小麦抗白粉病基因Pm2的SSR 标记筛选
王黎明1,2
朱玉丽2
李兴锋2
王洪刚
2?
(1.河南科技大学农学院,洛阳471003;2.山东农业大学作物生物学国家重点实验室,
国家小麦改良中心山东(泰安)分中心,泰安271018)
摘要:为筛选与小麦抗白粉病基因Pm2紧密连锁的分子标记,将感病品种Chancellor 与Pm2的近等基因系杂交,获得F 1、F 2分离群体,采用分离群体分组法对Pm2进行了微卫星(microsatellite ,又称simple sequence repeats ,SSR )标记分析。结果表明,定位于小麦5D 染色体上的71对SSR 引物中有12对引物能在Pm2的近等基因系、Chancellor 间稳定地揭示出多态性差异,7对引物Xcfd189、Xcfd29、Xcfd8、Xcfd102、Xcfd7、Xcfd57和Xgwm190分别能在抗病、感病池间和F 2分离群体的抗病、
感病单株间稳定地扩增出特异性产物。7对引物所扩增的特异谱带分别为:Xcfd189360、Xcfd29190、Xcfd8160、Xcfd102250、Xcfd7200、Xcfd57245和Xgwm190210,它们与Pm2基因间的遗传距离分别为0、1.5、2.3、5.4、10.2、31.5和54.3cM ,其中标记Xcfd189360与Pm2共分离,标记Xcfd 29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2紧密连锁,可用于Pm2的标记辅助选择。
关键词:小麦;抗白粉病基因;Pm2;SSR 标记;标记辅助选择Screening for SSR markers linked to wheat powdery
mildew resistance gene Pm2
Wang Liming 1,2 Zhu Yuli 2 Li Xingfeng 2 Wang Honggang 2?
(1.College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,Henan Province,China;2.State Key Laboratory of Crop Biology,Shandong Agricultural University,Tai’an Subcenter of
National Wheat Improvement Center,Tai’an 271018,Shandong Province,China)
Abstract :To detect molecular markers linked to wheat powdery mildew resistance gene Pm2,microsatel?
lite (simple sequence repeats,SSR)markers and bulked segregant analysis (BSA)method were used in the F 2segregation population derived from the F 1of between common wheat susceptible cultivar Chancel?lor and Pm2near?isogonics line (NIL).The polymorphisms were revealed by 12from 71pairs SSR prim?ers originally assigned to chromosome 5D of wheat between NIL of Pm2and Chancellor.The polymorphic bands were found by 7of these 12SSR primers between the resistant and susceptible DNA pools,and the
resistant and susceptible plants of the F 2population,respectively.These specific DNA bands were desig?nated as Xcfd189360,Xcfd29190,Xcfd8160,Xcfd102250,Xcfd7200,Xcfd57245and Xgwm190210,respective?
ly.The genetic distance between these marks and Pm2was 0,1.5,2.3,5.4,10.2,31.5and 54.3cM,respectively.On the genetic linkage map of Pm2,Xcfd189360was shown to co?segregate with the
Pm2gene,and markers Xcfd29190,Xcfd8160and Xcfd102250were closely linked to it.These markers can
be used as the molecular assisted selection (MAS)for Pm2.
基金项目:国家自然科学基金(30871323,30800684),作物生物学国家重点实验室开放课题基金(2008KF01),河南省教育厅自然科学
研究计划项目(2008B210004)
作者简介:王黎明,男,1976年生,副教授,研究方向为生物技术与作物分子育种,email:lmwang1@https://www.doczj.com/doc/a12026225.html, ?通讯作者(Author for correspondence),email:hgwang@https://www.doczj.com/doc/a12026225.html,,Tel:0538-*******
收稿日期:2010-08-16
第38卷 第3期2011年
6
月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
Vol.38 No.3
June
2011
Key words:wheat;powdery mildew resistance gene;Pm2;SSR marker;MAS
小麦白粉病是由专性寄生真菌小麦白粉菌引起的一种世界性小麦病害,具有生理小种多、变异快等特点,而且白粉菌群体往往会随着寄主抗性基因的选择作用而发生协同进化,从而克服抗性基因,最终导致病害大流行[1-2]。化学方法防治白粉病虽有一定成效,但需花费大量的人力、物力,而且还会引起环境污染等生态问题。培育和推广抗病品种被公认为是防治小麦白粉病最经济、有效、安全的途径[3]。在传统育种方法的基础上,利用分子标记技术进行品种的分子设计与标记辅助选择育种,已成为抗病基因聚合及其聚合体筛选的有效方法[3-4],而鉴定新的抗病基因并筛选与之紧密连锁的分子标记则是进行分子标记辅助育种的基础。在众多分子标记当中,SSR标记具有操作简单、多态性高、稳定性强和共显性等特点,是广泛应用于小麦遗传育种中的分子标记[5]。近年来,利用SSR标记技术分别对来自于野生二粒小麦Triticum turgidum var.dicoccoides的Pm36[6]、Pm41[7]、Pm42[8]以及来自于长穗偃麦草Elytrigia intermedium的Pm40[9]和中间偃麦草Thi?nopyrum intermedium的Pm43[10]等多个小麦抗白粉病基因进行了分子标记、遗传作图等研究。
小麦抗白粉病基因Pm2来源于粗山草[11],被定位于小麦染色体5DS上[12],在我国和中欧地区该基因对小麦白粉病表现出良好的抗性。目前已报道的Pm2分子标记主要是限制性长度片段多态性(re?striction fragment length polymorphism,RFLP)[13]和随机引物多态性扩增DNA(random amplified polymor?phic DNA)[14]标记,而SSR标记较少。由于RFLP 标记操作繁琐、成本高,而RAPD标记结果重复性较差,因而限制了Pm2在标记辅助育种中的有效应用。Qiu等[15]开展了Pm2SSR标记的筛选研究,共筛选到3个SSR标记,其中1个标记与Pm2的遗传距离为2cM,但是另外2个标记与Pm2的遗传距离分别为34.2cM和44.2cM,难以有效用于分子标记辅助育种。为此,本研究利用F2分离群体分组法对Pm2进行了SSR标记分析,筛选新的与Pm2紧密连锁的SSR标记,以期为Pm2的分子标记辅助育种提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
Chancellor及其含有Pm2的近等基因系原引自于中国农业大学,由国家小麦改良中心泰安分中心保存。以小麦品种Chancellor及其含有Pm2基因的近等基因系(Pm2)为材料杂交获得F1,经自交获得F2抗性分离群体。其中,Pm2基因的近等基因系是
由含有Pm2基因的小麦品种Ulka为非轮回亲本,以小麦品种Chancellor为轮回亲本,经7代回交及自交并在施以白粉病的选择压力下育成。白粉病抗性鉴定生理小种为白粉病菌E15号菌株,由中国农业科学院植物保护研究所提供。试验所用的SSR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
主要仪器:9600型Thermal Cycler PCR仪,美国Bio?Rad公司生产;DYY?11型电泳仪,北京市六一仪器厂生产;Tanon Gis?2010型凝胶成像系统,上海天能有限公司生产。
1.2方法
1.2.1白粉病菌接种及抗性鉴定
将F2分离群体及其亲本秋播于试验网室,于12月上旬移入温室。将在瓦盆中繁殖的白粉病15号菌种苗分别于苗期、拔节期均匀放置在供试材料的行间,对抗、感亲本及所有的F2单株进行诱发接种鉴定。当感病亲本充分发病时,调查F2抗、感分离情况,每隔2~3天重复调查1次,病级鉴定及其反应型分级标准的记载参照林小虎等[16]方法。1.2.2基因组DNA提取、PCR反应及产物检测DNA的提取采用Sharp等[17]的酚-氯仿提取法。PCR反应体系参照R?der等[18]方法。反应程序参照朱玉丽等[19]方法,并略有改动。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃(复性温度因引物不同而异)复性1min,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃延伸5min。扩增反应在9600型Thermal Cycler PCR仪进行。扩增产物利用DYY?11型电泳仪在6%聚丙烯酰胺非变性胶上稳压110V电泳,银染显色,然后用Tanon Gis?2010型凝胶成像系统观察、照相。
1.2.3抗、感DNA池的建立和SSR引物筛选
分别提取F2分离群体所有单株的基因组DNA,按BSA法[20]随机选取10个抗病单株和10个感病单株的DNA进行等量混合,建立抗(病)池和感(病)池。首先在亲本间进行SSR多态性引物的筛选,然后将在亲本间有多态性的引物进一步用于抗、感池间的分析,最后利用抗、感池间筛选出的特异性
712
3期王黎明等:小麦抗白粉病基因Pm2的SSR标记筛选
引物进行F2分离群体单株的分子标记检测与分析。
1.2.4数据统计与连锁图谱分析
利用多态性引物对F2分离群体单株分子检测时,对出现扩增带型与父本(抗病池)一致的单株记作“a”,与母本(感病池)一致的单株记作“b”,带型杂合的单株记作“h”,带型不清或数据缺失者记作“—”。
利用MAPMAKER/Exp3.0b[21]软件构建抗性基因与分子标记的连锁图谱,并按照Kosambi[22]方法将重组率转化为遗传距离(cM)。采用分群命令进行标记间的连锁分析,然后进行排序,最后作图。设定LOD≥3.0,最大遗传距离为50cM。
2结果与分析
2.1F2群体中Pm2的分离特点
当感病亲本充分发病后,于苗期、灌浆期分别调查双亲及其F2群体的白粉病抗性分离特点。结果表明,感病亲本Chancellor全生育期高感白粉病,其近等基因系Pm2则高抗白粉病。苗期共调查157株F2单株,其中105株表现抗病,52株表现感病,经χ2检验,抗病株∶感病株符合3∶1的分离比例(χ2=2.071<3.841);灌浆期共调查131个单株,其
中95株表现抗病,36株表现感病,经χ2检验,抗病株∶感病株符合3∶1的分离比例(χ2=0.077< 3.841)。证明小麦抗白粉病基因Pm2是一个单显性基因。
2.2Pm2的SSR标记分析
利用定位于小麦5D染色体上的71对SSR引物,在亲本Chancellor和Pm2近等基因系间进行多态性筛选,其中12对引物可在抗、感亲本间揭示出多态性差异。以第1轮筛选出的12对引物在抗、感池间进行第2轮扩增分析,有7对引物Xcfd189、Xcfd29、Xcfd8、Xcfd102、Xcfd7、Xcfd57和Xgwm190能在抗、感池间揭示多态性差异,多次重复扩增结果稳定。这些引物扩增的差异片段长分别约为360、190、160、250、200、245和210bp(图
1)。
图1SSR引物在抗病池(R)和感病池(S)间的扩增结果
Fig.1Polymorphism detected by SSR primers among the resistant(R)and the susceptible(S)pools
注:箭头示产生的特异带。M:分子量标记;A~G:分别为引物Xcfd57、Xcfd29、Xgwm190、Xcfd7、Xcfd189、Xcfd8、Xcfd102。Note:Ar?row shows the specific polymorphic band.M:Molecular weight marker;A-G:primer Xcfd57,Xcfd29,Xgwm190,Xcfd7,Xcfd189,Xcfd8, Xcfd102,respectively.
利用筛选出的7对特异性引物分别对131株F2
植株进行扩增分析,均获得了特异扩增谱带,且多
次扩增结果稳定,分别为:Xcfd189360、Xcfd29190、
Xcfd8160、Xcfd102250、Xcfd7200、Xcfd57245和Xgwm190210,
可作为Pm2的标记。其中引物Xcfd189与Xcfd8的
部分扩增结果见图2。
7个SSR标记与Pm2基因间的遗传距离分别
为0、1.5、2.3、5.4、10.2、31.5和54.3cM。标记
Xcfd189360与Pm2基因表现共分离,标记Xcfd29190、
Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因的遗传距离分别
为1.5、2.3和5.4cM,表现为紧密连锁(图3)。
3讨论
Pm2对多数白粉病生理小种具有良好的抗性,
由于其载体是普通小麦,没有其它基因的连锁累赘,
因此在小麦白粉病抗性育种中具有重要利用价值。
筛选与Pm2紧密连锁的分子标记是有效利用该基
因的基础。本研究采用BSA法获得了7个与抗性
基因Pm2连锁的SSR标记,其中1个标记与Pm2
基因表现共分离,3个标记与Pm2基因紧密连锁。
新的标记丰富了Pm2基因标记的数量,可用于小麦
背景中Pm2的跟踪检测与标记辅助育种。高安礼812植 物 保 护 学 报38卷
图2两对SSR 引物在Chancellor ×Pm2F 2分离群体中部分单株间的扩增结果
Fig.2Polymorphism detected by two pairs SSR primers in part plants of Chancellor ×Pm2F 2segregating population
注:a:引物Xcfd189;b:引物Xcfd8;R:抗病池;S:感病池;M:分子量标记;1~20:来自于F 2群体的不同单株。Note:a:Primer Xcfd189;b:primer Xcfd8;R:resistant pools;S:susceptible pools;M:molecular weight marker;1-20:different single plant from the F 2
population.
图3小麦5D 染色体上Pm2基因与
SSR 标记的连锁图谱
Fig.3Genetic linkage map of powdery mildew resistant
gene Pm2and the linked SSR markers
on wheat chromosome 5D 等[23]利用与Pm2连锁的RFLP 标记,对含有Pm2、Pm4a 和Pm21的小麦品系复合杂交后代进行3轮分子标记选择,最终获得了Pm2+Pm4a 、Pm2+Pm21、Pm2+Pm4a +Pm21等一批抗白粉病基因聚合体,将本研究筛选的Pm2的SSR 标记用于标记辅助选择可以简化筛选试验程序、提高效率。目前,获得的上述与Pm2紧密连锁的SSR 标记,已被有效用于Pm2辅助选择和对Pm2与其它抗性基因聚合体的鉴定筛选。
分子标记与目标基因间的遗传距离与所利用作图群体的大小有关,一般初步的遗传作图只需50~
100株F 2植株,就可以检测到相距1~3cM 的两标记间重组的发生。本研究用Chancellor ×Pm2F 2分离群体的131个单株进行了SSR 分析,获得标记Xgwm190210与Pm2基因间的遗传距离为54.3cM;
而Qiu 等[15]利用中国春×Pm2F 2分离群体的814
个单株进行了SSR 分析,发现标记Xgwm190210与
Pm2基因间的遗传距离为34.2cM。此外,Qiu
等[15]发现,引物Xcfd81与Pm2基因紧密连锁,其标记与Pm2基因间的遗传距离为2cM;而李根桥等[24]在对普通小麦品种Brock 中抗白粉病基因分子标记定位研究中发现,引物Xcfd81与Brock 中的抗白粉病基因MlBrock 表现共分离,推测MlBrock 可能就是Pm2基因。这说明,在对同一个抗病基因进
行分子标记分析时,由于所用作图群体的不同以及群体大小的差异,获得的结果不尽相同。因此,在抗病基因分子标记辅助选择育种过程中,应在查阅相关文献基础上,筛选尽可能多的与抗病基因紧密连锁的分子标记,并根据育种群体灵活选用相应的分子标记以提高标记辅助选择的准确性和育种效率。
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