小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定1
银益飞，孙筱放，蒋永华，张文红，郑育红，孔舒，潘倩莹，廖宝平广州医学院第三附属医院妇产科研究所，广东广州（510150）
E-mail：yinyifei2005@https://www.doczj.com/doc/a33534254.html,
摘要：目的建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法。方法采用氯化锶联合细胞松弛素B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞，所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系，观察两者的建系成功率。结果共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系，这些细胞SSEA-1抗原阳性，SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性，具有AKP活性,保持正常染色体核型，体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体。结论采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干细胞系获得成功，该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中具有潜在的应用价值。
关键词：孤雌激活，胚胎干细胞，氯化锶，细胞松弛素B，小鼠
中图分类号：S811.4
1. 引言
胚胎干细胞可以诱导分化为特定的细胞，用于治疗糖尿病、帕金森氏病及心脏病等，近期成为全球生命科学领域研究的焦点；但是这些分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥反应，其安全性与伦理性等问题限制了干细胞的临床应用。孤雌胚胎干细胞的建立不需要去创造或破坏一个具有生命力的胚胎，不受伦理的限制；并且孤雌胚胎干细胞为单性来源，在组织器官移植过程中减少了免疫排斥反应的发生，因此在细胞治疗，器官移植领域具有广阔的应用前景。目前已建立了小鼠、猕猴、以及兔的孤雌胚胎干细胞系[1－3]，但是人类孤雌胚胎干细胞的建系研究尚无重大突破。本试验通过建立小鼠孤雌胚胎干细胞系，对建系过程中的影响因素进行分析，为人类孤雌胚胎干细胞系的建立提供实验基础。
2. 材料和方法
2.1 材料
C57BL/6小鼠由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号:检证字2005A044 ）， DBA/2小鼠由中山大学实验动物中心提供（合格证号:检证字2006A004 ）；Scid小鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供（合格证号:检证字SCXK(泸)2003－0003 ）。PMSG(天津市华孚市高新生物技术公司)； HCG(瑞士雪兰诺公司)；氯化锶（SrCI2）、细胞松弛素B（CB）、透明质酸酶、链蛋白酶、明胶、2－巯基乙醇（美国Sigma公司）；DMEM、PBS、胰酶、非必需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、青霉素/ 链霉素（美国GIBCO公司）胎牛血清(美国Hyclone 公司),ESGRO(美国Chemicon公司)。
2.2 方法
2.2.1 实验动物超排处理以及卵母细胞的收集：8周龄(C57BL/6 x DBA/2) B6D2F1杂交雌性小鼠3只。腹腔注射PMSG 10 IU／只，48 h后注射HCG 10 IU／只。注射HCG 16 h后脱颈椎处死小鼠，取出输卵管，放人M2培养液中，划破输卵管膨大的壶腹部，收集颗粒细胞－卵母细胞复合体，用0.1％透明质酸酶去除颗粒细胞后，将卵母细胞置于CZB液中，37℃、5
1本课题由广东省“十五”科技计划重大专项基金项目资助(项目名称：胚胎干细胞诱导为造血干细胞治疗白
血病的研究；项目编号: B30202)
％ CO2培养箱内待用。
2.2.2 卵母细胞激活处理：用不含ca2+、Mg2+的CZB配制含有10 mmol／ml的SrCI2、5ug/ml 的CB的激活液，将MⅡ期卵母细胞在该激活液中处理6h，再转入KSOM培养液滴中，37℃、5％ CO2培养箱内培养4天，观察囊胚形成率。
2.2.3 小鼠孤雌胚胎干细胞的分离培养：培养至第四天的囊胚采用全胚培养法接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上；桑椹胚先用0.1％链蛋白酶处理1－2分钟去除透明带，再转入饲养层。原代培养6－7天后，采用0.05％的胰蛋白酶37℃作用3分钟，消化传代至新饲养层上，此后隔天换液，每4－5天传代一次。胚胎干细胞培养液由DMEM培养液、20% 胎牛血清、2Mm L-谷氨酰胺、1Mm 丙酮酸钠、0.1Mm 2－巯基乙醇、0.1Mm 非必需氨基酸、100IU/ml 青霉素、100μg/m l链霉素以及1000u/ml白血病抑制因子(LIF)组成。
2.2.4 孤雌胚胎干细胞表面标志物鉴定：孤雌胚胎干细胞培养代数大于10代，采用低密度培养5天后，参照文献[4]方法进行AKP染色及干细胞表面标志物
（SSEA-1,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60）鉴定。
2.2.5 染色体核型分析：当干细胞生长旺盛时加入终浓度为0.25ug/ml的秋水仙素作用4小时，消化收集细胞，经低渗，固定，滴片处理后进行Giemsa 染色及G显带，镜检分析20个核分裂象。
2.2.6 体外分化能力检测：将生长旺盛的胚胎干细胞用0.05％胰酶作用3分钟，加入不含LIF的胚胎干细胞培养液，轻轻吹打（注意不要吹成单个细胞而让之保持团块状），将其转入细菌培养皿内悬浮培养，3天后更换培养基。培养7天后将形成的拟胚体转入铺有0.1％明胶的培养皿内贴壁培养2周，观察其分化现象。
2.2.7 体内分化能力检测：将含有1×107个细胞的悬液接种于6周龄雄性Scid小鼠的腹股沟皮下和腹腔内，饲养5-6周后，处死小鼠，摘除肿块进行组织学分析,观察三个胚层形成情况。
2.2.8 数据分析：实验数据采用SPSS 12.0软件进行统计学分析
3. 结果
3.1 孤雌囊胚的建系率高于去透明带的桑椹胚:促排的3只小鼠一共获卵45枚，采用SrCI2和CB联合激活后42枚见原核，激活率93.3％；胚胎培养第四天形成11枚囊胚，24枚桑椹胚（图1A），囊胚形成率26.2％。囊胚接种到饲养层上24小时后开始从透明带孵出（图1B）；48小时后外滋养层细胞肿胀，内细胞团（ICM）贴壁；4天后见ICM明显增殖隆起生长（图1C）。11枚囊胚有8个ICM贴壁生长，获得7株孤雌胚胎干细胞系，建系成功率63.6％;24枚去透明带的桑椹胚，17个ICM贴壁生长，贴壁率70.8％，与囊胚相比无统计学差异
（X2=0.083,P>0.05）；获得5株孤雌胚胎干细胞系，建系成功率20.8％,与囊胚相比有统计学差异（X2=4.381,P<0.05 ）详见表1
表1 未去透明带的囊胚与去透明带的桑椹胚建系结果
组别胚胎数ICM贴壁率% 建系率% 囊胚组11 72.7％（8/11） 63.6%（7/11）
桑椹胚组24 70.8％（17/24）20.8% (5/24)
图1 小鼠孤雌胚胎干细胞原代培养（200X）
A:孤雌激活的囊胚与桑椹胚；B：接种24h后囊胚孵出；C：接种第四天ICM增殖明显
3.2 小鼠孤雌胚胎干细胞特异性标志物鉴定: 12株孤雌胚胎干细胞系均在体外传至10代，分别冻存，其中的两株继续培养，已传至25代，于第15代时进行了干细胞特征鉴定。光镜下可见孤雌胚胎干细胞集落边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界线不清楚，呈岛屿状（图2A）。碱性磷酸酶检查（AKP染色）呈强阳性（图2B），胚胎干细胞呈紫红色, 饲养层细胞不着色。表面标志物SSEA-1阳性（图2C），SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60为阴性。
图2 小鼠孤雌胚胎干细胞的形态与标志物鉴定
A:第25代孤雌胚胎干细胞形态（x100） B: AKP染色（x100）； C:SSEA-1染色 (200X)
3.3 染色体核型分析: 第15代与25代核型分析结果都是正常的二倍体核型：40，XX（图3）。
3.4 拟胚体形成: 悬浮培养的孤雌胚胎干细胞在第2天开始聚集成团，第3天胚胎干细胞团块开始分层；培养第6天后逐步出现囊腔，最终细胞团涨大成圆泡状，形成拟胚体(图4)。培养至第8天后转到铺有明胶的培养皿内，拟胚体贴壁生长，可分化为上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞等多种细胞。
图3 染色体核型：40，XX 图4 拟胚体（200X）
C
A B
B
A
3.5 畸胎瘤形成: Scid小鼠接种孤雌胚胎干细胞2周后，腹股沟接种处出现肿块（10X15mm大小）；5周后，肿块进一步增大（25X30mm大小）。处死小鼠，摘除肿块，做病理切片观察可见属于三个胚层的组织，复层磷状上皮、神经组织（外胚层）、肌肉组织、软骨（中胚层）、腺腔、支气管（内胚层）等，为畸胎瘤结构。(图5A-C)
图5 畸胎瘤组织切片(400X)
A.神经组织(外胚层)；
B.平滑肌组织(中胚层)；
C.腺体组织(内胚层)
4. 讨论
4.1 小鼠卵母细胞的孤雌激活机制:
卵母细胞体外激活可以采用物理及化学等方法，同一种方法对不同种系来源的卵母细胞其激活效率不同，大量研究证明SrCI2对小鼠卵母细胞激活效率最高[5，6]。 Sr2十可引发一个较长时间的Ca2十内流过程，通过Ca2十依赖性蛋白激酶激活细胞静止因子（CSF）以及细胞成熟促进因子（MPF），引起卵母细胞一系列的生化改变，包括外皮质颗粒胞吐，透明带糖蛋白的修饰，母体mRNA的修复，减数分裂的恢复，原核的形成，DNA合成等，以上这些变化就是卵母细胞的激活[7]。细胞松弛素B(CB) 可抑制减数分裂恢复过程中分裂器的旋转，使纺锤体不能旋转为与胞膜垂直的方向，，因此不能排出第二极体，没有丢失染色质成分，保证了孤雌胚胎的染色体倍数[8]。本试验采用SrCI2联合CB进行孤雌激活，获得93.3％的激活率；以及26.2％的囊胚形成率，该结果比Krivokharchenko[6]单独采用SrCI2激活小鼠卵母细胞，囊胚形成率为17.9％稍高。
4.2 孤雌胚胎干细胞系建立的影响因素：
小鼠卵母细胞的透明带薄，在囊胚孵出前期，囊胚腔扩张变形，不断吸入液体使腔内静水压升高，ICM可突破透明带孵出[9]，因此小鼠的孤雌囊胚可采用全胚培养法。但桑椹胚的卵裂球紧密结合，不能扩张，腔内无静水压升高，细胞团不可能突破透明带，故用链蛋白酶去除透明带帮助孵化，再接种到饲养层上。本试验发现未贴壁的囊胚主要因为ICM未能孵出，胞质固缩而死亡；而桑葚胚则因卵裂球的质量差萎缩而不能贴壁；两者的贴壁率分别为72.7％和70.8％，无统计学上的差异，说明透明带的去除有助于桑葚胚贴壁。Newman[10]观察ICM增殖情况，发现正常受精的ICM只有41%为体壁内胚层细胞，而孤雌激活的ICM 却有80％为体壁内胚层细胞，提示孤雌ICM本身具有易分化的缺点。孤雌的桑葚胚还没有形成内细胞团，大部分为外滋养层细胞，比囊胚更易分化，故建系率低于孤雌囊胚。本试验中去透明带后的桑葚胚仍然可以获得20.8％的建系率，对于囊胚形成率低的情况，从桑椹胚获得ICM，是建立孤雌胚胎干细胞系的另一条有效途径。
孤雌胚胎干细胞有自发分化的趋势，所以在促进细胞增殖的同时，还要维持其未分化的
二倍体状态。干细胞培养液除了含有细胞生长所必需的营养成分，还需要添加白血病抑制因子（LIF），它具有抑制胚胎干细胞自主分化的能力。胚胎干细胞的培养对饲养层的要求严格，饲养层为胚胎干细胞提供了生长的微环境，分泌了一些促生长和维持干细胞特性的物质。如果饲养层用丝裂霉素C处理不当，导致饲养层细胞过度生长，密度过高，就会抑制干细胞的增殖并导致其分化。在建系技巧上首先要注意选择原代ICM的传代时间，接种第4天时，大多数ICM已出现增殖，但这时的ICM 对酶相当敏感,消化后难以存活,应继续观察；在ICM 增殖到足够大、又没有分化迹象时（一般为接种的第6－7天）再分离传代。采用胰酶消化时则要注意酶的浓度与消化的时间，一般采用0.05％的胰酶，37℃作用3－5分钟，如果胰酶浓度过高、消化时间过长，就容易消化过度造成细胞大部分死亡。在培养换液时,最好采用三分之二量换液的方式,以维持细胞生长环境的相对稳定性。
本试验从桑椹胚建立了5株孤雌胚胎干细胞系，和囊胚来源的7株干细胞系一样具有干细胞特征、正常二倍体核型及体内外分化能力。该试验的成功为人类孤雌胚胎干细胞的建系提供重要参考，同时为探索胚胎早期发育过程中基因印迹变化提供研究平台；为进一步研究糖尿病、帕金森氏病等疾病的自体细胞治疗奠定基础。
参考文献
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Derivation and characterization of mouse parthenogenetic
embryonic stem cell lines
Yin Yifei, Sun Xiaofang, Jiang Yonghua, Zhang Weihong, Zheng Yuhong, Kong Shu,
Pang Qianying, Liao Baoping
Research Institute of Obstetrics and Gynecology,The third Affiliated Hospital of Guangzhou
Medical College ,Guangzhou (510150)
Abstract
Objective To establish the optimum method of deriving mouse parthenogenetic embryonic stem cells. Methods The B6D2F1 hybrid mouse oocytes were parthenogenetic activated with strontium chloride(SrCI2) and cytochalasin B(CB). The parthenogenetic blastocysts and morulas were seeded on MEF feeder respectively to examine the primary ICM appearance.and compare the derivation rate. Results Twelve batches of mouse parthenogenetic embryonic stem cells were established. The established cells were positive for SSEA-1 and negtive for SSEA-4, TRA-1-81, TRA-1-60 markers. They showed a high level of AKP activity, kept the normol Karyotypes，formed both embryoid bodies in vitro and teratomas in vivo. Conclusion Mouse parthenogenetic embryonic stem cell lines were successfully derived from blastocysts and morulas without zona pellucida. This technology should provide a plateform for deriving human homozygous stem cells that will have a potential value in autologous cell therapy .
Keywords: Parthenogenetic Activation ;Embryonic Stem Cells；Strontium Chloride; Cytochalasin B; Mouse