植物学通报 2005, 22 (2): 138￣146
高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源
黄 骥 候夫云 王建飞 张红生①
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室南京 210095)
摘要葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是植物戊糖磷酸途径中的两个关键酶。在克隆了水稻质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因Os6PGDH2基础上，分析比较了水稻胞质和质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的基因结构、表达特性和进化地位。结合双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的分析结果，认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化方式上截然不同，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质基因与动物和真菌等真核生物具有共同的祖先；6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生。讨论了植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可能的进化模式，为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料。
关键词葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，基因结构，进化，水稻
Evolution Styles of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase and 6-Phosphaogluconate Dehydrogenase Genes in Higher Plants HUANG Ji HOU Fu-Yun WANG Jian-Fei ZHANG Hong-Sheng①
(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University,Nanjing210095)
Abstract Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphaogluconate dehydro-genase (6PGDH) are key enzymes in the plant pentose phosphate pathway. This paper intro-duces the isolation of two rice cDNAs encoding plastid G6PDH and 6PGDH and describes the analysis of the genes structure, expression profiling and phylogenetic tree of all four G6PDH and 6PGDH genes: OsG6PDH1 for cytosolic G6PDH, OsG6PDH2 for plastid G6PDH, Os6PGDH1 for cytosolic 6PGDH, and Os6PGDH2 for plastid 6PGDH. In higher plants, the distinct evolution styles of G6PDH and 6PGDH reveal that plant cytosolic G6PDH gene may have a common ances-tor with animal and fungi, while cytosolic 6PGDH and its plastid isozyme both have an endosym-biotic gene-replacement origin. This paper discusses the possible evolution styles of G6PDH and 6PGDH enzymes and supplies new data on the evolution of higher plants and their plastids. Key words Glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphaogluconate dehydrogenase, Gene structure, Evolution, Rice
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: hszhang@https://www.doczj.com/doc/a960110.html,
收稿日期：2004-08-02 接受日期：2005-02-02 责任编辑：孙冬花
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戊糖磷酸途径(p e n t o s e p h o s p h a t e pathway, PPP)是植物体中糖代谢的重要途径，其主要功能是产生供生物合成所需的还原力NADPH以及核酸合成的戊糖(Wood，1986)。对菠菜的戊糖磷酸途径研究结果表明完整的PPP发生在植物的质体中，但在胞质中也发现了PPP的两个关键酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydroge-nase, G6PDH, EC1.1.1.49)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphaogluconate dehydrogenase, 6PGDH, EC1.1.1.44)的活性(Schnarrenberger et al.，1995)。因此认为戊糖磷酸途径的发生途径主要在质体中，胞质中戊糖磷酸途径的一些中间产物通过转运体进入质体中完成完整的PPP(黄骥等，2004)。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化戊糖磷酸途径的第1步反应，即6-磷酸葡萄糖的脱氢，是PPP途径的限速步骤。目前在马铃薯(Graeve et al.，1994)和小麦(Nemoto and Sasakuma，2000)中分离了胞质G6PDH基因，在马铃薯(Schaewen et al.，1995)、菠菜(Schnarrenberger et al.，1995)和烟草(Knight et al.，2001)中分离了质体G6PDH基因。6PGDH是PPP途径的另一限速酶，催化6-磷酸葡萄糖酸脱氢后生成5-磷酸核酮糖。Tanksley和Kuehn (1985)通过凝胶电泳发现了番茄中存在4种6PGDH，其中3种存在于胞质，1种位于质体。目前在苜蓿(F a h r e n d o r f e t a l.，1995)和玉米(Redinbaugh and Campbell，1998)中分离了胞质6PGDH基因，而仅在菠菜(Krepinsky et al.，2001)中分离了其质体基因。
戊糖磷酸途径是植物中重要的代谢途径，主要在细胞的质体中发生，因此戊糖磷酸途径是被用来进行高等植物及质体进化分析研究的很好素材。而G6PDH和6PGDH分别是戊糖磷酸途径的两个关键酶，因此通过这两个酶的研究有望获得高等植物进化的新资料。对于高等植物质体的起源，一般认为是原核生物(蓝细菌)通过内共生成为植物的细胞器，在进化过程中有些基因进入了植物基因组，转移进入植物基因组的基因产物在转运肽的引导下重新返回细胞器行使功能(Weeden，1981)。但是并不是所有这样的基因经细胞核编码后全部都返回质体行使功能，在进化过程中，有些也进入了细胞的其他区间(Weeden，1981)。Krepinsky等(2001)通过系统发生树的研究认为6PGDH起源于蓝细菌的内共生，但对于G6PDH和6PGDH的比较研究还很少，对于二者进化起源的详细机制也没有进行较为明确的阐述，同时除了系统发生树之外还缺乏实验上的证据。
随着基因组计划的发展，越来越多的真核生物和原核生物进行了全基因组的序列测定。对于生物的进化研究无疑起了巨大的推动作用，使我们有可能在一个生物体内进行深入的研究。借助于水稻基因组和EST资料，我们已经克隆了水稻G6PDH和6PGDH 的胞质基因OsG6PDH1(黄骥等，2002a)和Os6PGDH1(Huang et al.，2003)，在此基础上，又首次从水稻中克隆了两个酶的质体基因OsG6PDH2和Os6PGDH2。通过对这4个基因的结构、表达特性以及进化地位差异的比较研究，认为高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在进化起源方式上截然不同，从而在基因结构上为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的内共生起源提供新的实验证据，也为高等植物及质体的进化起源提供了新的资料。
1 材料和方法
1.1 植物材料
太湖流域粳稻地方品种‘韭菜青’，由南京农业大学水稻研究所提供。材料的培养和取样参考黄骥等(2002a)介绍的方法进行。
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1.2 RNA的提取和cDNA第一链的合成
RNA的抽提采用上海华舜公司的Trizol System Ⅳ试剂，RNA经过甲醛变性凝胶电泳确认其完整性后，再经过DNAse I处理。
2 μg的总RNA用于cDNA第一链的合成(promega)。
1.3 OsG6PDH2和Os6PGDH2的克隆与序列测定
分别以拟南芥质体G6PDH(GenBank AC: AJ001359)和菠菜质体6PGDH的氨基酸序列(Krepinsky et al.，2001)为信息探针，通过Blast程序搜索位于GenBank的水稻dbEST和基因组数据库，经过EST拼接和基因组结构预测，获得了OsG6PDH2和OsG6PDH2的预测cDNA序列。根据预测的两个基因的cDNA序列，设计特异引物(表1)，通过RT-P C R的方法从水稻幼苗组织中克隆了OsG6PDH2和Os6PGDH2基因。OsG6-PDH2和Os6PGDH2经与pGEM-T载体连接及转化大肠杆菌JM109后由上海基康公司完成序列测定。
1.4 基因结构分析
将获得的cDNA序列与GenBank中的基因组数据(https://www.doczj.com/doc/a960110.html,)(分别来源于华大基因中心和IRGSP)进行比较，分析外显子与内含子的大小和位置。
1.5 组织表达分析
分别以水稻根和叶的第一链cDNA为模板进行半定量RT-PCR表达谱分析，同时设定actin为内部参照，PCR引物序列见表1，PCR扩增程序及cDNA模板浓度的调整参考黄骥等(2002a)方法。
1.6 系统发生树的重建
分别将GenBank中注册的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的完整氨基酸序列经过Clustalx软件(版本1.8)进行多序列比较后，利用Phylip软件包(版本3.6)绘制相邻连接法(neighbor-joining method) (Saitou and Nei，1987)系统发生树，用TreeView程序显示绘制的进化树结果。
2 结果与分析
2.1 水稻OsG6PDH2和Os6PGDH2的克隆与序列分析
分别利用编码拟南芥质体G6PDH蛋白和菠菜质体6PGDH蛋白的氨基酸序列与水稻基因组序列的比较，借助EST拼接和基因结构预测软件的帮助，获得水稻G6PDH和6PGDH 的基因编码顺序，成功克隆了两个新的水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Os6PGDH2。经过序列测定，O s G6P D H2全长1768b p，Os6PGDH2全长1 480 bp。经过BioXM软件分析，OsG6PDH2和Os6PGDH2的完整ORF 分别编码了588个和 508个氨基酸，分别与胞质基因OsG6PDH1与Os6PGDH1的氨基酸相似性为49%与66%。在OsG6PDH2的N端，我们发现一个55个氨基酸的转运肽序列，推测的裂解位点在第55位的甘氨酸G l y和56位的丙氨酸之间；在Os6PGDH2的N端，我们发现一个37个氨基酸残基的转运肽序列，裂解位点在第37
表1文中基因的PCR引物序列
Table 1 The sequences for PCR priners used in this paper
Gene Primer sequences
OsG6PDH15'-cggtatattgctgaaggaaga-3'5'-tgtctgtctatgcaagggtg-3' OsG6PDH25'-catggcgctctcctgcatg-3'5'-atcatctgggtcatgccttc-3' Os6PGDH15'-tccgcgatttcgtcagttac-3'5'-atggagatagctatggacctc-3' Os6PGDH25'-tcgccaccatgggccaga-3'5'-tcctcaaatggccgcacc-3' actin5'-ggaactggtatggtcaaggc-3'5'-agtctcatggataaccacag-3'
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位的丙氨酸Ala和第38位的亮氨酸Leu之间。因此我们认为O s G6P D H2编码质体G6PDH，而Os6PGDH2编码质体6PGDH。在联机比较分析中，没有发现与OsG6PDH2和Os6PGDH2相同的已发表的水稻基因序列，OsG6PDH2和Os6PGDH2系我们分离的新基因，在GenBank中的登录号见表2。
2.2 水稻OsG6PDHs与Os6PGDHs的基因结构分析
我们将分离得到的所有4个水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的cDNA序列与水稻基因组序列进行比较，分析其内含子和外显子结构，结果表明水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的胞质和质体基因都含有多个内含子结构(表2)，而6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的胞质和质体基因在完整ORF内都不含有内含子结构。此外我们用同样的方法分析了双子叶模式植物拟南芥两种酶基因的基因结构以及一个烟草质体G6PDH基因(Knight et al.，2001)的基因结构。基因结构的结果显示，所有高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的编码区部分均含有多个内含子结构，而所有分析的植物6PGDH的基因在编码区均不含有内含子结构。
2.3 水稻OsG6PDHs与Os6PGDHs的组织表达分析
利用半定量RT-PCR的方法我们分析了4个水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因在绿色组织叶片和非绿色组织根中的表达。研究结果表明，在检测的组织中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的表达相对较高，OsG6PDH1和OsG6PDH2在根和叶片中的表达基本一致(图1)，但Os6PGDH1和Os6PGDH2在根与叶片中的表达不同，Os6PGDH1编码胞质酶，在根和叶片中的表达都很低，尤其在叶片中几乎检测不到表达(图1A)，但Os6PGDH2在叶片中的表达则略高于根(图1B)。
2.4 G6PDH和6PGDH的进化分析
通过GenBank/EMBL/DDBJ的氨基酸数据库检索，我们得到了从低等生物到高等生物已经在数据库中发表的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的氨基酸序列。利用Phylip软件包，绘制了基于相邻连接法的G6PDH和6PGDH系统发生树(图2，图3)。由于进化树分析的生物包括低等的原核生物到高等的真核生物，涵盖多个门类，因此认为进化树具有一定的代表性。两棵进化树的分子进化过程与生物物种的整体进化过程，即由低到高，由简单到复杂的演变过程一致，这种一致性也表明了G6PDH 和6PGDH在生物体的生命活动过程中担负着重要的使命。
表2 G6PDH和6PGDH的基因结构
Table 2 The structures for G6PDH and 6PGDH genes in higher plants
Enzyme Species Gene Number of introns in Type GenBank No.
coding region
G6PDH Oryza sativa OsG6PDH114Cytosolic AY078072
OsG6PDH29Plastid AY339367 Arabidopsis thaliana AtG6PDH114Cytosolic AY065054
AtG6PDH28Plastid AY065042
AtG6PDH37Plastid AJ001359 Nicotiana tabacum TOBAp9Plastid AF231351 6PGDH Oryza sativa Os6PGDH10Cytosolic AF486280
Os6PGDH20Plastid AY278362 Arabidopsis thaliana At6PGDH10Cytosolic AF424591
At6PGDH20Plastid AY125503
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在G6PDH 的系统发生树中(图2)明显地将生物分为真核生物(eukaryote)和真细菌(eubacteria)，真核生物中的G6PDH 又分为3
个分支：来源于动物和高等植物的胞质酶、真菌(酵母)来源以及来源于绿藻和高等植物的质体酶；剩余的G 6P D H 则来源于真细菌类，如蓝细菌(cyanobacteria)(图2C)等。水稻的胞质G6PDH(O.sativa-1，示相应的蛋白质名，下同)与小麦胞质G6PDH(T.aestivum)
同为单子叶植物胞质G6PDH 而同属一分支，而双子叶植物拟南芥(A.thaliana-1)、烟草(N.tabacum-1)和苜蓿(M.sativa)胞质G6PDH 则属于另一分支，两个分支结合甜杨(P.suave-olens)的胞质酶，共同组成了高等植物胞质G6PDH 分支(图2A)。水稻的质体G6PDH(O.sativa-2)则与烟草(N.tabacum-2, N.tabacum-3)和拟南芥(A.thaliana-2，A.thaliana-3)等高等植物质体G6PDH 则处于另一个分支(图2B)。此外，包括人(H.sapiens)、小鼠(M.cusculus)和果蝇(D.melanogaster)等动物G6PDH 酶也被分
为了一个分支，但值得注意的是动物G6PDH 酶与高等植物胞质G6PDH 被分为了一个较大的分支。系统发生树将属于绿藻的G 6P D H (D.b i o c u l a t a )与高等植物的质体G6PDH 归属于同一个分支(图2B)，验证了高等植物质体起源于绿藻的假说。
在6P G D H 的系统发生树中(图3)，6PGDH 的分类方式明显与G6PDH 不同，被
分为了3个大类：植物和蓝细菌、动物与真菌以及除了蓝细菌以外的其他真细菌。水稻的胞质6PGDH(O.sativa-1)与玉米(Z.may-1, Z.may-2)同为单子叶植物6PGDH 而同属一分支，而双子叶植物拟南芥(A.thaliana-1)、大豆(G.max)、菠菜(S.oleracea-1)和苜蓿(M.sativa)等胞质6PGDH 则属于另一分支，其中苜蓿和大豆的进化地位完全一致(图3A); 水稻(O.sativa-2)、拟南芥(A.thaliana-2)和菠菜(S.oleracea-2)质体6GPDH 则处于另一个分支(图3B )，两个分支共同组成了高等植物的6PGDH 。褐藻6PGDH(L.digitata)与高等植物6PGDH 被分为了同一个大的分支，表明了
与高等植物的近缘关系，也说明了褐藻
6PGDH 的进化先于高等植物胞质和质体酶的分化。此外，图中的蓝细菌(图3C )则明显地与植物6P G D H 进化地位相近，暗示了6PGDH 的内共生起源。在6PGDH 的系统发生树中，动物和真菌的6PGDH 与植物和蓝
细菌的6PGDH 进化关系上相距较远，表明了它们之间较远的亲缘关系。从G6PDH 和6PGDH 的系统发生树我们可以得出以下结论：1)高等植物胞质G6PDH 基因在进化地位上更接近于动物的G6PDH 基因，而与质体G6PDH 基因则不在同一个分支；2)高等植物G6PDH 基因与蓝细菌G6PDH 基因在进化地位上相距较远；3)高等植物胞质6PGDH 与质体6PGDH 基因进化地位接近，处于相同分支，且都与动物和真菌的6PGDH 相距较远；4)胞质和质体6PGDH
与蓝细菌的
图1 OsG6PDHs 和Os6PGDHs 在水稻根和叶片中表达的半定量RT-PCR 分析
A. 胞质葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH1和胞质Os6PGDH1基因在水稻根和叶片中的表达;
B. 质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH2和质体Os6PGDH2基因在水稻根和叶片中的表达; 1. 根; 2. 叶Fig.1 The semi-quantity RT-PCR analysis of OsG6PDHs and Os6PGDHs in rice roots and leaves A. The expression of OsG6PDH1 and Os6PGDH1 in rice roots and leaves; B. The expression of OsG6PDH2and Os6PGDH2 in rice roots and leaves; 1. Root; 2.Leaf
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黄 骥等: 高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源
6PGDH 处于同一个大分支，进化关系较近。3 讨论
水稻全基因组序列资料的公布(Yu et al .,2002；Goff et al .,2002)为在单子叶模式植物中研究各种重要的生理生化事件提供了便利(黄骥等, 2002b)。本文分别利用来自其他物种的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的氨基酸序列，通过电子克隆的策略，从水稻中克隆了上述两个酶的同源基因，这是在同一物种中4
个基因
的首次分离，在分子水平上促进了戊糖磷
酸途径的深入研究。 本文主要报道了编码戊糖磷酸途径两个关键酶基因(胞质葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因OsG6PDH1及其质体酶基因OsG6P-DH2、胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因O s 6P G D H 1及其质体酶基因Os6PGDH2)在基因结构、mRNA 表达水平以及进化地位上的异同，认为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因明显具有不同的进化方式，为高等植物及质体的进化起源研究提供了新的资料。
图2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的系统发生树分析
虚线框A 表示来自于高等植物胞质G6PDH ，虚线框B 表示来自高等植物质体以及1个绿藻G6PDH (D.bioculata )，虚线框C 则表示来自于蓝细菌G6PDH, 图中拉丁名表示相应的G6PDH 蛋白质名。图中数字表示Bootstrap 法确定的可信任百分比。左下方标尺为0.1进化距离单位。系统发生树中的各种生物的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列来源于GenBank 。系统发生树采用相邻连接法绘制，TreeView 软件显示系统发生树的绘制结果
Fig.2 Unrooted phylogenetic tree inferred from amino acid sequences of G6PDH genes from various organisms The cytosolic G6PDH in higher plants(boxed in A), plastid G6PDH in higher plants(B) and G6PDH from cyanobacteria (C) are boxed respectively. The Latin words represent the protein names of G6PDH from corresponsive organisms. The numbers near branches indicate the bootstrap proportion for 100 replicas. The scale bar indicates 0.1 substitutions per site. The amino acids for G6PDH from various organisms are extracted from nr database in GenBank. The tree was constructed with neighbor-joining method using Phylip software. The tree was viewed using TreeView software
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OsG6PDH1、OsG6PDH2以及拟南芥的G6PDH 基因都含有多个内含子结构，但胞质G6PDH 比质体G6PDH 的内含子数目要多(表2)。在氨基酸序列上，胞质G6PDH 与质体G6PDH 也有较大差异。结合系统发生树的绘制结果，我们认为高等植物G6PDH 的胞质酶和质体酶基因的进化方式可能不同。根据已经测序完成的部分古细菌的基因组测序结果，G6PDH 基因在古细菌中是不存在的，对
此Wendt 等(1999)的解释是，要么古细菌在进化中丢失了G6PDH ，要么是真细菌中才进化出现的，而后又通过内共生转移进入了真核生物基因组中。但系统发生树的结果(图2)并不能证实G 6P D H 的内共生起源。根据G6PDH 的胞质基因与质体基因在进化及基因结构上的差异，我们假设，在内共生发生之前，动植物分化之前的原始真核生物的基因组就已经具备了G6PDH 基因，逐步进化形成
图3 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的系统发生树分析
虚线框A 表示来自于高等植物胞质6PGDH ，虚线框B 表示来自高等植物质体6PGDH ，虚线框C 则表示来自于蓝细菌6PGDH 。左下方标尺为0.1进化距离单位。系统发生树中的各种生物的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的氨基酸序列来源于GenBank 。系统发生树采用相邻连接法绘制
Fig.3 Unrooted phylogenetic tree inferred from amino acid sequences of 6PGDH genes from various organisms The cytosolic 6PGDH in higher plants (boxed in A), plastid 6PGDH in higher plants (B) and 6PGDH from cyanobacteria (C) are boxed respectively. The scale bar indicates 0.1 substitutions per site. The amino acids for G6PDH from various organisms are extracted from nr database in GenBank. The tree was constructed with
neighbor-joining method using Phylip software
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黄 骥等: 高等植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的不同进化起源
了今天的高等植物和动物的胞质基因；对于质体G6PDH ，可能是蓝细菌的G6PDH 基因在内共生过程中丢失，被原始真核生物基因组中的另一种G 6P D H 基因所取代。究竟G6PDH 有没有在古细菌中存在过还难以定论，如果没有，对于目前古细菌是真核生物直接起源的假说可能是一个挑战。
6PGDH 的系统发生树结果表明了高等植物的胞质和质体6P G D H 基因的内共生起源。Os6PGDH1、Os6PGDH2以及拟南芥的6PGDH 基因在编码区都没有内含子结构，也很好地佐证了6PGDH 起源于原核生物。可能的假说是蓝细菌的6PGDH 通过内共生进入原始植物基因组，分别形成了胞质酶基因和质体酶基因，质体酶基因重新返回质体行使功能。系统发生树的结果还表明，动物和真菌的6PGDH 明显区别于植物与蓝细菌的6PGDH 基因，但是与其他真细菌的6PGDH 相对较近，表明了在原始真核生物的内共生之前，6PGDH 基因即存在于原始真核生物基因组中，动物和真菌6PGDH 基因的多内含子结构(如稻瘟病菌的6PGDH 基因具有5个内含子，资料未列)也证实了这一点，但在后来的内共生过程中，原
参 考 文 献
始蓝细菌通过内共生成为了高等植物的质体，同时6PGDH 基因进入植物基因组，取代了原来的植物6PGDH 基因，在研究3-磷酸甘油酸激酶的进化起源(Brinkma-nn and Martin ，1996)中也发现了类似的规律。根据6PGDH 基因的结构和进化分析，我们假设，在内共生之前的原始真核生物进化早期即具备了6PGDH 基因，线粒体内共生可能引入了来自紫细菌的6PGDH ，形成了今天的动物和真菌；而蓝细
菌的内共生则替换了原始植物基因组中的6PGDH 基因，形成了今天的高等植物。与G6PDH 相同，我们也没有在古细菌基因组中发现6PGDH 基因，G6PDH 与6PGDH 不存在于古细菌中的现象势必对真核生物的起源研究
具有重要的影响。
G6PDH 和6PGDH 是戊糖磷酸途径的氧化阶段的两个关键酶，除了参与戊糖磷酸途径之外，尚未报道它们可能的其他功能或参与其他途径。进化分析表明了高等植物G6PDH 和6PGDH 基因的两个截然不同的进化方式，但是不是这种不同质性也暗示了两个基因在进化过程中的相对独立性以及除了参与戊糖磷酸途径之外，两个基因还存在其他生物学功能？
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6-磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒 产品简介： 6-磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP还原为NADPH，以供生物合成及维持细胞内的还原状态，因此6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。 G6PDH能使NADP还原成NADPH，6-磷酸葡萄糖+NADP→6-磷酸葡萄糖酸内脂+NADPH；在一定反应时间内其活性高低与反应前后生成物浓度的变化呈线性关系。本测试盒通过在340nm下测定NADPH增加速率来反应G6PDH活性的大小，NADPH浓度升高越多则G6PDH 活力越大。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外可见分光光度计、37℃恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、蒸馏水 产品内容： 提取液：60mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：储备液50mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×2支，-20℃保存；用时每只加275μL双蒸水充分溶解备用； 试剂三：粉剂×2支，-20℃保存；用时每只加275μL双蒸水充分溶解备用。 操作步骤： 一、样品测定的准备： (1)细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液的比例充分匀浆以破碎并裂解细胞。8000g离心10分钟，取上清，置冰上待测。 组织：称取100mg组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10分钟，
取上清，置冰上待测。 （2）血清（浆）样品：直接检测。 二、测定操作表： 测定管对照管试剂一（μL）750750 试剂二（μL）1010 试剂三（μL）1010 样本（μL）30 蒸馏水（μL）30 将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃或25℃水浴中（哺乳动物用37℃，非哺乳动物用25℃），准确反应5分钟。迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 注意事项： 1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。 2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。 3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
糖代谢 一、多糖的代谢 1.淀粉 凡能催化淀粉分子及片段中α- 葡萄糖苷键水解的酶，统称淀粉酶（amylase）。 主要可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、和异淀粉酶4类。 (一)α-淀粉酶 又称液化酶、淀粉-1，4-糊精酶 1）作用机制 内切酶，从淀粉分子内部随机切断α-1，4糖苷键，不能水解α-1，6-糖苷键及与非还原性末端相连的α-1，4-糖苷键。 2）水解产物 直链淀粉 大部分直链糊精、少量麦芽糖与葡萄糖 支链淀粉 大部分分支糊精、少量麦芽糖与葡萄糖，底物分子越大，水解效率越高。 (二)β-淀粉酶 又叫淀粉-1，4-麦芽糖苷酶。 1）作用机制 外切酶,从淀粉分子的非还原性末端，依次切割α-1，4-糖苷键，生成β-型的麦芽糖；作用于支链淀粉时，遇到分支点即停止作用，剩下的大分子糊精称为β-极限糊精。 2）β-淀粉酶水解产物 支链淀粉 β-麦芽糖和β-极限糊精。 直链淀粉 β-麦芽糖。 (三)γ-淀粉酶 又称糖化酶、葡萄糖淀粉酶。 1）作用方式 它是一种外切酶。从淀粉分子的非还原性末端，依次切割α-1，4-葡萄糖苷键，产生β-葡萄糖。遇α-1，6和α-1，3-糖苷键时也可缓慢水解。 2) 产物 葡萄糖。 (四)异淀粉酶 又叫脱支酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶。 1）作用方式 专一性水解支链淀粉或糖原的α-1，6-糖苷键，异淀粉酶对直链淀粉不作用。 2）产物 生成长短不一的直链淀粉(糊精)。 3）现象 碘反应蓝色加深 2.糖原 （一）糖原分解 糖原的降解需要三种酶，即糖原脱支酶，磷酸葡糖变位酶和糖原磷酸化酶。 （1）糖原磷酸化酶
该酶从糖原的非还原性末端以此切下葡萄糖残基，降解后的产物为1-磷酸葡萄糖。 （2）磷酸葡糖变位酶 糖原在糖原磷酸化酶的作用下降解产生1-磷酸葡糖。1-磷酸葡萄糖必须转化为6-磷酸葡糖后方可进入糖酵解进行分解。1-磷酸葡糖到6-磷酸葡糖的转化是由磷酸葡糖变位酶催化完成的。 （3）糖原脱支酶 该酶水解糖原的α-1，6-糖苷键，切下糖原分支。糖原脱支酶具有转移酶和葡糖甘酶两种活性。在糖原脱支酶分解有分支的糖原时，首先转移酶活性使其3个葡萄糖残基从分支处转移到附近的非还原性末端，在那里它们以α-1，4-葡萄糖苷键重新连接的单个葡萄糖残基，在葡萄糖苷酶的作用下被切下，以游离的葡萄糖形式释放。 补充： 1.糖原磷酸化只催化1，4-糖苷键的磷酸解，实际上磷酸化酶的作用只到 糖原的分支点前4个葡萄糖残基处即不能再继续进行催化，这时候就 需要糖原脱支酶。磷酸吡哆醛是磷酸化酶的必需辅助因子。 2.糖原的降解采用磷酸解而不是水解，具有重要的生物意义。 （1）磷酸解使降解下来的葡萄糖分子带上磷酸基团，葡萄糖-1-磷
葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC0930 规格：50管/48样 产品内容： 提取液：60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体47.5mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂三：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂四：液体×1支，-20℃保存； 产品说明： 葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose6phosphatase，G6Pase，EC3.1.3.9）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是糖异生过程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。 G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，变旋酶和葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NAD+还原生成NADH，在340nm下测定NADH生成速率，即可反映G6P活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。操作步骤： 一、样本的前处理： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加
入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组 织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 工作液的配制：临用前将试剂二、试剂三和试剂四转移到试剂一中混合待用；用不完的试剂4℃保存一周； 2、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）预热5分钟。 3、在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL工作液，立即混匀，记录340nm处 初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。 注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.3，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.3可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。 G6P活性计算： 1、血清（浆）G6P活力计算 单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 G6P（U/mL））＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1608×ΔA 2、组织、细菌或细胞中G6P活力计算 （1）按样本蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 G6P（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
【第五章】 4、为什么说6-磷酸葡萄糖是各个糖代谢途径的交叉点？ 葡萄糖经过激酶的催化转变成葡萄糖－6－磷酸，可进入糖酵解途径氧化，也可进入磷酸戊糖途径代谢，产生核糖－5－磷酸、赤鲜糖－4－磷酸等重要中间体和生物合成所需的还原性辅酶Ⅱ；在糖的合成方面，非糖物质经过一系列的转变生成葡萄糖－6－磷酸，葡萄糖－6－磷酸在葡萄糖－6－磷酸酶作用下可生成葡萄糖，葡萄糖－6－磷还可在磷酸葡萄糖变位酶作用下生成葡萄糖－1－磷酸，进而生成糖原。由于葡萄糖－6－磷酸是各糖代谢途径的共同中间体，由它沟通了糖代谢分解与合成代谢的众多途径，因此葡萄糖－6－磷酸是各糖代谢途径的交叉点。 6、1分子葡萄糖在肝脏组织彻底氧化可生成多少分子ATP? 1molATP水解可释放30.54KJ能量，而1mol葡萄糖彻底氧化分解后可产生2870KJ能量但其中只有1161KJ能储存在ATP中，故可形成约38molATP。（效率约为40%） 10、计算由2摩尔丙酮酸转化成1摩尔葡萄糖需要提供多少摩尔的高能磷酸化合物？ 首先，2摩尔丙酮酸+2CO2+2ATP→2草酰乙酸+2ADP+2Pi；2草酰乙酸+2GTP→2磷酸稀醇式丙酮酸+2GDP+2CO2；其次，2摩尔磷酸稀醇式丙酮酸沿糖酵解途径逆行至转变成2摩尔甘油醛-3-磷酸，其中在甘油酸-3-磷酸转变成甘油酸-1,3-二磷酸过程中，消耗2摩尔ATP；甘油酸-1,3-二磷酸转变成甘油醛-3-磷酸中，必须供给2摩尔的NADH?H+。最后，2摩尔的磷酸丙糖先后在醛羧酶、果糖-1,6-二磷酸酶、异构酶、葡萄糖-6-磷酸酶作用下，生成1摩尔葡萄糖，该过程无能量的产生与消耗。从上述三阶段可看出，2摩尔丙酮酸转化成1摩尔葡萄糖需要提供6摩尔高能磷酸化合物，其中4摩尔为A TP，2摩尔为GTP。 【第六章】
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC2100 规格:50T/48S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前配制，加入5mL试剂一，混匀。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前配制，加入5mL试剂一，混匀。； 产品说明： 磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶6PGDH依次催化NADPH 合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。 6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm吸光度增加速率，计算6PGDH活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL石英比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本的处理 称约0.1g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清液，待测。 二、测定步骤 1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于37℃水浴预热30min以上。 3.加样表：在比色皿中依次加入 试剂名称（μL）测定管（μL）空白管（μL） 样本100-
蒸馏水-100 试剂一700700 试剂二100100 试剂三100100 于340nm处测定3min内吸光值变化，第0s吸光值记为A1，第180s吸光值记为A2。记△A测定=A2测定-A1测定，△A空白=A2空白-A1空白。 三、6PGDH活性计算： 1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH的酶量为1U（U/mg pr）。 6PGDH酶活性(U/mg prot)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×106×V反总]÷(Cpr×V样)÷T =536×(△A测定-△A空白)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol NADPH的酶量为1U（U/mg prot）。 6PGDH酶活性(U/g鲜重)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×106×V反总]÷(W÷V样总×V样)÷T =536×(△A测定-△A空白)÷W ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积，0.001L；V样：反应体系中加入粗酶液体积，0.1mL； Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；V样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3min；W：样本质量，g。 注意事项： （1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融； （2）试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在4℃，可保存1周。 （3）若样本初始（0s）读值大于0.5且△A测定小于0.1，可尝试将样本进行稀释后测定。
葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性检测试剂盒说明书微量法 注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号:BC3325 规格:100T/48S 产品内容： 提取液：液体120mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体12mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前用4mL蒸馏水溶解备用。 试剂四：试剂×1瓶，4℃保存；临用前用4mL蒸馏水溶解备用。 试剂五：液体4mL×1瓶，4℃保存； 标准品：液体1mL×1支。10μmol/mL磷标准液。 产品说明： 葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose6phosphatase，G6Pase，EC3.1.3.9）是一种水解磷酸化合物的磷酸酶，广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是糖异生过程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。 G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖和无机磷，利用钼蓝法测定无机磷含量的增加，即可反映G6P活性。试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取
液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤： 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2、将10μmol/mL标准液用蒸馏水稀释16倍至0.625μmol/mL的标准溶液备用。 3、工作液的配制：试剂二中加入5mL试剂一充分溶解备用。 O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若4、定磷试剂的配制：按H 2 无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。 注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 5、操作表： 测定管对照管标准管空白管样品（μL）2020 工作液（μL）80 充分混匀，37℃（哺乳动物）或者25℃（其他物种）水 浴反应10min。反应后迅速放入沸水中沸水浴10min。取出 冷却至常温 工作液（μL）-80 10000rpm常温离心10min后取上清。 上清液（μL）2525-- 标准溶液（μL）--25- 定磷试剂（μL）125125125125 蒸馏水（μL）100100100125 充分混匀，40℃反应10min。吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中，测量660nm处吸光值，测定管、对照管、空白管、标准管测定的吸光度分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。计算△A=A测定管-A对照管，△A标准=A标准管-A空白管。 三、G6P活性计算：
What is G6PD deficiency? Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, or G6PD deficiency for short, is the most common “inborn metabolic disorder” in the world. This means that from the time a baby is born, thre is already something wrong with how his body makes and breaks important substances. According to statistics, about 400 million people have G6PD deficiency, and it is most common in Africa, Southeast Asia and the Middle East.Babies with G6PD deficiency have very little or no enzyme called Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD). An enzyme is a kind of protein that speeds up chemical reactions in the body. The enzyme G6PD is especially important to red blood cells. If this enzyme is lacking or missing, red blood cells are easily destroyed. Another name for G6PD deficiency is favism because some people who have it, usually those living in the Meditteranean region, react very badly to fava beans. What causes G6PD deficiency? In order to understand what causes G6PD deficiency, one must first learn a bit about genes and chromosomes. Genes are like the body’s blueprints. They contain instructions on how specific parts of the body are made. For example, if the isntructions in your hair genes say your hair is black, your hair will be black. Genes are packaged into threadlike structures called chromosomes. A chromosome is very much like a beaded bracelet. The beads are the different genes that give instructions for different part of the body; the entire bracelet is the chromosome. Genes usually come and act in pairs. One member of a specific pair comes from the father, and the other member comes from the mother. The members of a pair are located on paired chromosomes. All normal human beings have 23 pairs of chromosomes. Each of the first 22 pairs contain the same number and kind of genes. The last and 23rd pair is the sex chromosomes. They are different from the first 22 pairs in that they do not have the same number and kind of genes. The sex chromosomes contain the genes that determine whether a baby will be a girl or a boy. There are 2 kinds of sex chromosomes, X and Y. All baby girls have two X chromosomes. All baby boys have one X and one Y. The gene that gives instructions on how G6PD is made is found in the X chromosome only, thus G6PD deficiency is described as X-linked. If a baby girl gets one defective G6PD gene from either of her parents, she will not have G6PD deficiency because she has another G6PD gene that can do the work (remember: a baby girl has two X chromosomes, thus two G6PD genes). But if she gets two defective G6PD genes from both her parents, she will have G6PD deficiency. On the other hand, a baby boy whose G6PD gene is defective will surely get G6PD deficiency because the Y chromosome has no G6PD gene. A defective G6PD gene will give wrong instructions on how to make the enzyme G6PD. As a result, too little or none of it is made. What are the harmful effects of G6PD deficiency? G6PD has a very small but strategic role in protecting the body from substances that can cause damage to cells or oxidative substances. Because of this important role, G6PD is normally found in all parts of the body. To be sure, most parts of the body also keep a “spare” enzyme, one that can do the w ork of G6PD in case it is lacking or missing entirely.
第七章糖代谢 第一节概述 一、糖的生理功能 （一）氧化分解，供应能量 生命活动需要能量，糖是最主要的能源物质 （二）储存能量，维持血糖 糖在体内可以糖原的形式进行储存，这是机体储存能源的重要方式。当机体需要时，糖原分解，释放入血，可有效地维持正常血糖浓度，保证重要生命器官地能量供应。 （三）提供原料，合成其他物质 糖分解代谢的中间产物可为体内其他含碳化合物的合成提供原料。如糖在体内可转变为脂肪酸和甘油，进而合成脂肪；可转变为某些氨基酸以供机体合成蛋白质所需；可转变为葡萄糖醛酸，参与机体的生物转化反应等；因而糖是人体重要的碳源。 （四）参与构造组织细胞 糖是体内重要的结构组织 （五）其他功能 糖能参与构成体内一些具有生理功能的物质。 二、糖代谢概况 糖的合成代谢包括糖原合成、糖异生和结构多糖的合成；糖的分解代谢包括糖酵解、有氧氧化、磷酸戊糖途径及糖原分解等。 第二节糖的无氧氧化 （一）概念：在缺氧条件下，葡萄糖或糖原分解为乳酸的过程称无氧氧化，又称糖酵解。（二）反应过程 1.葡萄糖生成2分子磷酸丙糖 （1）葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖己糖激酶 （2）6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸果糖变构酶 （3）6-磷酸果糖生成1，6-二磷酸果糖磷酸果糖激酶 （4）磷酸丙糖的生成醛缩酶 2.磷酸丙糖氧化为丙酮酸 （1）3-磷酸甘油醛氧化 3-磷酸甘油醛脱氢酶 3-磷酸甘油酸的生成磷酸甘油酸激酶(3) 2-磷酸甘油酸的生成变位酶 (4) 磷酸烯醇式丙酮酸的生成烯醇化酶 (5) 丙酮酸的生成丙酮酸激酶
3. 丙酮酸还原为乳酸 乳酸脱氢酶 （三） 反应特点 1．没有氧参与。 2．1分子葡萄糖净生成2分子ATP ，从糖原开始，净生成3分子ATP 。 3．有三步不可逆反应，分别由己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶催化。 4．红细胞中存在2，3-二磷酸甘油酸支路 （四） 生理意义 1. 糖酵解是机体在缺氧情况下供应能量的重要方式。 2. 糖酵解是红细胞供能的主要方式。 3. 2，3-二磷酸甘油酸对调节红细胞的带氧功能有重要意义。 4. 某些组织在有氧条件下仍以糖酵解为主要供能方式。 （五） 糖酵解的调节 1. 激素的调节作用 胰岛素的诱导 2. 代谢物对限速酶的变构调节 1，6-二磷酸果糖、ATP 、AMP 等是磷酸果糖激酶的变构 激活剂。 第三节 糖的有氧氧化 （一） 概念：在有氧条件下，葡萄糖或糖原彻底氧化为CO 2和H 2O 的过程称糖的有氧氧化。 有氧氧化是糖氧化产能的主要方式。 （二） 反应过程： 1. 葡萄糖生成丙酮酸 葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸 2. 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A 丙酮酸进入线粒体在丙酮酸脱氢酶复合体催化下氧化脱羧，并与辅酶A 结合生成乙酰CoA 。此反应不可逆，总反应式为： 丙酮酸脱氢酶复合体+HSCoA + NAD +NADH+H +CO 2++C=O COOH CH 3C CH 3O ~SCoA 丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺转乙酰酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶三种酶组成的多酶复合体，有5种辅酶，即TPP 、硫辛酸、FAD 、NAD ＋ 和HSCoA ，分别含有B 1、硫辛酸、B 2、PP 、泛酸等维生素。当这些维生素缺乏将导致糖代谢障碍。 3. 乙酰辅酶A 彻底氧化分解（三羧酸循环） 三羧酸循环是指乙酰CoA 和草酰乙酸缩合生成柠檬酸，经过一系列脱氢、脱羧反应，再生成草酰乙酸的循环过程。
第四章糖代谢 一、A型选择题 01. 淀粉经α-淀粉酶作用后的主要产物是 A. 麦芽糖及异麦芽糖 B. 葡萄糖及麦芽糖 C. 葡萄糖 D. 麦芽糖及临界糊精 E. 异麦芽糖及临界糊精 02. 糖酵解时下列哪一对代谢物提供～P使ADP生成ATP A. 3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖 B. 1,3-二磷酸甘油酸及磷酸烯醇式丙酮酸 C. 3-磷酸甘油酸及6-磷酸葡萄糖 D. 1-磷酸葡萄糖及磷酸烯酸式丙酮酸 E. 1，6-双磷酸果糖及1,3-二磷酸甘油酸 03. 下列有关葡萄糖磷酸化的叙述中，错误的是 A. 已精激酶有四种同工酶 B. 己糖激酶催化葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖 C. 磷酸化反应受到激素的调节 D. 磷酸化后的葡萄糖能自由通过细胞膜 E. 葡萄糖激酶只存在于肝脏和胰腺p细胞 04. 下列哪个酶直接参与底物水平磷酸化 A. 3-磷酸甘油难脱氢酶 B. α-酮戊二酸脱氢酶 C. 琥珀酸脱氢酶 D. 磷酸甘油酸激酶 E. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 05. 1分子葡萄糖酵解时可生成几分了ATP？ A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5 06. 1分子葡萄糖酵解时可净生成几分子ATP？ A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5 07. 糖原的1个葡萄糖基经糖酵解可生成几个ATP A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5 08. 糖原的1个葡萄糖基经糖酵解可净生成几个ATP？ A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5 09. 肝脏内据酵解途径的主要功能是 A. 进行糖酵解 B. 进行糖有氧氧化供能 C. 提供磷酸戊精 D. 对抗糖异生
E. 为其他代谢提供合成原料 10. 糖酵解时丙酮酸不会堆积的原因是 A. 乳酸脱氢酶活性很强 B. 丙酮酸可氧化脱羧生成乙酰CoA C. NADH／NAD+比例太低 D. 乳酸脱氢酶对两酮酸的K m值很高 E. 丙酮酸作为3-磷酸甘油难脱氢反应中生成的NADH的氢接受者 11. 6-磷酸果糖激酶-l的最强别构激活剂是 A. AMP B. ADP C. 2,6-双磷酸果糖 D. A TP E. 1,6-双磷酸果糖 12. 与糖酵解途径无关的酶是 A. 己糖激酶 B. 烯醇化酶 C. 醛缩酶 D. 丙酮酸激酶 E. 磷酸烯酸式丙酮酸羧激酶 13. 下列有关糖有氧氧化的叙述中哪一项是错误的？ A. 糖有氢氧化的产物是CO2及H2O B. 糖有氧氧化可抑制糖酵解 C. 糖有氧氧化是细胞获取能量的主要方式 D. 三羧酸循环是在糖有氧氧化时三大营养素相互转变的途径 E. 1分子葡萄糖氧化成CO2及H2O 时可生成38分子ATP 14. 丙酮酸脱氢酶复合体中不包括 A. FAD B. NAD＋ C. 生物素 D. 辅酶A E. 硫辛酸 15. 不能使同酮酸脱氢酶复合体活性降低的是 A. 乙酰CoA B. A TP C. NADH D. AMP E. 依赖cAMP的蛋白激酶 16. 下列关于三羧酸循环的叙述中，正确的是 A. 循环一周可生成4分子NADH B. 循环一周可使2个ADP磷酸化成A TP C. 乙酰CoA可经草酸乙酸进行糖异生 D. 百二酸可抑制延胡索酸转变成苹果酸 E. 琥珀酸CoA是α酮戊二酸氧化脱羧的产物 17. 1分子乙酰COA经三羧酸循环氧化后的产物是 A. 草酰乙酸 B. 草酸乙酸和CO2 C. CO2＋H2O D. 草酰乙酸十CO2＋H2O E. 2CO2＋4分子还原当量
葡萄糖磷酸脱氢酶缺乏症
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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，又名G6PD缺乏症（英文：G lucose-6-P hosphate D ehydrogenase deficiency），俗称蚕豆症，是一种常见的先天遗传性疾病。患者由于遗传基因的先天缺陷，无法正常地分解葡萄糖。除此以外，部份药物和化学物如蚕豆、樟脑、臭丸、龙胆紫（紫药水）、都会令患者出现急性溶血反应，症状包括黄疸、精神不佳，严重时会出现呼吸急速、心脏衰竭，甚至会出现休克而有生命危险。 症状 由于先天性六磷酸葡萄糖去氢酵素缺乏症（以下简称为G6PD）是X染色体联锁遗传性疾病，而男性只得一条X-染色体，故此病症几乎只出现于男性身上，但带有此病因的女性亦有可能出现轻微的症状。 以下为G6PD发病时可能出现的症状： ?持续的黄疸 ?溶血反应，由以下项目引发： ?某类药物（见下） ?某类食物（如蚕豆、金银花） ?其他物品（如樟脑、龙胆紫（紫药水）） ?其他疾病（如受到严重病菌感染、糖尿病） ?严重症状可引致急性肾衰竭 诱发G6PD症状的药物有： ?伯氨喹（Primaquine） ?奎宁、汤力水（tonic water）等抗疟药物 ?磺胺类抗生素 ?砜类：如用以治疗麻疯病的氨苯砜 ?其他含硫磺的药品，如治疗糖尿病、控制血糖的药物血糖平（Glibenclamide） ?呋喃妥因：治疗尿道感染的抗生素 ?阿司匹林 当某些族裔的病人，出现黄疸、贫血，以及对某些诱因产生溶血反应时，又或是家族中有G6PD患者，都会被列为G6PD 的疑似个案，需要作进一步的测试。 G6PD的测试包括： ?全套血球计数（Complete blood count）及网状细胞（reticulocyte）计数；当症状出现时，G6PD患者的海因兹小体（Heinz bodies）会出现于在检验血液玻片的红血球内。 ?肝脏蛋白酶测试，以剔除其他黄疸症状的诱因 ?结合珠蛋白（Haptoglobin）于溶血反应中会减少
糖代谢作业 1、简述葡萄糖无氧分解的基本途径、关键酶的调节及其生理意义。 2、简述葡萄糖有氧氧化的三个阶段。 糖的有氧氧化分为三个阶段，第一阶段为葡萄酸至丙酮酸（糖酵解过程），反应在细胞液中进行；第二阶段是丙酮酸进入线粒体被氧化脱羧成乙酰辅酶A，反应在线粒体膜上进行；第三阶段是乙酰辅酶A进入三羧酸循环生成CO2和H2O 第一阶段：糖酵解 糖酵解第一阶段：葡萄糖的磷酸化 葡萄糖 3步 1,6,—二磷酸果糖 第二阶段：糖的裂解过程 1,6,—二磷酸果糖 2步两分子的磷酸丙糖 第三阶段：产能阶段 两分子的3—磷酸甘油醛 5步两分子丙酮酸 总反应式 G+2NAD+2ADP+2Pi 2丙酮酸+2NADH+2H +2ATP +2H2O 特点：1、整个过程无氧参加； 2、三个关键酶；（己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶） 3、从葡萄糖开始净生成2分子ATP， 4、一次脱氢，辅酶为NAD＋，生成NADH＋H＋。 第二阶段：丙酮酸的氧化脱羧—乙酰CoA的生成 总反应式： TPP，FAD， 硫辛酸，Mg2+ 丙酮酸脱氢酶系三种酶 E1-丙酮酸脱羧酶（也叫丙酮酸脱氢酶） E2-二氢硫辛酸乙酰基转移酶 E3-二氢硫辛酸脱氢酶。 六种辅助因子焦磷酸硫胺素（TPP)、硫辛酸、 COASH、FAD、NAD+、Mg2+ 第三阶段：三羧酸循环 总反应式： CH3COSCoA+3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O 2CO2+CoASH+3NADH+3H+ +FADH2+GTP 特点：1、需氧 2、不可逆：三个限速酶（柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶复合
体） 3、两次脱羧、四次脱氢（三次受体是NAD，一次是FAD）、一次底物水平磷酸化 4、共产生10molATP 三羧酸循环第一阶段：柠檬酸生成 1）缩合反应柠檬酸合酶 2）柠檬酸异构化为异柠檬酸顺乌头酸酶 第二阶段：氧化脱羧 3）异柠檬酸氧化生成α-酮戊二酸异柠檬酸脱氢酶，生成一分子还原型NADH 4）α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA α-酮戊二酸脱氢酶复合体，生成一分子还原型NADH 5）琥珀酰CoA生成琥珀酸琥珀酰CoA合成酶，生成一分子CoASH 第三阶段：草酰乙酸再生 6）琥珀酸脱氢生成延胡索酸琥珀酸脱氢酶，生成一分子FADH2 7）延胡索酸加水生成苹果酸延胡索酸酶， 8）草酰乙酸的再生苹果酸脱氢酶，生成一分子还原型NADH 3、简述三羧酸循环过程及其调节。 4、详细列表计算1分子葡萄糖经过有氧氧化净生成多少A TP? 其中底物水平磷酸化和氧化磷酸化各 生成多少？P243 5、简述磷酸戊糖途径的反应过程、调节及其生理意义。 6、简述糖原的合成与分解及其调节。 糖原合成：葡萄糖、半乳糖和果糖等在体内相应酶的作用下合成糖原的过程。 合成部位：组织定位：主要在肝脏、肌肉 细胞定位：胞液 途径： 1.葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖 ATP ADP 葡萄糖己糖激酶; 6-磷酸葡萄糖 葡萄糖激酶（肝） 2.6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖变位酶 1-磷酸葡萄糖 3.1- 磷酸葡萄糖转变成尿苷二磷酸葡萄糖 4. α-1,4-糖苷键式结合 糖原n + UDPG 糖原合酶糖原n+1 + UDP 5.糖原分枝的形成（分支酶）
大鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)酶联免疫分析试剂盒使用说明书使用目的： 本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)水平。用纯化的大鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)，再与HRP 标记的葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)抗体结合，形成抗体-抗 原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝 色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)呈 正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠葡 萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶 2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品（400U/L）0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份 5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张 6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进 行稀 释。 200U/L 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 100U/L 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液 50U/L 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液 25U/L 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液 12.5U/L 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl， 然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此 重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显
生物化学试题及答案（4） 第四章糖代谢 【测试题】 一、名词解释 1．糖酵解（glycolysis） 11．糖原累积症 2．糖的有氧氧化12．糖酵解途径 3．磷酸戊糖途径13．血糖(blood sugar) 4．糖异生（glyconoegenesis) 14．高血糖(hyperglycemin) 5．糖原的合成与分解15．低血糖(hypoglycemin) 6．三羧酸循环（krebs 循环） 16．肾糖阈 7．巴斯德效应(Pastuer 效应) 17．糖尿病 8．丙酮酸羧化支路18．低血糖休克 9．乳酸循环（coris 循环） 19．活性葡萄糖 10．三碳途径20．底物循环 二、填空题 21．葡萄糖在体内主要分解代谢途径有、和。 22．糖酵解反应的进行亚细胞定位是在，最终产物为。 23．糖酵解途径中仅有的脱氢反应是在酶催化下完成的，受氢体是。两个 底物水平磷酸化反应分别由酶和酶催化。 24．肝糖原酵解的关键酶分别是、和丙酮酸激酶。 25．6—磷酸果糖激酶—1 最强的变构激活剂是，是由6—磷酸果糖激酶—2 催化生成，该酶是一双功能酶同时具有和两种活性。 26．1 分子葡萄糖经糖酵解生成分子ATP，净生成分子ATP，其主要生理意义在于。 27．由于成熟红细胞没有，完全依赖供给能量。 28．丙酮酸脱氢酶复合体含有维生素、、、和。 29．三羧酸循环是由与缩合成柠檬酸开始，每循环一次有次脱氢、 - 次脱羧和次底物水平磷酸化，共生成分子ATP。 30．在三羧酸循环中催化氧化脱羧的酶分别是和。 31．糖有氧氧化反应的进行亚细胞定位是和。1 分子葡萄糖氧化成CO2 和H2O 净生 成或分子ATP。 32．6—磷酸果糖激酶—1 有两个ATP 结合位点，一是ATP 作为底物结合，另一是与ATP 亲和能 力较低，需较高浓度ATP 才能与之结合。 33．人体主要通过途径，为核酸的生物合成提供。
第七章糖代 第一节概述 一、糖的生理功能 （一）氧化分解，供应能量 生命活动需要能量，糖是最主要的能源物质 （二）储存能量，维持血糖 糖在体可以糖原的形式进行储存，这是机体储存能源的重要方式。当机体需要时，糖原分解，释放入血，可有效地维持正常血糖浓度，保证重要生命器官地能量供应。 （三）提供原料，合成其他物质 糖分解代的中间产物可为体其他含碳化合物的合成提供原料。如糖在体可转变为脂肪酸和甘油，进而合成脂肪；可转变为某些氨基酸以供机体合成蛋白质所需；可转变为葡萄糖醛酸，参与机体的生物转化反应等；因而糖是人体重要的碳源。 （四）参与构造组织细胞 糖是体重要的结构组织 （五）其他功能 糖能参与构成体一些具有生理功能的物质。 二、糖代概况 糖的合成代包括糖原合成、糖异生和结构多糖的合成；糖的分解代包括糖酵解、有氧氧化、磷酸戊糖途径及糖原分解等。 第二节糖的无氧氧化 （一）概念：在缺氧条件下，葡萄糖或糖原分解为乳酸的过程称无氧氧化，又称糖酵解。（二）反应过程 1.葡萄糖生成2分子磷酸丙糖 （1）葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖己糖激酶 （2）6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸果糖变构酶 （3）6-磷酸果糖生成1，6-二磷酸果糖磷酸果糖激酶 （4）磷酸丙糖的生成醛缩酶 2.磷酸丙糖氧化为丙酮酸 （1）3-磷酸甘油醛氧化 3-磷酸甘油醛脱氢酶 3-磷酸甘油酸的生成磷酸甘油酸激酶(3) 2-磷酸甘油酸的生成变位酶 (4) 磷酸烯醇式丙酮酸的生成烯醇化酶 (5) 丙酮酸的生成丙酮酸激酶
3. 丙酮酸还原为乳酸 乳酸脱氢酶 （三） 反应特点 1．没有氧参与。 2．1分子葡萄糖净生成2分子ATP ，从糖原开始，净生成3分子ATP 。 3．有三步不可逆反应，分别由己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶催化。 4．红细胞中存在2，3-二磷酸甘油酸支路 （四） 生理意义 1. 糖酵解是机体在缺氧情况下供应能量的重要方式。 2. 糖酵解是红细胞供能的主要方式。 3. 2，3-二磷酸甘油酸对调节红细胞的带氧功能有重要意义。 4. 某些组织在有氧条件下仍以糖酵解为主要供能方式。 （五） 糖酵解的调节 1. 激素的调节作用 胰岛素的诱导 2. 代物对限速酶的变构调节 1，6-二磷酸果糖、ATP 、AMP 等是磷酸果糖激酶的变构激 活剂。 第三节 糖的有氧氧化 （一） 概念：在有氧条件下，葡萄糖或糖原彻底氧化为CO 2和H 2O 的过程称糖的有氧氧化。 有氧氧化是糖氧化产能的主要方式。 （二） 反应过程： 1. 葡萄糖生成丙酮酸 葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸 2. 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A 丙酮酸进入线粒体在丙酮酸脱氢酶复合体催化下氧化脱羧，并与辅酶A 结合生成乙酰CoA 。此反应不可逆，总反应式为： 丙酮酸脱氢酶复合体+HSCoA + NAD +NADH+H +CO 2++C=O COOH CH 3C CH 3O ~SCoA 丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺转乙酰酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶三种酶组成的多酶复合体，有5种辅酶，即TPP 、硫辛酸、FAD 、NAD ＋ 和HSCoA ，分别含有B 1、硫辛酸、B 2、PP 、泛酸等维生素。当这些维生素缺乏将导致糖代障碍。 3. 乙酰辅酶A 彻底氧化分解（三羧酸循环） 三羧酸循环是指乙酰CoA 和草酰乙酸缩合生成柠檬酸，经过一系列脱氢、脱羧反应，再生成草酰乙酸的循环过程。