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磁珠法纯化DNA原理

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料,来吸附核酸,其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE,COOH)等,从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散,从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒,基于这种技术的试剂盒,名称前都有’Mag-Bind’。

核酸分离与纯化的原则:

核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。

核酸分离与纯化的步骤:

大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。

1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ~> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白

质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。

(3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有

EDTA、尿素(1~4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase也用于去除不需要的核酸。

3. 核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断

裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0~5. 5 ,终浓度为0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2~2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂[ 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解, 在实际使用时应予以选择。经离心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的盐分,即可获得纯化的核酸。(2) 层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应,而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或

水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。

玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分离纯化核酸,获得高产量的质粒DNA。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA 结合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase A 的TE 缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA ,获得的DNA 可直接用于测序。

Elkin 等使用羧化磁珠分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后,离心分离含质粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,最后磁场分离被吸附的DNA ,经乙醇洗涤,用水洗脱,可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。

也有用铁粒为固相支持物,经磁场分离而纯化质粒DNA 的报道。细菌用溶菌酶2煮沸法裂解,质粒被释放至悬浮液中, 加铁珠捕获,用磁场使铁珠分离,经漂洗后用水洗脱质粒,可获得高产量、测序级的质粒DNA。

亲和层析是利用待分离物质与它们的特异性配体间所具有的特

异性亲和力来分离物质的一类层析方法。Chandler 等报道了一种用肽核酸(PNA) 分离核酸的方法。PNA 是一类以N-(2-氨乙基)2甘氨酸结构单元为骨架的DNA 类似物,可作为纯化皮克(pg) 级核糖体DNA ( rDNA) 和核糖体RNA ( rRNA) 的试剂。在该方法中,以生物素标记的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 为

探针,以包被了抗生蛋白链菌素的磁珠作为固相载体。PNA 探针在高盐环境下, 与目的核酸(DNA 或RNA) 混合,经煮沸、冰浴、温育杂交步骤后,直接加入包被了抗生蛋白链菌素的顺磁性颗粒,经静置捕获PNA-核酸杂交体,水洗而获得纯化的核酸。

Schluep 等亦基于亲和层析原理,采用一种三螺旋体DNA 的方式进行质粒DNA 的分离。三螺旋体DNA 由同质嘌呤

2 同质嘧啶双螺旋链与同质嘧啶单链组成,单链上的T 识别A ·T 碱基,对形成T ·A ·T 三联体,质子化的单链胞嘧啶(C+ ) 识别G·C 碱基对形成C ·G·C 三联体。在适当的条件下,三螺旋体的结合具有高特异性和高稳定性。将配体聚嘧啶寡核苷酸链通过化学方法连接至Sephacryl S21000 SF 颗粒上形成亲和载体。当含目的序列的质粒DNA 溶液与其混合时,在酸性环境(p H 4.

5~5. 5) 下,质粒结合至亲和载体颗粒上,溶液中高浓度的NaCl 可稳定三联体形式并减少与蛋白质、细胞DNA 的非特异性结合。经一段时间反应后,颗粒悬浮液被加至一层析柱,用适当的洗

脱液改变p H 值至碱性环境,可使三联体解聚,质粒被洗脱。经该法分离质粒DNA ,质粒产量可达到加入量的62 %。

也有用Schizophyllan ( SPG) 制备亲和层析柱分离纯化RNA 的报道。SPG是一种β21 ,32葡聚糖,在低温下,含RNA 的流动相通过层析柱,Poly (C) 和poly (A) 与SPG通过氢键和疏水作用形成复合物而被吸附于柱上,然后通过改变缓冲液成分,将被吸附的RNA 洗脱。亲和层析应用于核酸分离与纯化的另一个例子是用oligo ( dT)2纤维素层析法从真核细胞总RNA 中分离带poly (A) 尾的mRNA。在该方法中,短链oligo (dT) 通过其52磷酸与纤维素的羟基共价结合而连接至纤维素介质上。当样本经过oligo (dT) 柱时,mRNA 因其poly (A) 可与短链oligo (dT) 形成稳定的RNA2DNA 杂合链,而被连接到纤维素介质上,从而与其他RNA 分离。在适当的条件下(低盐、加热) ,poly (A) RNA 可被水洗脱而得以纯化。

离子交换层析以具有离子交换性能的物质为固定相,其与流动相中的离子能进行可逆交换,从而能分离离子型化合物。用离子交换层析纯化核酸是因为核酸为高负电荷的线性多聚阴离子,在低离子强度缓冲液中,利用目的核酸与阴离子交换柱上功能基质间的静电反应,使带负电荷的核酸结合到带正电的基质上,杂质分子被洗脱。然后提高缓冲液的离子强度,将核酸从基质上洗脱,经异丙醇或乙醇沉淀即可获得纯化的核酸。该法适用于大规模核酸的

纯化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 缓冲液平衡层析柱,加样后用含1 M NaCl 的TE 缓冲液洗脱核酸,获得了很好的分离效果。

(3) 密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带, 该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。

磁珠提取DNA原理 (2)

磁珠纯化DNA原理 1、DNA与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理就是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化 方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG与盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程就是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状 材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心就是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面就是羧基(-COOH)修饰 的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG就是影响DNA回收的决定性因素(其她因素还包括DNA 大小与浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要就是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG与盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这就是由于带正

磁珠纯化DNA的原理

磁珠起源 磁珠目前广泛应用于NGS实验中,DNA、RNA的纯化,片段筛选……今天,我们就聊一聊磁珠。 首先说一下磁珠的起源: 磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad,他在1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)为主要材料,制造出均匀磁化的球体粒子。1979年Vogelstein等报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段,而后基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术广泛发展起来(Vogelstein B,Gillespiet D. Proc https://www.doczj.com/doc/ad1667250.html,A,1979,76(2):615~619)。基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种 现代分子生物学和医学对高通量,高灵敏度,自动化操作的需求也是与日俱增,于是20世纪90年代,磁珠法DNA提取技术由此得到了大力发展。硅质膜磁珠是一类最早出现基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展起来的的产品,它广泛应用于DNA、RNA的纯化。与离心柱法原理相同,离心柱法所采用的硅胶膜实际上就是玻璃纤维,而磁珠之所以能够结合核酸也是因为其表面包被了玻璃纤维。硅质膜二氧化硅磁珠具有超顺磁性内核和二氧化硅外壳,表面修饰大量的硅羟基。磁珠表面的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合,在高盐条件下与核酸结合,而在低盐环境下被洗脱,这样就可以直接从复杂的生物体系中迅速分离核酸。 到现在纳米级别的磁珠发展已经各式各样了,表面性质各不相同,分离原理也不尽相同。 但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯 乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是官能基团修饰的高分 子材料所构成,其中官能基团行使与核酸结合的工作,提取、生物素捕获、片段筛选功能的 不同,表面官能基团不同。当然不仅磁珠应用在核酸制备上,在化学发光、细胞分选、蛋白 纯化等应用磁珠依然是大显身手,是因为不同的官能基团,或者偶联其它,如蛋白抗体等。 毋庸置疑,NGS上用的最多还是我们的老熟人——贝克曼的XP磁珠。这种羧化磁珠比 羟基磁珠产量更高,非特异性结合更少。XP磁珠采用SPRI(固相可逆固定化)技术:在较 高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去,DNA胶体热力学稳定性破坏,构象也随之 改变,带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面;带负电荷的磷酸基团通过Na+与羧基形成“电

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤 日期:2012-05-22 来源:互联网 标签:核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸,从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏,参与BRAND竞猜活动,获赠BRAND产品! GeneCopoeia:qPCR mix免费试用体验活动开始! 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸,从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料,来吸附核酸,其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE,COOH)等,从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散,从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒,基于这种技术的试剂盒,名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性:排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ~> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

全自动磁珠提取纯化系统416-1

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第四章 核酸分离纯化

第四章核酸分离纯化 一、学习目标 掌握 DNA和RNA分离纯化的步骤、原则和常用方法。 熟悉常见临床分子生物学检验标本的种类、标本处理的一般原则。 二、重点和难点内容 (一)临床分子生物学检验标本的主要种类: 血液标本(全血、血清、血浆、外周血单个核细胞)、分泌物标本(鼻咽分泌物、生殖道分泌物、唾液、痰液、胃液等)、组织标本等。 (二)临床分子生物学检验标本的主要处理原则: (1)适时、适量采集标本。 (2)低温运送与保存。 (三)核酸分离纯化的步骤: (1)制备细胞及破碎细胞。 (2)消化蛋白质,去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子。 (3)去除其它不需要的核酸分子。 (4)沉淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质。 (四)核酸分离纯化的原则:

(1)维持完整度(抑制DNA酶或RNA酶对DNA或RNA 的降解活性)。 (2)确保高纯度。 (五)分离纯化后的理想DNA样品应具备的条件: (1)不含对后续检测所用酶(如后续PCR检测所用酶:DNA聚合酶)的活性有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。 (2)最大程度上避免蛋白质、多糖和脂类的污染。 (3)排除RNA分子的污染与干扰。 (六)核酸分离纯化的方法: (1)基因组DNA 的分离纯化 酚抽提法 吸附柱法(原理:基于高盐缓冲系统下,DNA与硅基质的可逆结合来分离纯化DNA) 磁珠法(原理:基于磁珠表面修饰的对DNA有吸附作用的官能基团,通过其与DNA的可逆结合、磁场对磁珠的作用来分离纯化DNA) (2)总RNA的分离纯化 Trizol (异硫氰酸胍&苯酚混合液)法 总RNA提取试剂盒(吸附柱法&磁珠法) (3)mRNA的分离纯化 寡聚(dT)-纤维素柱层析法

磁珠纯化原理

磁珠法纯化D N A原理磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸 发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料,来吸附核酸,其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式 AMPure bead :NaCl,7% PEG8000 标准的AMPure xp是用来筛选掉100bp的DNA片段,通过改变PEG8000的含量可改变至(MAX 300bp,MIN 50bp),PEG8000的浓度越高越能筛选出片段小的DNA Streptavidin magnetic bead (链霉亲和素磁珠): Streptavidin(SA)链霉亲和素,magnetic磁性的,亲和素能与生物素之间存在强度最高的非共价作用(称作BAS系统)二者结合形成复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性;而且酸、碱、 变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。 玻璃奶: 是一种白色硅颗粒,能到50kb大小的DNA(双链,单链,线状,超螺旋),结合原理:在高盐状态下,玻璃奶周围的负电荷被打破,并允许DNA磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合,在低盐时 (H20或1X TE)溶解分离 DNA<100bp时,高盐状态下结合率高;DNA>100bp时,低盐状态下结合率高;pH<时,结合 率高。 氧化硅羟基磁珠:此种微球具有核壳结构,即超顺磁性核心以及无机氧化硅外壳,硅烷醇集团(羟基)在chaotropic(盐酸胍、异硫酸氰胍等)存在条件下,能够与溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合,而不与蛋白质和其它杂质结合 氧化硅羧基磁珠:该磁珠表面修饰有羧基官能团,能够在特殊试剂(如EDC)作用下将蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到磁珠表面,可应用在蛋白纯化,核酸纯化,亲和层析等领域。

磁珠提取DNA原理

磁珠纯化DNA原理 1.DNA与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是羧基(-COOH)修饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG是影响DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA 大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结

合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收方式,还具有3个明显的优势:1)效率更高,以DNA为例,1μL磁珠的承载量可达7μg;2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,更加安全;3)操作简单,无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。 2.蛋白酶K的作用 蛋白酶K具有降解蛋白的功能,而细胞膜主要是由蛋白质构成的富有弹性的半透性膜,因此蛋白酶K能够裂解细胞,从而DNA能够释放出来。 3. 无水乙醇沉淀DNA 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。 4.TE缓冲液溶解DNA 采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,并且TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。 5.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵? 在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

磁珠法

磁珠法提取DNA试剂盒 磁珠法提取DNA试剂盒,它是生物科学和纳米材料科学二者合一的高新技术产品,是我国DNA提取技术和纯化技术的一次大的突破,它彻底的解决了我国DNA的提取与纯化长期依赖进口的局面,其价格只有进口产品的1/3。 中文名 磁珠法提取DNA试剂盒 属性 高新技术产品 学科 生物科学和纳米材料科学二者合一 贡献 一次大的突破 价格 进口产品的1/3 技术现状 两个问题 目录 1背景 2DNA提取技术现状 3发展历程 4适用范围 5优势 1背景 众所周知,DNA提取技术是分子生物学研究的基础技术。提取DNA的纯度及结构的实验,是进行基因工程各项研究所必须的条件,DNA提取技术是DNA检验的第一步骤,也是最关键的步骤。能否成功地进行DNA检验,完全取决于能否从生物检材中获得纯量的DNA。DNA提取技术的优劣,将直接关系下游实验的安全与成败。 2DNA提取技术现状 就我国的DNA提取技术现状来讲,主要存在以下两个问题: 1,技术发展滞后。现在采用的DNA提取技术仍然停留chelex—100法。有机提取法等常规方法上,存在着提取DNA不纯、耗时、效率低,不能定量提取和DNA提取后扩增成功率低等诸多缺陷。 2,缺少自主的知识产权。美国、德国、挪威、芬兰等国家的生物公司,这些年来相继开发的新的DNA提取试剂盒,成功的解决了DNA提取纯化和定量提取等很多的难题,尤其是

磁珠法可以实现自动化提取的技术更加的诱人。但由于这些试剂盒基于专利技术,价格昂贵,不可能在国内推广使用。应用于建立DNA数据库所需大量的生物样本的提取,更是可望不可及的事情。 3发展历程 2005年7月25日,磁珠法提取DNA试剂盒在公安部第三期法医物证检验技术推广班上受到参会百余名专家学者的一致认可。 2005年11月30日,磁珠法提取DNA试剂盒通过公安部刑事技术产品质量监督检验中心检验。 2005年8月12日,磁珠法提取DNA试剂盒在教育部、初高中生物实验课经验交流会议上受到来自生物实验课知道老师的一致认可和好评。 2006年3月,中国动植物检验检疫所、国家质检总局食品安全局,农业部食品局达成意向,由动植物检验检疫研究所牵头,用磁珠法提取DNA试剂盒进行食品和实用油脂中转基因植物成分定性检测、试验。 4适用范围 磁珠法提取DNA试剂盒是纳米技术、分子生物学技术、生物医学技术和法医学技术的综合高科技产品。可广泛应用于分子生物学中的基因组研究、分子进化研究、医学中遗传病的研究、突变基因的检测、肿瘤的筛查、HPV等的检测、HLA分型、移植配型等、法医学生物样本血斑、精斑、头发、烟蒂等现场证物的检测、和司法上的亲子鉴定、血缘关系的鉴定等提供证据、考古学、大中小学的生物试验等许多领域。磁珠法提取DNA试剂盒要比传统的方法,例如:Chelex100 法、有机法、二氧化硅法、盐析法等更为简单、方便,转移离心管的次数较少,不易污染等。磁珠法在DNA纯化、微量检裁及PCR扩增等方面是其它方法不可代替的。 5优势 独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA选择性吸附于磁珠,再通过一系列快速的漂洗-分离的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。 产品特点: ·不使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤,而且省去了离心步骤。 ·快速简捷,一般可在36分钟内完成。 ·不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度,提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9, 长度可达2 0 k b - 5 0 k b,可直接用于P C R、Southern-blot和各种酶切反应。 ·洗脱液可以用双蒸水代替,不影响下游酶切、连接等反应。 ·适用范围: 新鲜植物、动物组织,高温干燥过 DNA破坏比较严重的植物、动物组织,海洋生物,法医鉴定,新鲜哺乳动物血液或干血点,转基因食品

磁珠提取DNA原理

. 磁珠纯化DNA原理1.DNA与磁珠作用原理)的分离纯化方分选磁 珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)、以及盐离子等,在、聚乙二醇(PEG法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA(即DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面一定浓度的PEG和盐离子环境中,分子可以被洗脱回固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状第最内层的核心是聚苯乙烯、材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,O)修四氧化三铁(Fe),最外层表面是羧基(-COOH二层包裹磁性物质——43饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA在整个体系中,PEG是影响存在条件PEG大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的发生脱水反应,分子构象会发生急剧变NaCl或MgCl促进条件下,使DNA下,2分子量、浓度以PEG化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,DNA及盐浓度的不同,不同长度的的分子DNA 的功能主要是与盐离子共同作用,特定分子量的PEG改变不同长度构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增除此加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。PEG之外,

,因脱水作用而发生分子构象改变后,当处于PEGDNA和盐离子环境中的与表面带负电荷的羧基磁珠结会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,1 / 2 . 合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这是由于 +)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na带正电荷的盐离子的作用(如Na+和盐PEG)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当, 解除其三者之间的离子DNA类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化被纯化出来。DNA相互作用,使得吸附到磁珠的 磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收磁珠的承载量DNA为例,1μL3方式,还具有个明显的优势:1)效率更高,以操作简单,3)更加安全;;2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,可达7μg 无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。 K的作用2.蛋白酶而细胞膜主要是由蛋白质构成的富有弹性的K具有降解蛋白的功能,蛋白酶能够释放出来。半透性膜,因此蛋白酶K能够裂解细胞,从而DNADNA 无水乙醇沉淀3. 的方法。乙醇的优点是DNA 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀因此乙醇与核酸不会起任何化学反应,可以任意比和水相混溶,对DNA很安全,失水而周围的水分子,使DNADNA是理想的沉淀剂。当加入乙醇时,乙醇会夺去易于聚合。DNA 4.TE缓冲液溶解,不存)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris 采用 Tris-HCl(pKa=8.0系统,并Tris-HCl在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用 EDTA更能稳定DNA的活性。TE且缓冲液中的 DNA时,还要加少量的异戊酵?为什么用酚与氯仿抽提5. 这时在混合液内易时,在抽提DNA为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,所气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,产生气泡,使离心后的上层水相,以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。2 / 2

磁珠提取DNA原理

磁珠纯化DNA 原理 1.DNA 与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI )的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA 、聚乙二醇(PEG )、以及盐离子等,在一定浓度的PEG 和盐离子环境中,DNA 可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA 分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe 3O 4),最外层表面是羧基(-COOH )修 饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG 是影响DNA 回收的决定性因素(其他因素还包括DNA 大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA 在一定浓度的PEG 存在条件下,NaCl 或MgCl 2促进条件下,使DNA 发生脱水反应,分子构象会发生急剧变 化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG 分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA 可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG 的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度

DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。

磁珠提取DNA原理

磁珠提取D N A原理 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

磁珠纯化DNA原理 与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是羧基(-COOH)修饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG是影响DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收方式,还具有3个明显的优势:1)效率更高,以DNA为例,1μL磁珠的承载量可达7μg;2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,更加安全;3)操作简单,无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。

磁珠提取DNA原理讲课教案

磁珠提取D N A原理

精品资料 磁珠纯化DNA原理 1.DNA与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是羧基(-COOH)修饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG是影响DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA 大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠 仅供学习与交流,如有侵权请联系网站删除谢谢2

磁珠分离技术

磁珠分离技术 摘要:主要介绍了磁珠分离技术的基本概念,基本原理还有它的特点。磁珠分离技术中应用最广泛的是免疫磁珠分离技术,这里详细说明了免疫磁珠分离技术的结构以及有由它的结构决定的它的一些重要特性,以及免疫磁珠分离技术的制备原理和方法。并且详细说明了免疫磁珠分离技术的重要应用,为帮助同学了解记忆,例举了一些该技术的应用实例。 基本概念:磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体, 可分散于基液中形成磁性液体材料, 它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点, 从而使固一液相的分离变得十分方便快捷。磁珠法的出现和应用,给生命科学的研究提供了一种新式的手段和武器, 也给大、中学生对的直观认识提供了一个简捷、客观的实验途径。其中最常用的事免疫磁珠技术。 原理:利用人工合成的内含铁成分,可被磁铁磁力所吸引,外有功能基团,可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠,作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后,则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物,这种复合物具有较高的磁响应性,在磁铁磁力的作用下定向移动,使复合物与其他物质分离,而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。 特点:应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点: 粒径比较小, 比表面积较大, 具有较大的吸附容量; 物理和化学性能稳定, 具有较高的机械强度, 使用寿命长; 具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。载体微球有纳米级、微粒级的, 纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快, 悬浮稳定性好; 比表面积大, 偶联容量大; 超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分散与回收。 免疫磁珠(Immonumagnetic beads,IMB简称磁珠),由载体微球和免疫配基结合而成。载体微球的核心部分为金属小颗粒(Fe304,Fe203),是一种磁性高且较稳定的磁性材料,核心外包裹一层高分子材料(如聚氯乙烯,聚苯乙烯,聚乙烯亚胺),最外层是功能基层,如羟基(.OH),氨基(.NH2),醛基(-CHO),羧基(一COOH)。

MACS磁珠分选

MACS磁珠分选 免疫磁珠法分离细胞原理 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。 一、磁性细胞标记方式 应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记,并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式:直接标记和间接标记。 1、直接磁性细胞标记(Direct magnetic cell labeling) (磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞)直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。 2、间接磁性细胞标记(Indirect magnetic cell labeling) (磁珠结合不需要的细胞,游离于磁场的细胞为所需细胞)间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞,再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。 几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗,均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用:当没有直标磁珠时;需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞;间接标记有放大作用,因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用;使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。(一般而言,阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大,阳性分离法用行更多。) 二、MACS分选策略 有两种基本的分选策略 阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠,从而实现细胞亚群的分选。 1、阳性分选策略(Positive selection strategy) 阳性分选中,目的细胞被磁性标记后,作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠,可立即用于培养

磁珠法核酸提取原理解决方案

磁珠法核酸提取原理解决方案 说到磁珠法,那我们首先当然必须得了解磁珠,什么是磁珠呢?磁珠是利用一定的组织包被四氧化三铁核心而形成的可以被磁铁吸附的同时有能通过表面包被物吸附(结合)核酸的神奇的小珠子。之所以说他神奇,是因为他的用途很大!它可以实现核酸提取的自动化和高通量化。 磁珠结构: 磁珠一般分为三层结构: 1.最内层:为支持结构,如聚苯乙烯做的内核; 2.中间层:磁层,作用是与磁力架上的磁铁相互吸附,从而分离核酸与反应溶液,材料通常为Fe3O4; 3.最外层:修饰层,一般为带负电的基团; 磁珠法核酸提取原理 在磁珠法的反应体系中,核酸分子(DNA & RNA)会由线性压缩成球状,暴露出核酸骨架上大量的负电基团与反应体系中的阳离子连接,在磁珠最外层负电基团的作用下,形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构,使核酸分子被特异性地吸附到磁珠表面。而当反应缓冲液被弃除后,加入水性分子,会快速充分水化核酸分子,解除三者之间的离子相互作用,使吸附到磁珠上的核酸分子被纯化出来。 磁珠法核酸提取的优势 磁珠法DNA提取是纳米科技与生物技术的完美结合,具有其它DNA提取方法不可比拟的优势: (1)样本需求量低:微量的材料即可提到高浓度的核酸;

(2)操作简单快速:整个操作流程基本分为五步(裂解、结合、洗涤、干燥、洗脱),全程无需离心操作,大多可在30~60分钟内完成; (3)质量稳定可靠:游离的磁珠与核酸的结合量更大,特异性的结合使得核酸纯度更高,且可通过控制磁珠表面基团来调节核酸回收量; (4)全自动化操作:采用核酸提取仪可实现自动化、高通量操作,可实现几十甚至几百个样品的提取;(5)安全无毒无害:试剂不含酚、氯仿等有毒化学试剂,完全符合现代化环保理念。 磁珠法——其他应用领域 当然,除了用作核酸提取,根据不同的表面处理与标记,还可将磁珠应用到其他的领域 ①.细胞分离(CD4、CD8) 可进一步用于肿瘤检测与诊断等 ②.蛋白、抗体分离(氨基磁珠、羧基磁珠、环氧基磁珠) 可进一步用于疾病的检测与诊断等 磁珠——根据不同的表面处理与标记,可将磁珠分成各种不同的应用类型 磁珠羧基#U0001 MaxBead Protein A #U0084 MaxBead Carboxyl Labeling试剂盒#KA3267 细胞与组织DNA分离试剂盒(磁珠系统) #62500 EpiMag 96孔高通量磁力分离器#Q10002-1

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

日期:2012-05-22 来源:互联网 标签:核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要 : 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸,从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏,参与BRAND竞猜活动,获赠BRAND产品! GeneCopoeia:qPCR mix免费试用体验活动开始! 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸,从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料,来吸附核酸,其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE,COOH)等,从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散,从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒,基于这种技术的试剂盒,名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性:排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ~ > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。 (2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、

磁珠法纯化DNA原理

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnet ic Silic a Partic le)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料,来吸附核酸,其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE,COO H)等,从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散,从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒,基于这种技术的试剂盒,名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长 链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ~> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。 (2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。 (3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1~4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。 2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。

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