有10个连锁群仅包括2~4个标记, 肖炳光等[3]的研究中有17个连锁群仅包括2～4个标记, Bindler等[4]的研究中有2个连锁群仅包括2~4个标记, 表明部分烟草连锁群中还存在相当大的间隙。将分子遗传连锁图谱与经典遗传图联系起来, 并将其归属到相应的染色体上, 是构建一个比较饱和的连锁图谱的重要工作, 有待后续研究进一步深化。目前我们正在对该群体继续应用多种标记复合构图, 将在近期构建出一张分布更均匀和位点密度较高的烟草遗传连锁图谱。
3.2关于SRAP标记
SRAP是一种新型的分子标记, 已经在水稻、棉花、马铃薯、莴苣、油菜和大蒜等作物上研究应用, 具有简便、稳定、中等产率的特点, 在基因组中分布均匀, 适合于基因定位、基因克隆等分子生物学研究[6], 但在烟草上除本研究外, 尚未见其他报道。本研究构建的连锁图只是初步的框架图, 目的是检测SRAP在烟草作图中是否可行。到目前为止, 已构建的4张烟草分子遗传连锁图谱[1-4]应用的DNA 标记主要是RFLP、RAPD、ISSR及SSR, RFLP标
1962 作 物 学 报 第34卷
图3 烟草SRAP 和ISSR 分子遗传连锁图
Fig. 3 SRAP and ISSR molecular genetic linkage map of tobacco
记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点, 但实际操作过程较复杂, 不易实现自动化, 并且DNA 要求高、用量大, 对大群体进行分析的费用高; RAPD 标记操作简便易行, 但易受实验条件影响、重复性差、产率低; SSR 的优点是多态性高, 缺点是必须测定每类SSR 两端序列来设计引物, 这给SSR 标记在植物基因组研究的广泛应用带来了不便[11]; SRAP 和ISSR 是两种很好的标记, 实验操作简单, 重复性好, 有利于遗传作图, 并在其他作物上已成功应用。SRAP 和ISSR 将成为植物研究领域的一种有力工具。
3.3 关于分子标记偏分离
偏分离遗传现象在自然界普遍存在, 烤烟[3]、大
白菜[5]、大豆[12]、甘蓝[13]、高粱[14]等的分子遗传连锁图谱构建中都有表现。在水稻、玉米中已经发现了导致偏分离的雄配子体基因[15-16], 证实偏分离现象与配子体的选择有关。Knox 和Ellis [17]认为环境因素、非同源重组、基因转换和转座因子等也可能是引起偏分离的重要因素。本研究中进入连锁群的112个标记位点当中, 有27个(24.1%)偏离3∶1的分离比例, 比肖炳光等[3]所用的烤烟类型品种间杂交构建的DH 群体(14%)偏分离稍高。本研究 F 2作图群体中出现的偏分离稍高的现象, 可能与我们选用的亲本为烤烟和白肋烟不同栽培类型品种间杂交, 遗传距离相对较远, 以及配子体选择性较强有关。此外, 本研究中还出现很多引物在亲本间表现多态性,
第11期马红勃等: 烟草SRAP和ISSR分子遗传连锁图谱构建1963
在群体中却不分离, 偏向某一亲本的现象, 这可能与群体类型、非同源重组、群体大小、标记类型等有关, 其分子遗传机理有待进一步研究。
4 结论
构建了烤烟×白肋烟的分子标记遗传连锁图, 丰富了烟草遗传连锁图谱构建的类型, 初步证实了SRAP和ISSR是烟草作图上的一种有力工具。该图谱112个标记位点分布于26个连锁群, 覆盖长度为1 560.2 cM, 平均图距18.1 cM。
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