上海交通大学
硕士学位论文
DC与CIK共培养细胞的肿瘤杀伤作用研究
姓名：庄捷
申请学位级别：硕士
专业：外科学（普通外科）
指导教师：曹晖
20090401
DC与CIK共培养细胞的肿瘤杀伤作用研究
摘要
目的观察树突状细胞(dentritic cell，DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)的共培养细胞(co-cultured cells by dendritic cells with cytokine induced killer, DCIK) 对分别接种了肺癌细胞株A549、肝癌细胞株BEL7404、恶性黑色素瘤细胞株A735和结肠癌细胞株Lovo的裸鼠肿瘤细胞的细胞毒活性作用以及DCIK对临床晚期结直肠癌病人的疗效。
方法动物实验：用正常人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）诱导培养DC、CIK和DCIK 细胞，并分别对其进行形态和表型分析；将肝癌细胞株BEL7404分别接种于CIK和DCIK细胞液中，培养后用四甲偶氮唑蓝MTT法分别测定两种细胞对肿瘤的杀伤效应；分别接种肺癌细胞株A549、肝癌BEL7404和恶性黑色素瘤细胞株A735于裸鼠腹腔内，并在腹腔注射抗癌药物后分成单独化疗对照组和化疗加DCIK治疗组，观察用药后20天、35天抑瘤效应和瘤块消失情况来比较两组的疗效差异；裸鼠尾静脉注射接种人结肠癌细胞株Lovo，以生存天数作为观察指标来考察生理盐水对照组、CIK实验组和DCIK实验组的抑
瘤情况和疗效。临床应用研究：将DCIK治疗应用于24例经组织学或细胞学确诊为晚期的，或接受过规范化治疗后复发、转移的结、直肠癌患者，检测、对比患者治疗前后血样中CD4、CD8和CD3CD56双阳性细胞百分比和肿瘤相关抗原的水平变化，并评价DCIK治疗的临床疗效和毒副作用。
结果DC、CIK细胞经诱导、共培养后，其形态和表型分析表明， DCIK细胞的增殖和CD3和CD3CD56表型细胞的增加较为明显，释放的细胞因子IFN-γ是CIK的3-5倍；培养14-21天的DCIK细胞在体外实验中对肝癌细胞株的杀伤活性在效靶比5:1和10:1时明显强于同源的CIK细胞；在接种肺癌、肝癌和恶性黑色素瘤细胞株的裸鼠中，化疗加上DCIK细胞免疫治疗组的疗效好于单纯的化疗治疗组，且瘤块基本消失的比例较高，用药后20天和 35天抑瘤效应的比较分析显示，化疗加上DCIK细胞免疫的抑瘤效果明显好于单纯化疗组（P<0.05）；CIK和DCIK细胞在没有化疗药物时对接种于裸鼠中的结肠癌Lovo细胞显示了强烈抑制作用，DCIK组裸鼠的生存天数明显长于CIK组 (P<0.001)。临床研究显示，经DCIK治疗后，晚期结、直肠癌患者免疫细胞表型CD3CD4、CD3CD8和CD3CD56均较治疗之前有明显提高或趋于正常值，肿瘤相关抗原则有显著下降，生活质量有所改善,而且没有严重的毒副作用。
结论无外源性抗原直接激活的DCIK细胞是具有比
CIK细胞更强细胞毒活性的免疫活性细胞，具有较强的抗肿瘤效应。DCIK细胞可以明显提高晚期肿瘤病人的抗肿瘤免疫功能，改善晚期肿瘤患者的生活质量。
关键词树突状细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞，共培养细胞，恶性肿瘤，免疫治疗
IMMUNOTHERAPEUTIC EFFECTS OF DENDRITIC CELLS CO-CULTURED WITH CYTOKINE INDUCED
KILLER CELLS
ABSRACT
Objective To investigate the anticancer effect of co-cultured cells (DCIK) by dendritic cells (DC) with cytokine induced killer (CIK) cells on A549 lung cancer, BEL7404 liver cancer, A735melenoma and Lovo colon cancer bearing Balb/c nude mice and clinical late, recurrent or metastatic colorectal cancer patients.
Methods DC and CIK cells were induced from peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers and they were co-cultured. MTT assays were used to compare the proliferation capabilities, immunophenotype changes and INF-γ levels of DCIK with CIK cells and their effects against A549 lung cancer in vitro. The anticancer effects of DCIK and CIK cells were evaluated by introduction to A549 lung cancer, BEL7404 liver cancer, A735 melanoma and Lovo colon cancer bearing Balb/c nude mice after chemotherapy in vivo. Comparison was made between chemotherapy only group and chemotherapy plus DCIK group according to anticancer effects. 24 histological confirmed late recurrent or
metastatic colorectal cancer patients underwent DCIK therapy, before and after which, their immunological data of double positive cells CD3CD4, CD3CD8, CD3CD56, tumor associated antigen CEA, CA199 and CA50 and other data were collected and analyzed to evaluate the immunotherapeutic and clinical efficacy.
Results The proliferation capabilities of DC-CIK cells were significantly higher than that of CIK cells and the ratio of single and double positive cells such as CD3 and CD3 CD56 in CIK cells was significantly enhanced by co-cultured with DC cells. The level of INF-γsecreted in supematants was increased noticeably by co-cultured DCIK cells. In vitro, within the effector-target ratio range between 5:1 and 10:1, DCIK cells were more potent than CIK cells and with valuable anticancer effect to BEL7404 liver cancer cells. In A549 lung cancer, BEL7404 liver cancer and A735 melenoma bearing Balb/c nude mice, immunotherapies of DCIK and CIK cells combined with chemotherapy both had better antitumor effect than chemotherapy alone （P<0.05）. In vivo, DCIK cells showed better anticancer cytotoxicity over CIK cells in Lovo colon cancer bearing Balb/c nude mice as the survival days were concerned (P<0.001). Also primary clinical study showed potent anticancer immune effects of DCIK therapy in late stage colorectal cancer patients with evidence of increased double positive cells of CD3CD4, CD3CD8, CD3CD56 and decreased tumor associated antigen level of
CEA, CA199 and CA50 after administration of DCIK. The treatment improved patient’s quality of life with negligible complications.
Conclusion DCIK cells showed their significant advantages of anticancer cytotoxicity over CIK cells. As a kind of potent adoptive immunotherapeutic agents, DICK cells improved the antitumor immunity and quality of life in late stage colorectal cancer patients.The research might provide experimental and clinical basis for the DCIK cells immunotherapy.
KEY WORDS dendritic cells, cytokine-induced killer cells, co-cultured cells, malignant tumor, anticancer effect, immunotherapy
2005级上海交通大学医学院同等学力硕士论文
英文缩略语表
（按字母顺序排列）
英文缩写英文全称中文释义APC antigen presenting cells 抗原提呈细胞CIK cytokine induced killer细胞因子诱导杀伤细胞DC dentritic cell树突状细胞
DCIK dentritic cell co-cultured
cells with cytokine induced
killer 树突状细胞和细胞因子诱导杀伤细胞的共培养细胞
IL-2interleukin-2细胞因子白介素-2 IFN-γinterferon-γ干扰素-γLAK lymphokine activated killer淋巴因子激活杀伤细胞MHC major histocompatibility
complex
主要组织相容性复合物NK natural killer自然杀伤细胞PBMC peripheral blood mononuclear
cell
外周血单核细胞Th-1T helper cell-1T辅助淋巴细胞-1 TIL tumor infiltrating lymphocyte肿瘤浸润性淋巴细胞TNF-αtumor necrosis factor-α肿瘤坏死因子-α
上海交通大学
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学位论文作者签名：
日期： 2009 年 4 月8 日
上海交通大学
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学位论文作者签名：指导教师签名：
日期：2009 年 4 月8日日期：2009年4月8日
DC与CIK共培养细胞的肿瘤杀伤作用研究
前言
免疫治疗是除手术、化疗、放疗外重要的肿瘤治疗手段之一，其理论基础是以某种药物或生物制品，特异性或非特异性的调节肿瘤患者的免疫防护机能，改变原已存在的免疫失衡及免疫缺陷，恢复平衡调控，增强机体对肿瘤细胞的限制和杀伤力，最终肿瘤患者获得自身抗肿瘤作用[1-7]。
过继免疫治疗分为特异性和非特异性两类，前者是将肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL），经体外细胞因子白介素-2（interleukin-2，IL-2）活化后复输；后者则以外周血单核细胞或脾细胞经IL-2活化后复输。淋巴因子激活杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）为此种治疗手段的代表。
CIK细胞是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子如抗CD3单克隆抗体、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤（natural killer, NK）细胞的非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）限制性杀瘤优点[8]，对于多种肿瘤细胞均表现出强大的杀伤活性。它是所有免疫效应细胞中，增殖能力最强、细胞活性较强的细胞[9-11]。
树突状细胞（dendritic cell, DC）是迄今发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC），在细胞毒性T细胞的活化过程中发挥着重要作用。它表面高水平的表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子，可有效提呈肿瘤抗原多肽，同时还高表达CD40、CD80、
CD86等共刺激分子，提供T细胞激活所必需的第二信号，其与T细胞结合（共培养）后，可大量分泌IL-12，诱导T辅助淋巴细胞-1（T helper cell-1, Th-1）型免疫应答，提升细胞免疫水平，有利于对肿瘤细胞的清除[12]。
有研究认为CIK的杀伤活性主要是由于大量扩增的CD3和CD56双阳性细胞引起的，而CD3和CD56的表达依赖于外源性IL-2、IL-7和IL- 12[13]的刺激。同时，人们发现许多肿瘤细胞会产生对免疫效应细胞的抵抗，认为可能与肿瘤患者功能性的DC缺乏，无法有效活化细胞毒性T细胞有关。因此设想DC和CIK可以通过共培养来发挥协同作用，有效治疗恶性肿瘤。有研究证实DC与CIK细胞共培养后，DCIK细胞相关细胞群中CD3、CD56双阳性和CD8细胞含量明显升高[14]，而且抗原肽冲击可增加DC表面CD80、CD86和HLA-DR分子表达，促进DC的成熟[15]。
本研究旨在通过用正常人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）来诱导培养DC、CIK产生DCIK细胞，对它们形态和表型进行分析，以及DCIK和CIK细胞在体内和体外动物实验中的抗肿瘤免疫作用的评估，探索一种更为有效的免疫治疗方法，为临床研究提供理论依据。我们将DCIK细胞治疗运用于24例晚期或规范化治疗后复发、转移的结直肠癌患者，通过患者治疗前后抗肿瘤免疫和肿瘤相关抗原水平的比较以及临床疗效和毒副作用的观察，来评价这种体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法对增强患者的抗肿瘤免疫功能、改善晚期肿瘤患者生存质量的作用，为进一步的临床应用研究探索经验。
第一部分DCIK细胞肿瘤杀伤作用的实验研究
材料与方法
一、实验动物和材料
选用6－8周龄Balb/c裸鼠45只，由中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所动物房提供，按标准培养环境条件饲养。用于接种的人肝癌细胞株BEL7404、人肺癌细胞株A549、人黑色素瘤细胞株A735和人结肠癌细胞株Lovo 由中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所细胞库提供。抗CD40-FITC、抗CD80-FITC、抗CD3-FITC、抗CD56-PE购自美国Becton Dickinson公司。AIM-V培养液购自Gibco有限公司，TNF-α购自上海赛达生物药业有限公司。Rh-IL-4购自Amoytop Biotech。抗癌药物：丝裂霉素C、长春新碱酰胺和顺铂由上海交通大学医学院附属仁济医院提供。
二、实验方法
1. 诱导培养DC与CIK细胞
正常人外周血，经Ficoll分离获得单核细胞PBMC，分别诱导培养DC与CIK 细胞。取PBMC细胞接种到AMI-V培养液并调整细胞浓度为1×106/ml，添加IFN-γ1000U/ml, 在37℃、5% CO2条件下培养2小时,将非黏附细胞移入经抗CD3单抗包被的100ml培养瓶中，添加rh-IL-1β、rhIL-2，使两者浓度分别为：100 U/ml, 300U/ml，继续培养48小时后，用DCIK培养液稀释至5×105/ml继续培养，每两天计数一次并稀释至5×105/ml再次培养。在留有黏附细胞的培养瓶中，加入DC培养液（20ml/瓶），37℃、5%CO2条件下培养5天，并加入TNF-α使其终浓度为200U/ml继续培养7天，电镜观察其细胞形态。
2. 诱导培养DCIK细胞
将培养7天的DC细胞与CIK细胞以1:3的比例混合，培养液为CIK细胞培养液，每次扩增的初始细胞浓度为3 × 105/ml。
3. DC、DCIK细胞形态测定
DC细胞HE染色制备方法：取DC培养液0.5ml，细胞密度约1×105/ml，PBS洗涤2次，重悬细胞，加样于多聚赖氨酸包被玻片，室温下静置10 分钟；以缓慢流动PBS轻洗玻片，95%酒精固定15 分钟；PBS浸洗1 分钟，苏木精染色6 min；水浸洗，盐酸酒精溶液分色5 秒；水浸洗，淡氨水细胞核蓝化4 分钟；水浸洗，伊红染液染色 6 分钟；水浸洗，梯度酒精脱水；二甲苯封片。电镜下观察。取制备的DCIK细胞，加样于载玻片上，盖上盖玻片，用相差显微镜观察，摄片。
4. 细胞表型分析
原理为应用FITC标记抗人CD单抗与DC、CIK和DCIK细胞表面CD结合，测试其中CD40、CD80、CD3和CD3CD56的百分率。取一定体积的细胞（细胞总数为1×106 个/ml）悬液于流式细胞仪测试管中，离心，弃上清液，保留细胞。按照美国Becton Dickinson公司的标记抗体使用说明，将抗CD40-FITC、抗CD80-FITC、抗CD3-FITC、抗CD56-PE加入测试管中，混匀，4 ℃ 30 分钟，后离心1000 r/min 3 分钟，用PBS洗涤细胞3次，后悬浮于0.5 ml PBS中，流式细胞仪测试。
5. 效应细胞DCIK与CIK体外杀伤肿瘤细胞活性分析
将诱导培养的CIK和DCIK细胞分别加适量培养液，计数后调节细胞密度为4×106/ml，总量各不少于2ml；经培养液倍比稀释后其密度各分别为：4×106、2×106、1×106和0.5×106/ml。靶细胞BEL7404的准备：贴壁生长细胞用EDTA 或胰酶消化液处理、离心后，取悬浮细胞用Hank’s液重复洗涤；加适量10％FCS RPMI 1640悬浮细胞计数；用10％FCS RPMI 1640调节细胞密度为2x105ml，不少于10ml。细胞毒活性检测：接种靶细胞BEL7404，按2×104/100μl/孔，于96孔平底细胞培养板中培养4小时以上；按效靶比10:1、5:1、2.5:1和1.25:1分别加入96孔板中，每6孔为同一组为效靶比。效应细胞培养液培养后，加入MTT 液，最后测OD570值。杀伤率计算：杀伤率＝1-[(ET-E’)/(T-C)]·100%，E为效应细胞，ET为效应细胞作用于靶细胞，T为靶细胞，E’为对照，C为空白。
6. 效应细胞DCIK裸鼠体内抑瘤实验
细胞毒活性检测DCIK细胞免疫治疗改善裸鼠化疗效果的动物试验。实验分A和B两组，A组为抗癌药物治疗组＋免疫细胞DCIK治疗组，B组为抗癌药物治疗组，各用裸鼠15只，分别接种肺癌细胞株A549、肝癌细胞株BEL7404和黑色素瘤细胞株A735 各1×107于裸鼠的腹腔内。11-15 天内当接种部位肿瘤生长到2-6毫米左右时，选取肿瘤生长大小相当，直径为2-5毫米、形状规则的小鼠供治疗实验研究用。抗肿瘤化疗用MVP方案，腹腔注射给药。抗癌药物剂量为丝裂霉素（MMC）1.5mg/kg、长春新碱酰胺（VCR）0.2mg/kg、顺铂（DDP）4mg/kg，一次性腹腔内注射。DCIK细胞免疫治疗在腹腔内注射化疗药物2天后进行，每次腹腔注射2×106细胞，隔天再次注射，共五次，总剂量：10×106细胞。以化疗药物注射日起算，在给药前和给药后的10，15，20，25，30和35天分别测量小鼠肿瘤的长径（a）与宽度（b），单位为mm，以测量结果计算比较两组荷瘤鼠的瘤块消失率。再以治疗20天和35天时荷瘤鼠瘤块大小与缩小程度差别比较为指标，比较两组疗效。瘤块缩小程度差别比较值=[B组瘤块大小一（A组瘤块大小）]/B组瘤块大小。
7．效应细胞DCIK与CIK对Lovo荷瘤鼠动物生存天数的影响比较实验选用人结肠癌细胞株Lovo，以2.5×104细胞数经裸鼠Balb/c尾静脉注射接种，每只裸鼠可100% 在动物肺部形成肿瘤结节，而且在3周左右相继死亡，此为公认的人癌血行肺转移的典型动物模型。实验动物分成接种生理盐水（NS）对照组、CIK治疗组和DCIK治疗组。每组5只裸鼠，每只接种Lovo 1×105个细胞后24小时、72小时、144小时分别经尾部静脉给生理盐水NS、 CIK细胞（5×106）、DCIK细胞（5×106），以生存天数作为观察指标来考察3组实验的肿瘤生长情况和疗效。
三、统计学处理
实验数据使用SPSS11.0统计软件分析。两组间比较采用t或U检验。计数以率表示，比较采用X2检验。P<0.05为差异具有显著性。
结果
一、DC、CIK及DCIK细胞诱导培养后形态和表型分析
1. DC、CIK和DCIK细胞相差显微镜下的形态学表型分析
(1) DC形态学
粘附性单核细胞经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4诱导后，培养物呈现较复杂的细胞表面形态，细胞量亦明显增加。其中大多数细胞体积较大，呈近似圆形或不规整形态（见图1）。其中有些伸出一些胞浆突起或周边胞浆呈密集放射状突起（见图2），胞浆中聚集丰富颗粒状物质，这些形态的细胞被确认是成熟和未成熟的DC及巨噬细胞。随着培养时间的延长，成纤维细胞会逐渐增多（见图3）。在培养第4天将粘附性差的细胞换瓶，继续诱导培养DC细胞，以减少纤维母细胞对DC的干扰。
(2) CIK细胞形态学
非粘附单个核细胞在INF-γ、αCD3、IL-1和IL-2诱导下，部分淋巴样细胞明显扩增成CIK细胞，并逐渐形成细胞团块；细胞形体较DC小，圆形，透亮，大小较均一（见图4）。
(3) DCIK细胞形态
DCIK细胞形态学：早期共培养的CIK细胞中有形体较大、形态不规整的DC和体形较小、圆而透亮的共培养的DCIK细胞，镜下形态与CIK细胞相似。DC与CIK细胞共培养24小时，可见DC与较多的CIK细胞聚集成团（见图5）。经2次传代共培养扩增5天的DCIK细胞增殖速度，成团块生长，大小均一，透亮无颗粒（见图6）。
2. DC、CIK与DCIK细胞分子标志表型比较
(1) DC细胞表型CD40和CD80的比较
用GM-CSF和IL-4诱导7天后，DC细胞表型CD40和CD80百分比分别为
85％和90％，较诱导前的70% 和80% 有所增加（见表1）。
表1 用GM-CSF和IL-4诱导7天前后DC细胞表型CD40和CD80比较
表型致敏前的DC细胞致敏后的DC细胞
CD40 70% 85%
CD80 80% 90% (2) CIK和DCIK细胞表型CD3和CD3CD56比较
经INF-γ、αCD3、IL-1和IL-2诱导后20天，DCIK的CD3和CD3CD56表
型细胞分别为97% 和65%，大于CIK的74% 和48%，明显增加更多（见表2）。
表2 诱导20天的CIK和DCIK细胞表型CD3和CD3CD56比较
表型CIK DCIK
CD3 74% 97% CD3CD56 48% 65%
二、DCIK、CIK细胞体外肿瘤杀伤分析
1. CIK和DCIK细胞杀伤活性比较
培养14和21天时，DCIK细胞和同源细胞CIK细胞对BEL7404靶细胞的杀
伤活性随着效靶比的增大而增加。在相同的效靶比下，DCIK细胞的肿瘤细胞杀
伤活性都强于CIK细胞，在效靶比5:1-10:1时，培养14和21天的DCIK细胞的
杀伤活性均能维持在50%以上（见表3、4）。
表3 培养14天后不同效靶比下DCIK和CIK对BEL7404靶细胞的杀伤活性比（%）
效靶比
组别
1.0:1.0 1.25:1.0
2.5:1.0 5.0:1.0 10.0:1.0
DCIK 23 31 46 53 61 CIK 18 21 34 47 50
表4 培养21天后不同效靶比下DCIK和CIK对BEL7404靶细胞的杀伤活性比（%）
效靶比
组别
1.0:1.0 1.25:1.0
2.5:1.0 5.0:1.0 10.0:1.0
DCIK 29 34 45 56 64
CIK 22 24 36 51 55
2. DCIK细胞和CIK细胞扩增倍数的比较
结果显示DCIK和CIK细胞均随培养天数的增加而成倍扩增。CIK细胞在培
养2-3周时增殖速度明显减缓，而与DC共培养的CIK的増殖倍数高于非共培养
的CIK増殖率2-3倍，表明DCIK细胞比CIK细胞更具有增殖活性（见表5）。
表5 培养不同天数时DCIK细胞和CIK细胞的扩增倍数
组别 2 天4天6天8天10天12天14天16天18天 20天 22天
0.025
0.1 0.6 1.6 2.8 4.6 6 8.2 9 9.5 10 DCIK
CIK 0 0.05 0.25 0.50.8 1.25 1.8 2.2 2.6 2.8 3
3. DCIK和CIK细胞释放细胞因子IFN-γ的比较
两组测定结果表明DCIK释放的细胞因子IFN-γ为6500和10000 pg/ml，分
别是CIK的3倍多和5倍（见表6）。
表6 DCIK和CIK细胞释放细胞因子IFN-γ的比较(单位：pg/ml)
细胞类别第一组测试第二组测试
DCIK 6500 10000
CIK 2000 2000
三、DCIK细胞免疫治疗改善荷瘤裸鼠化疗效果的动物实验的结果
1. DCIK细胞免疫加化疗和单纯化疗组不同天数后治疗效果的比较
在给药后的10，15，20，25，30和35天分别测量小鼠肿瘤的长径（a）与
宽度（b）计算比较单纯化疗加DICK组（A组）和化疗组（B组）荷瘤鼠的瘤
块消失率，分析结果表明这两种疗法都有一定疗效。化疗加上DCIK细胞免疫治
疗的效果好于单纯的化疗，瘤块基本消失的比例高，而且作用更为持久（见表7）。
表7 DCIK细胞免疫加化疗和单纯化疗不同天数后荷癌裸鼠治疗效果的比较
裸鼠荷瘤
名称
组别
15天消失
百分率%
20天消失
百分率%
25天消失
百分率%
30天消失
百分率%
35天消失
百分率%化疗+DCIK3020252020
A549
化疗组255500
化疗+DCIK4010101010 BEL7404
化疗组155000
化疗+DCIK4025202020 A375
化疗组200000
2. DCIK细胞加化疗和单纯化疗组在用药20天和 35天抑瘤效应的比较
以荷瘤鼠治疗20天和35天时瘤块大小与缩小程度差别为指标，比较单纯化疗和化疗＋DICK疗效的结果表明，化疗+DCIK组对多种肿瘤的抑瘤效果均明显好于单纯化疗组，具有显著差异性（见表8、9和图7-9）。
表8 DCIK细胞免疫加化疗和单纯化疗在用药后20天和 35天抑瘤效应的比较
给药后20天给药后35天
裸鼠荷瘤
名称
组别
给药前荷瘤
大小
（均值）
荷瘤大小
（均值）
瘤块缩小
程度差别
比较值
荷瘤大小
（均值）
瘤块缩小
程度差别
比较值化疗+DCIK19.9811.750.4038.010.33
BEL7404
化疗组16.5019.60 1.0057.04 1.00化疗+DCIK18.2018.450.3539.650.46 A549
化疗组17.8728.60 1.0073.64 1.00化疗+DCIK20.7617.700.5041.730.64 A375
化疗组20.2435.23 1.00118.80 1.00
表9 DCIK细胞加化疗和单纯化疗在用药后20天和 35天抑瘤效应比较的差异显著性统计
给药后20天给药后35天
裸鼠荷瘤
名称T值P T值P
BEL7404 2.97 <0.05 3.16 <0.05 A549 3.00 <0.05 3.16 <0.05 A375 3.54 <0.01 6.3 <0.01
四、CIK和DCIK细胞对人结肠癌Lovo荷瘤鼠疗效的动物实验比较
实验结果表明，CIK和DCIK都显示了对Lovo肿瘤的强烈抑制作用，CIK 治疗组和DCIK治疗组分别与对照组相比其P值均小于0.001，实验组与对照组之间存在有非常显著的差异。其中CIK组的生存期比对照组的生存期延长1倍多，而DCIK组则比对照组延长了几近2倍，说明DCIK组比CIK组显示出具有更强的抑瘤力，且CIK组和DCIK组之间也有显著差异（P<0.01），提示在临床上DCIK作为肿瘤病人的免疫治疗制剂将比CIK更有优势（见表10）。
表10 CIK和DCIK细胞对人结肠癌Lovo荷瘤鼠生存期的影响组别动物数（只）生存期（天）P值
NS15 18.12±15 /
CIK15 35.5±6.9 < 0.001
DCIK15 61.5±7.0 < 0.001
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
3D多细胞肿瘤球的培养 原创2017-04-20医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。 与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。 因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。 虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。 本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。
1 实验前准备工作 1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷； 2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态； 3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。 2 琼脂糖包被96孔板 1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基（或DMEM培养基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min； 2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；
3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。 注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。 此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。 4. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。 3 配置含Matrigel基质胶细胞悬液 1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI 1640完全培养基（或DMEM完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0×105cells/mL，备用。
实验一、骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 二材料： 1.试剂： （1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。 不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。 不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。 （2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。 （3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。 2.器材： 超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等 三方法： 细胞冻存及复苏 先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
肿瘤细胞培养基本方法 (一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。 2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。 3、调pH至7.2左右。 4、加水至最终体积。 5、在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。 6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。 (三)小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近
来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。 1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 2、处理后的血清贮存于4℃。 3、小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。 (四)生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 1.培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 2.按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。按1％体积 分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。 (五)冻存细胞的复苏 1.应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸 至水面以下不断摇动至融化。 2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取 出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。 (六)传代: 1.贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使 细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。 2.悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。 (七)冻存 将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约 106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 (八)注意事项
大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
肿瘤细胞的培养及其实验的方法 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%?5%） 仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis ）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性 是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、 10T1/2 等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。 （四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。 （五）异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同