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地址: 上海市浦东新区张江高科紫薇路750弄10号202室；邮编: 201203 慢病毒使用操作手册
1 慢病毒使用操作
2 慢病毒安全使用规范
3 悬浮细胞感染方法概要
4 相关专业术语
5 细胞培养器皿的相关参数
使用说明
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1 慢病毒使用操作手册
1.1 慢病毒的储存与稀释:
1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）
注：
A． 病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度
B． 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系
细胞
1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用IBSbio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（InVivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）
1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验
1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项
A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细（HEK293T，Hela） 细胞作为平行实验的对照细胞。
B． 在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． IBSbio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
1.2.2.2 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验
实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
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第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验，
a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基
b 吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）
c 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液
d 混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育过夜
注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态
亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。
A． 第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。
B．第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以通过Real-timeRT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。
注意：
IBSbio提供的病毒载体上带有GFP 绿色荧光蛋白，用户可以在病毒感染96小时后用倒置荧光显微镜观察GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。如果慢病毒载体携带其他Marker Gen e如RFP\BFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况慢病毒表达时间较慢， 荧光表达所需时间较长，建议感染后96小时后观测荧光表达。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。
2．慢病毒使用安全使用规范
IBSbio提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，IBSbio建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。如有疑问，请与我们联系。
使用时请参照如下所示进行实验：
2.1．病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。
2.2．病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。
2.3．操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84 消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃去。
2.4．用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。
2.5．如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。
2.6．脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。 —————————————————————————————————————— 地址: 上海市浦东新区张江高科紫薇路750弄10号202室；邮编: 201203
3 悬浮细胞感染方法概要
1.1 根据细胞的量将细胞在1.5ml 管中离心收集然后用100-200ul 的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准
1.2 按照MOI 换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml 管放在37℃度培养箱中孵育30 分钟
1.3 将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里
1.4 加入足够量的新鲜培养液
1.5 12 小时后换液
1.6 96 小时后观察细胞阳性率
4 相关专业术语
常用术语：
MOI:病毒感染复数传统的MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI 是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本手册中提到的MOI 都是沿用这个概念。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu 表示病毒数量，因此其MOI 的含义与传统的概念相同。
MOI stands for "Multiplicity of Infection." It is the ratio of infectious virus particles to the numberof cells being infected. The recommended MOI is in the range of 0.1 (meaning that you inoculate1 virus particle for every 10 cells) to 0.01. The general theory behind MOI is to introduce one infectious virus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cell which leaves a percentage of cells uninfected. This occurrence can be reduced by using a higher MOI to ensure that every cell is infected.
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5 细胞培养器皿的相关参数
细胞培养器皿的相关参数
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慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.doczj.com/doc/9218359923.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.doczj.com/doc/9218359923.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
慢病毒使用操作指南? 一、慢病毒的储存与稀释: ?1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口） 注:Ａ．病毒可以存放于－80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过６个月,我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。??B.反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10％;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目的细胞用PＢＳ或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分 装后４℃保存(请尽量在三天内用完）,分装后使用。??二、慢病毒用于体外 (in vitro）实验:感染培养原代细胞和建系细胞 1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invａbｉo提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数（MOI 值）以及在体内（iｎｖiｖo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（ＭOI 值）(使用２4孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） ?２. 慢病毒感染目的细胞预实验 ①慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的(HEK2９3T,Hｅla) 细胞作为平行实验的对照细胞。? B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用）稀释;理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。?C．Invabio提供的病毒单位为TＵ/mｌ，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有１X1０8个具有生物活性的慢病毒颗粒。 ?②以24孔培养板为例,进行目的细胞和HEK29３T 细胞的感染预实验? 实验前按照不同的ＭOI设置不同的感染孔，并根据MOＩ和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用ＰBＳ溶液或者无血清培养基稀释病毒原液??第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3~５Ｘ10４个目的细胞,铺板时细胞的融合率为５0％左右，每孔培养基体积为10０μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 1、取出４℃保存的第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验:?? 病毒,使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可)；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢
第一天 病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。 加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。 注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。 第二天 准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。 移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。 注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。 培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。 轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。 注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。 注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。 注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。 第三天 移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。 孵育细胞过夜。 第四天 欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。 第五－六天及以后 用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
Generation o f L entivirus Reagents ?293T: ATCC ?Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001 ?FBS: Invitrogen cat# 16000-044 ?DMEM: Invitrogen cat# 11965-118 ?Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155 ?L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156 ?Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050 ?Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024 ?Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058 293T/fibroblast media (500 mls): DMEM (450 ml) 10% FBS (50 ml) Pen/strep (5ml) L-glutamine (5ml) NEAA (5 ml) Reagent setup Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors A. Production of Virus 1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection. 2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.doczj.com/doc/9218359923.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/9218359923.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.doczj.com/doc/9218359923.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/9218359923.html,/
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA
慢病毒使用操作手册 1.慢病毒使用操作 2.慢病毒安全使用规范 3.悬浮细胞感染方法概要 4.相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ) 5.细胞培养器皿的相关参数 地址: 上海市浦东新区张江高科园蔡伦路781号电话: 400 616 7117
地址: 上海市浦东新区张江高科园蔡伦路781号 电话: 400 616 7117 1 慢病毒使用操作手册 1.1 慢病毒的储存与稀释: 1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） 注：A ． 病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 B ． 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS 或无血清培养基 (含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存 (请尽量在三天内用完) 分装后使用。 1.2 慢病毒用于体外（In Vitro ）实验：感染培养原代细胞和建系细胞 1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio 提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo ）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） 1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验 1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A ． 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细（HEK293T ，Hela ） 细胞作为平行实验的对照细胞。 B ． 在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C ． Invabio 提供的病毒单位为TU/ml , 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 1.2.2.2 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验 实验前按照不同的MOI 设置不同的感染孔，并根据MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl ；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1载体基本信息： pLVX-DsRed-Monomer-N1载体质粒图谱和多克隆位点信息： 载体名称: pLVX-DsRed-Monomer-N1 质粒类型: 慢病毒表达载体；荧光报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8751 bp 5' 测序引物及序列: CMV-F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (Invitrogen) 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: DsRed-Monomer（C-端） 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin) 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系，293、CV-1、CHO等 备注: pLVX-DsRed-Monomer-N1载体表达C端DsRed-Monomer 融合蛋白； DsRed-Monomer是DsRed的单体突变体，与DsRed相比， 编码序列经过了人工优化，适用于在哺乳动物细胞中的 高水平表达； CMV启动子是过表达启动子。 稳定性: 稳表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 慢病毒
pLVX-DsRed-Monomer-N1载体简介： Description pLVX-DsRed-Monomer-N1 is an HIV-1-based, lentiviral expression vector that allows you to express your gene of interest fused to DsRed-Monomer, a monomeric mutant of the Discosoma sp. red fluorescent protein. Genes cloned into the multiple cloning site (MCS),located upstream of the DsRed-Monomer coding sequence, are expressed as N-terminal fusions of the DsRed-Monomer protein. Expression of the fusion protein is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE) located just upstream of the MCS. Lentiviral particles derived from the vector allow the expression of DsRed-Monomer fusion proteins in virtually any cell type, including primary cells. The unmodified vector expresses DsRed-Monomer, and may be used to produce marker virus to optimize infection protocols. pLVX-DsRed-Monomer-N1 contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and nhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-DsRed-Monomer-N1 also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and