华中科技大学
硕士学位论文
“Cocktail”探针药物法评价辣椒素对大鼠CYP450亚型的影响
姓名：舒舟
申请学位级别：硕士
专业：药剂学
指导教师：吕永宁
2011-05
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文
摘要
评价辣椒素在体内外对大鼠CYP450亚型CYP1A2、CYP2C11、CYP2E1和CYP3A4的诱导或抑制作用，为临床评估和正确处理辛辣食物与药物间相互作用提供依据。
本文采用“Cocktail”探针药物法，研究辣椒素对大鼠CYP450亚型CYP1A2、CYP2C11、CYP2E1和CYP3A4活性的影响，分为体外试验和体内试验两部分。体外试验中采用非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睾酮分别作为CYP1A2 、CYP2C11 、CYP2E1 和CYP3A4的探针药物，并建立同时测定肝微粒体中探针药物及其代谢产物含量的HPLC分析方法。以固相萃取法提取待测物。采用C18色谱柱和梯度洗脱进行色谱分离，八种待测物在各自线性范围内线性关系良好（r≥0.9992），低、中、高三种浓度的日内、日间精密度≤10.44 %，平均相对回收率均在86.15%~105.56% 之间，平均提取回收率均在79.86%~88.62% 之间。结果表明该方法快速、准确，可用于肝微粒中探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮及其代谢产物的含量测定。
体外孵育试验分为试验组和对照组，试验组采用大鼠肝微粒体孵育体系、探针药物和辣椒素（对照组仅加入缓冲液）共同孵育20 min，反应终止后用上述HPLC方法检测代谢产物的生成量以代表酶的活性，以对照组酶活性为100%，计算试验组四种亚型相对活性百分比。结果表明CYP450四种亚型的相对活性百分比随辣椒素浓度增加而逐渐降低。采用Graphpad prism 5.0计算辣椒素对各亚型的IC50值，评价辣椒素在体外对四种亚型的抑制作用。结果显示辣椒素对大鼠肝微粒体CYP1A2 、CYP2C11、CYP2E1和 CYP3A4的IC50值分别为36.21、17.19、51.64和18.86 μmol?L-1，表明辣椒素在体外可抑制大鼠肝微粒体CYP1A2 、CYP2C11和 CYP3A4的活性，对CYP2E1的抑制作用较弱。将辣椒素与大鼠肝微粒体分别预孵育0、5、10、15、20、30 min，以预孵育0 min时的酶活性为100%，计算不同预孵育时间下各亚型的相对活性百分比，考察辣椒素对CYP450是否为机理性抑制作用。结果发现辣椒素对CYP450未呈现预孵育时间依赖性的抑制作用。
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依据体外实验结果，体内试验中选择CYP1A2、CYP2C11和CYP3A4三种亚型，分别采用咖啡因、甲苯磺丁脲和氨苯砜作为探针药物，建立同时测定血浆中三种探针药物含量的HPLC方法。以液液萃取法提取待测物。采用C18色谱柱和梯度洗脱进行色谱分离，三种待测物在各自线性范围内线性关系良好（r≥0.9960），低、中、高三种浓度日内、日间精密度≤11.54%，平均相对回收率均在92.84%~108.93% 之间，平均提取回收率均在67.59%~84.79% 之间。结果表明该方法快速、准确，可用于血浆样品中探针药物咖啡因、甲苯磺丁脲和氨苯砜的含量测定。
体内试验采用SD雄性大鼠，分为试验组和对照组，试验组每日清晨按25 mg?kg-1的剂量灌胃给予辣椒素溶液；空白组每日清晨按2 mL?kg-1的剂量给予空白溶剂，均连续给药7天。给药期间对大鼠进行正常喂养。第7天晨灌胃后30 min，腹腔注射“Cocktail”探针药物，均按照10 mg?kg-1的剂量给药。于给药后0.17、0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24 h断尾采血，以上述HPLC法测定血药浓度。经DAS 2.1.1计算探针药物的药代动力学参数，通过对比试验组和对照组的药动学参数，评价辣椒素在体内对大鼠CYP1A2 、CYP2C11和 CYP3A4的影响。结果表明辣椒素可显著缩短咖啡因的T1/2，降低AUC0-t和AUC0-∞，显著增加其CL，对C max和T max无显著影响；可显著降低甲苯磺丁脲的AUC0-t和AUC0-∞，显著增加其CL，对T1/2、C max和T max无显著影响；可显著降低氨苯砜的AUC0-t和AUC0-∞，显著增加其CL，对T1/2、C max和T max无显著影响。
综合上述试验结果，辣椒素在体外对大鼠肝微粒CYP1A2 、CYP2C11和 CYP3A4具有一定的抑制作用，对CYP2E1的抑制作用很弱。辣椒素在体内对大鼠CYP1A2、CYP2C11和 CYP3A4均有显著的诱导作用。
关键词：辣椒素；CYP450；探针药物；HPLC；Cocktail
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ABSTRACT
To study the in vitro and in vivo influence of Capsaicin on cytochrome P450 isoforms, which could provide a comprehensive understanding of the Capsaicin-drug interaction and
a reference to the clinical practice.
A Cocktail approach was used for the study of the in vitro and in vivo influence of Capsaicin on cytochrome P450 isoforms CYP1A2, CYP2C11, CYP2E1 and CYP3A4. In vitro study, the concentrations of each probe drug and their metabolites was determined by HPLC-DAD method, using phenacetin, tolbutamide, chlorzoxazone, testosterone as four probe drugs. A C18 analytical column and gradient elution were used for the chromatographic separation. Analytes were extracted simultaneously by SPE from rat liver microsomes. Good linearity (r≥0.9992) was observed over the concentration ranges investigated. In terms of precision, the intra-day and inter-day variation at three different concentrations in all analytes were less than 10.44%. The average relative recoveries for the analytes varied from 86.15% to 105.56%. The overall extraction recoveries for the analytes varied from 79.86% to 88.62%. The method was fast and accurate to determine the concentrations of phenacetin, tolbutamide, chlorzoxazone, testosterone and their metabolites in liver microsomes.
The incubation in vitro was divided into capsaicin group and control group. Rat liver microsomes, probe drugs, Capsaicin (buffer solution in control group) and cofactors were cultured together for 20 min. When the reaction terminated, the concentrations of the metabolites were measured with HPLC to assess the enzyme activities. Then the relative activity of the four isoforms in the capsaicin group was calculated suppose the enzyme activity in control group was 100%. The result showed that the relative activity of the four isoforms decreased gradually when the concentrations of capsaicin increased. The IC50 value of capsaicin on each isoform was determined to assess the inhibiton of capsaicin on the four isoforms in vitro using Graphpad prism 5.0. The result showed that the activity of the rats liver microsomes enzyme CYP450 isoforms CYP1A2, CYP2C11, CYP2E1 and CYP3A4 was inhibited by capsaicin in vitro with the IC50 values of 36.21、17.19、51.64 and
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18.86 μmol?L-1 respectively. While the inhibition on CYP2E1 was weak. Capsaicin and hepatic microsomess were preincubated respectively for 0, 5, 10, 15, 20, 30 min, and then the relative activity of the four isoforms at different time was calculated suppose the enzyme activity at 0 min was 100%. Whether there was mechanism-based inhibition of capsaicin on CYP450 was evaluated through preincubation of capsaicin and liver microsomes enzyme. After 30 min preincubation of capsaicin, no time-dependent manner was observed.
According to the result of the in vitro study, caffeine, tolbutamide, dapsone was used as markers of CYP1A2, CYP2C11 and CYP3A4 and HPLC of simultaneous determination of three probe drugs in blood was established in vivo study. A C18 analytical column and gradient elution were used for the chromatographic separation. Analytes were extracted simultaneously using a liquid-liquid extraction from rat blood. Good linearity (r≥0.9960) was observed over the concentration ranges investigated. In terms of precision, the intra-day and inter-day variation at three different concentrations in all analytes were less than 11.54%. The average relative recoveries for the analytes varied from 92.84% to 108.93%. The overall extraction recoveries for the analytes varied from 67.59% to 84.79%. The method was fast and accurate to determine the concentrations of caffeine, tolbutamide, dapsone in blood samples.
In vivo study, the male rat was divided into capsaicin group and control group. The capsaicin group were pretreated with 25 mg?kg-1 capsaicin once a day for 7 days. The control group were given a vehicle solvent in a volume of 2 mL?kg-1, once a day for 7 days. And the “Cocktail” probe drug was intraperitoneal injected after intragastric administration on the morning of the 7th day. Blood samples were withdrawn through tail clip at 0.17、0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12 and 24 h after injection of the “Cocktail” probe drugs. The concentration of the blood samples were determined by HPLC-DAD and the main pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.1.1. The effects of capsaicin on CYP450 isoforms CYP1A2, CYP2C11, CYP3A4 were reflected by comparing the pharmacokinetic parameter of experimental and control groups. The result showed that T1/2 of caffeine was shortened significantly, AUC0-t and AUC0-∞ of caffeine were declined
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significantly, CL was significantly increased. While C max and T max had no significance differences. Compared with control group, AUC0-t and AUC0-∞ of tolbutamide were significantly declined, CL was increased significantly while T1/2, C max and T max had no significance differences. Whereas AUC0-t and AUC0-∞ of dapsone were declined significantly compared with control groups, CL was increased significantly while T1/2, C max and T max had no significance differences.
In conclusion, Capsaicin had inhibition on CYP1A2, CYP2C11 and CYP3A4 in rat liver microsomes in vitro and marginal effect on CYP2E1. While in vivo, capsaicin had obvious induction on CYP1A2, CYP2C11 and CYP3A4 in rats.
KEY WORDS: Capsaicin; CYP450; Probe drug; HPLC; Cocktail
独创性声明
本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。
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前言
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是参与多种外源性物质（如药物、食物、环境致癌物、化学毒物）和内源物（类固醇激素、维生素等）在体内代谢的重要酶系，主要分布在肝脏和小肠，在肾、心、肺和脑组织中也有少量分布[1]。CYP450酶是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，在人类肝脏中与药物代谢密切相关的主要有CYP1A2、CYP2A6、CYP2C、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4，分别占人肝CYP总量的13%、5-10%、20%、2%、7%和30%[2]。许多因素会引起CYP450酶活性的改变，从而造成人体内药物的代谢存在显著的个体差异，比如：遗传因素、环境因素、时间因素、激素水平、饮食因素等都可能影响CYP450活性。CYP450还具有遗传多态性、立体选择性等特性，且催化外源物的代谢具有范围广、专一性差、交叉重叠性、易受抑制或诱导等特点，因而一直是药物代谢研究中的一个热点，也是食物/药物-药物间相互作用的研究重点。
化合物对酶产生诱导作用能促使药物代谢加快，但并不一定导致药理活性下降和作用时间缩短。因为某些药物的代谢产物与原药的药理活性一致，另有一些药物的代谢产物活性甚至超过原药，包括以前药的形式被摄入的药物。这时，酶促作用反而会增加药物疗效。而化合物对酶的抑制作用则是造成食物/药物-药物间相互作用的重要因素，其临床意义远大于酶促反应。约占全部相互作用的70%[3]。当一个化合物对酶产生抑制作用，则由该酶代谢的药物在人体内血药浓度升高，若药物治疗窗很窄，就容易发生毒副作用。
食物中所含有的化学物质可能会影响CYP450活性，而导致药物治疗失败或者发生药物毒副反应。在国外，曾有过敏性鼻炎患者在服用特非那汀的期间同时饮用葡萄柚汁而引起特非那汀中毒死亡的报道[5]。特非那汀也因在CYP450水平上的药物相互作用而被淘汰。饮品葡萄柚汁中化学成分柚苷、呋喃香豆素类衍生物能选择性抑制肠道和肝脏中的CYP3A4，使得由CYP3A4代谢的药物在胃肠道的吸收增加、在肝内的代谢减慢，血药浓度大幅度增加而导致中毒[6-8]。富含于柑橘类水果中的成分橙皮苷与柚苷
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化学结构相似，对CYP3A4具有相似的抑制作用[9]。
辣椒是全世界范围被广泛消费的蔬菜和香料之一，其中主要的辛辣成分是辣椒素（Capsaicin，CAP），化学结构为反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺（C18 H27NO3），见下图。约占辣椒素类物质的75%，其它辣椒素类物质还包括二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素、高二氢辣椒素、辛酸香草胺、壬酸香草胺、癸酸香草胺、对甲基辣椒碱族、对甲基辣椒碱烯链族、对甲基辣椒碱饱和链烃族、对甲苯基辣椒碱族等[10]。辣椒素主要作为食品中的辣味剂，同时也作为药物使用，其药理生理学活性如下[10,11]：①心血管作用，抑制心肌钾、钠通道，改善心功能。扩张毛细血管、改善局部血液循环。②抗炎，临床上用于缓解并消除变异性鼻炎的炎症反应。③镇痛作用，辣椒素的镇痛作用与吗啡等同，但比吗啡更持久，其可作为一种作用较温和副作用较少的较理想的超长效止痛剂。在美国和加拿大，辣椒素是已批准的Zostrix辣椒辣素乳膏的活性成分，用于缓解神经痛和关节痛。④促进脂肪代谢，保护胃粘膜作用，防治肥胖和预防消化性溃疡。⑤中科院研究员研究发现[12]辣椒素能激动海马神经细胞膜上的辣椒素受体，逆转应激损伤的空间记忆提取，保护大脑海马结构和记忆功能，提示摄食辣椒可能对于生活应激事件导致的脑损伤具有保护作用。
已有极少数文献[13]报道辣椒素在体外对人肝微粒体中CYP3A4具有抑制作用，但是没有文献认为该影响具有临床意义。我们在临床试验中偶然发现受试者在服用由CYP3A4代谢的药物期间，食用多于平时用量的辣椒和辣椒油，导致食用前后药物的AUC显著改变。辣椒素对CYP450其它亚型活性影响的研究和报道并不多见。因此我们认为研究清楚辣椒素对CYP450活性的影响，对于预防食物-药物间相互作用具有非常重要的意义。本课题采用“Cocktail”探针药物法，从大鼠的体外试验和体内试验两个方面初步探索辣椒素对肝药酶是否存在诱导或抑制作用，以期为食物-药物间相互作用和辣椒素临床药理、毒理以及不良反应等研究提供参考。
辣椒素化学结构
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第一部分体外试验评价辣椒素对大鼠CYP450
不同亚型活性的影响
第一节大鼠肝微粒中四种探针药物及其代谢产物的测定方法
目前已有的文献[14-16]仅对非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮及其代谢产物
中的某个或某几个化合物建立了检测方法，同时提取并测定这八种化合物的分析方法
尚未见报道，本实验建立了同时测定大鼠肝微粒中四种探针药物及其代谢产物的高效
液相色谱分析方法，并对方法进行充分的确证。
1试验材料
1.1 药品与试剂
非那西丁：纯度≥98.0%，批号STBB2177M9，购自Sigma-Aldrich公司。
甲苯磺丁脲：纯度≥98.0%，批号078K0725，购自Sigma-Aldrich公司。
氯唑沙宗：纯度100.0%，批号100364-200301，购自中国药品生物制品检定所。
睾酮：纯度99.5%，批号80901，购自Dr. Ethrenstorfer公司。
对乙酰氨基酚：纯度100.0%，批号100018-200408，购自中国药品生物制品检定
所。
4’-OH甲苯磺丁脲：纯度100.0%，批号1-PSB-27-2，购自Toronto research chemicals
公司。
6-OH氯唑沙宗：纯度100.0%，批号2-QFY-164-6，购自Toronto research chemicals
公司。
6β-OH睾酮：纯度100.0%，批号65773，购自Cerilliant Corporation。
氢溴酸右美沙芬：纯度100.0%，批号100201-200502，购自中国药品生物制品检
定所。
大鼠肝微粒体（Rat Liver Microsomes, RLM）：蛋白浓度20 mg?mL-1，批号 BDVH，
购自瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司。
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葡萄糖-6-磷酸二钠（G-6-P）购自Sigma-Aldrich公司，氧化型辅酶Ⅱ（NADP）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-P DH）购自Roche Diagnostics公司，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化镁购自国药集团化学试剂有限公司。浓磷酸购自武汉市中天化工有限责任公司。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器和设备
液相色谱仪：岛津LC-20A高效液相色谱仪，含：LC-20A二元泵、DGU-20A3在线脱气机、SPD-M20A二极管阵列紫外检测器、SIL-20A自动进样器色谱工作站：LC solution
离心机：BR16型高速冷冻离心机（河北白洋离心机厂）
纯水制备仪：优普超纯水机
精密天平：岛津A VW2200型电子天平
分析天平： FA1004型电子天平（上海天平仪器厂）
低温冰箱：日本三洋MDF-382E 型超低温冰箱
涡旋仪：XW-80A 型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）
2 试验方法
2.1 溶液的配制
非那西丁标准溶液：精密称取非那西丁标准品13.32 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得13.32 mg?mL-1标准储备液。
甲苯磺丁脲标准溶液：精密称取甲苯磺丁脲标准品24.19 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得24.19 mg?mL-1标准储备液。
氯唑沙宗标准溶液：精密称取氯唑沙宗标准品13.64 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得13.64 mg?mL-1标准储备液。
睾酮标准溶液：精密称取睾酮标准品15.08 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得15.08 mg?mL-1标准储备液。
对乙酰氨基酚标准溶液：精密称取对乙酰氨基酚标准品8.86 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得0.886 mg?mL-1标准储备液。
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4’-OH甲苯磺丁脲标准溶液：精密称取4’-OH甲苯磺丁脲标准品8.96 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得0.3584 mg?mL-1标准储备液。
6-OH氯唑沙宗标准溶液：精密称取6-OH氯唑沙宗9.20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得0.920 mg?mL-1标准储备液。
6β-OH睾酮标准溶液：精密称取6β-OH睾酮18.27 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.827 mg?mL-1标准储备液。
探针药物混标溶液：分别精密吸取上述探针药物标准溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得含非那西丁929.03 μmol?L-1、甲苯磺丁脲1118.46 μmol?L-1、氯唑沙宗804.39 μmol?L-1、睾酮653.56 μmol?L-1的混标溶液。再用甲醇依次稀释配制成系列浓度标准溶液。
产物混标溶液：分别精密吸取上述产物标准溶液适量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得含对乙酰氨基酚498.21 μmol?L-1、4’-OH甲苯磺丁脲166.50 μmol?L-1、6-OH氯唑沙宗599.91 μmol?L-1、6β-OH睾酮300.08 μmol?L-1的混标溶液。再用甲醇依次稀释配制成系列浓度标准溶液。
氢溴酸右美沙芬（内标）标准溶液：精密称取氢溴酸右美沙芬标准品9.91 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得0.991 mg?mL-1内标储备液。再精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得0.0991 mg?mL-1内标标准溶液。
0.1 mol?L-1的磷酸盐缓冲液（PH7.4）：1 mol?L-1 K2HPO4 80.2 ml，1 mol?L-1 KH2PO4 19.8 mL，混合后用双蒸水稀释至1000 mL，用浓磷酸调节PH至7.4。
蛋白浓度10 mg?mL-1的RLM悬液（冰上）：精密吸取20 mg?mL-1的RLM 悬液2.5 ml，置于5 mL容量瓶中，用0.1 mol?L-1磷酸盐缓冲液稀释至刻度。于-80℃冰箱冷冻贮存。
2.2 肝微粒样品处理方法
精密吸取孵育液500 μL置于1.5 mL具塞离心管中，精密加入高纯水500 μL、内标溶液20 μL、浓磷酸20 μL，涡旋30 s混合。
将Oasis HLB 小柱 (30 mg，1 mL)置于固相萃取装置上，设定压力为负5 inHg。
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用1 mL 甲醇活化，1 mL 高纯水平衡，吸取上述样品使之通过小柱，用1 mL 5% 的甲醇-水溶液冲洗，再用1 mL 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，35℃空气吹干，然后用100 μL 25% 乙腈-水溶解，取20 μL 进行HPLC 分析。 2.3 色谱条件
分析柱： Hypersil ? ODS 2色谱柱（4.6 mm ×250 mm ，5 μm ；Thermo 公司） 预柱： C 18保护柱（10×4.6 mm
GL Sciences 公司） 流动相： 流动相 A--0.02% 磷酸，流动相 B--乙腈
梯度洗脱 0-11 min 25% B ； 11-28 min 40% B 流速： 1 mL ?min -1 进样量： 20 μL 柱温： 25 ℃
检测波长：非那西丁245 nm ，甲苯磺丁脲220 nm ，氯唑沙宗280 nm ，睾酮244 nm ，对乙酰氨基酚245 nm ，4’-OH 甲苯磺丁脲220 nm ，6-OH 氯唑沙宗296 nm ，6β-OH 睾酮240 nm 。 2.4 方法学确证 2.4.1 专属性考察
在选定的色谱条件下，各待测物与内标峰形良好，分离完全。空白肝微粒体、空白肝微粒体加探针药物、孵育后肝微粒体样品按“2.2”项下处理后，在“2.3”色谱条件下进样分析，色谱图见图1-1~图1-3。结果表明，肝微粒体孵育后的杂质峰对待测物和内标测定没有干扰。
mi n
-25
25
50
75
100
125
150
175
mAU
220nm,4nm (1.00)
图1-1空白肝微粒体色谱图
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-
图1-2肝微粒+标准品色谱图
2.4.2 标准工作曲线制备及定量下限的测定
精密吸取蛋白浓度为10 mg ?mL -1的RLM 悬液25 μL ，
缓冲液375 μL ，置于1.5 mL 具塞离心管中，依次加入底物系列混标溶液50 μL ，产物系列混标溶液50 μL ，配制成相当于非那西丁0.73，1.45，2.90，11.61，46.45，92.90 μmol ?L -1；甲苯磺丁脲0.87，1.75，3.50，13.98，55.92，111.85 μmol ?L -1；氯唑沙宗0.63，1.26，2.51，10.06，40.22，80.44 μmol ?L -1；睾酮0.51，1.02，2.04，8.17，32.68，65.36 μmol ?L -1；对乙酰氨基酚0.39，0.78，1.56，6.23，24.91，49.82 μmol ?L -1；4’-OH 甲苯磺丁脲0.13，0.26，0.52，2.08，8.33，16.65 μmol ?L -1；6-OH 氯唑沙宗0.47，0.94，1.87，7.50，30.00，59.99 μmol ?L -1；6β-OH 睾酮0.23，0.47，0.94，3.75，15.00，30.00 μmol ?L -1的肝微粒样品，按“肝微粒体样品处理方法”项下操作，自“精密加入高纯水500 μL ”起同法操作，以待测物峰面积As 和内标峰面积Ai 的比值?为纵坐标，肝微粒中各待测物浓度C 为横坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线。待测物的线性回归方程、相关系数以及各待测物
图1-3肝微粒+探针药物孵育后色谱图 内标
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的定量限见表1-1。待测物的定量下限考察RSD小于9.16%。结果表明，待测物在各自的线性范围内线性关系良好，满足检测要求。
表1-1 肝微粒中待测物的标准曲线、相关系数、线性范围及定量限
待测物标准曲线r
线性范围
（μmol?L-1）
LOD
（μmol?L-1）
非那西丁Y = 0.2014X + 0.1025 0.99930.73~ 92.90 0.73
甲苯磺丁脲Y = 0.1232 X + 0.1219 0.99930.87~ 111.85 0.87
氯唑沙宗Y = 0.0746 X + 0.0448 0.99970.63~ 80.44 0.63
睾酮Y = 0.2721 X + 0.0367 0.99920.51~ 62.36 0.51对乙酰氨基酚Y = 0.1762 X - 0.0524 0.99970.39~ 49.82 0.39
4’-OH甲苯磺丁脲Y = 0.1843 X - 0.0080 0.99980.13~ 16.65 0.13
6-OH氯唑沙宗Y = 0.1191 X - 0.0736 0.9995 0.47~ 59.99 0.47
6β-OH睾酮Y = 0.1871 X - 0.029 0.9998 0.23~ 30.00 0.23
2.4.3 方法的精密度及准确度（相对回收率）
按“标准工作曲线”测定方法配制成含非那西丁浓度为1.45，2.90，46.45 μmol?L-1、甲苯磺丁脲浓度为 1.75，3.50，55.92μmol?L-1、氯唑沙宗浓度为 1.26，2.51，40.22μmol?L-1、睾酮浓度为1.02，2.04，32.68 μmol?L-1、对乙酰氨基酚浓度为0.78，1.56，24.91μmol?L-1、4’-OH甲苯磺丁脲浓度为0.26，0.52，8.33μmol?L-1、6-OH氯唑沙宗浓度为0.94，1.87，30.00μmol?L-1、6β-OH睾酮浓度为0.47，0.94，15.00μmol?L-1的低、中、高3个浓度的质控样品，每个浓度制备6份，按“肝微粒体样品处理方法”项下操作，连续测定三天精密度样品，计算待测物峰面积As和内标峰面积Ai的比值?，代入标准曲线求得实测浓度，计算日内和日间精密度，结果见表1-2。结果表明，日内、日间精密度≤10.44%。精密度样品的实测浓度与加入浓度的比值即为相对回收率，待测物平均相对回收率在86.15%~105.56% 之间，满足检测要求。
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表1-2 待测物的日内、日间精密度及提取回收率（Mean±SD, n=6）
日内精密度
日间精密度
提取回收率
待测物
浓度 （μmol ?L -1）
实测浓度 （μmol ?L -1）
（%）
实测浓度 （μmol ?L -1）
（%）
提取回收率 （%）
（%）
1.45 1.25±0.01 1.16 1.34±0.09 7.15 8
2.02±2.26 2.76 2.90 2.62±0.05 2.03 2.65±0.14 5.47 87.64±2.90
3.31 非那 西丁
46.45
46.49±3.13 6.75 48.55±4.10 8.46 80.72±3.84 4.76 1.75 1.66±0.13 7.69 1.70±0.11 7.01 85.38±4.15 4.86 3.50 3.08±0.05 1.52 3.35±0.18 5.46 82.50±4.49 5.44 甲苯磺 丁脲
55.92
58.71±3.60 6.13 57.76±3.85 6.68 82.39±6.97 8.46 1.26 1.14±0.07 5.82 1.20±0.09 7.41 80.10±5.55 6.93 2.51 2.36±0.13 5.34 2.45±0.12 5.14 82.78±5.79 7.00 氯唑 沙宗
40.22
42.09±1.79 4.26 42.03±4.03 9.61 80.99±3.26 4.02 1.02 0.98±0.06 5.81 1.05±0.07 6.76 79.86±3.67 4.60 2.04
1.94±0.10 4.91
2.03±0.17 8.71 88.41±1.98 2.24
睾酮
32.68 32.88±1.24 3.76 33.30±3.47 10.44
80.71±4.02 4.98
0.78 0.78±0.02 2.57 1.05±0.07 6.76 85.11±6.61 8.25 1.56
1.53±0.06 3.94 1.54±0.11 7.71 85.02±3.64 4.28
对乙酰
氨基酚
24.91 24.73±0.30 1.20 24.51±2.50 10.20
88.01±7.07 8.03
0.26 0.27±0.02 6.26 0.26±0.02 9.17 80.19±6.36 7.93 0.52 0.53±0.03 5.43 0.52±0.03 6.23 84.92±6.19 7.29 4’-OH
甲苯磺丁脲 8.33 8.79±0.49 5.60 8.46±0.69 8.17 83.07±1.81 2.18 0.94 0.95±0.03 3.01 0.91±0.02 3.11 81.49±5.51 6.84 1.87 1.86±0.03 1.49 1.81±0.11 6.58 89.15±2.59 2.91 6-OH 氯唑沙宗
30.00
28.52±1.74 6.13 29.66±2.73 9.21 88.62±7.90 8.91 0.47 0.42±0.01 2.41 0.45±0.03 7.33 83.86±3.60 4.29 0.94 0.94±0.06 6.80 0.92±0.08 9.11 83.46±4.95 5.93 6β-OH 睾酮
15.00
14.44±0.95 6.60 14.90±1.17 7.85 84.36±4.65 5.51
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2.4.4 提取回收率
精密吸取蛋白浓度为10 mg?mL-1的RLM悬液25 μL，缓冲液375 μL，置于1.5 mL 具塞离心管中，加入甲醇溶液100 μL，涡旋30 s后，按“肝微粒体样品处理方法”项下，收集甲醇洗脱液，35℃空气吹干，然后用100 μL含非那西丁浓度为7.26，14.52，232.26 μmol?L-1、甲苯磺丁脲浓度为8.74，14.48，279.61μmol?L-1、氯唑沙宗浓度为6.28，12.57，201.10μmol?L-1、睾酮浓度为5.11，10.21，163.39μmol?L-1、对乙酰氨基酚浓度为3.89，7.78，124.55μmol?L-1、4’-OH甲苯磺丁脲浓度为1.30，2.60，41.63μmol?L-1、6-OH氯唑沙宗浓度为4.69，9.37，149.98 μmol?L-1、6β-OH睾酮浓度为2.34，4.69，75.00μmol?L-1、内标0.0198 mg?mL-1的标准溶液涡旋溶解后，取20 μL进行HPLC 分析。测定各浓度待测物和内标的峰面积As。
按“标准工作曲线”项下配制成低、中、高三种不同浓度的肝微粒样品各6份，按上述“肝微粒样品处理方法”同法操作，进行HPLC分析。测定各浓度待测物和内标的峰面积Ai，计算提取回收率。结果表明，该方法提取回收率满足检测要求。结果见表1-2。
2.4.5 样品冰浴中放置稳定性
按“标准工作曲线”项下配制成低、中、高三种不同浓度的肝微粒体样品各6份，于冰浴中放置1 h后，取500 μL按“肝微粒体样品处理方法”项下操作，进行HPLC 分析，结果见表1-3。
2.4.6 样品处理后室温放置稳定性
按“标准工作曲线”项下配制成低、中、高三种不同浓度的肝微粒体样品各6份，按“肝微粒体样品处理方法”项下操作，于进样器中放置9 h后再测定分析，结果见表1-3。
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表1-3 待测物稳定性考察结果（Mean±SD, n=6）
冰浴1 h 稳定性 处理后9 h 稳定性 待测物
浓度 （μmol ?L -1）
实测浓度 （μmol ?L -1）RSD （%） 实测浓度 （μmol ?L -1） RSD （%） 非那西丁
1.45 1.38 ± 0.04
6.64
1.28 ± 0.03
2.55
2.90 2.87±0.13 5.31 2.86±0.19 6.78 46.45 45.46±
3.32 9.40 47.79±
4.05 8.48 1.75
1.70±0.03 1.53 1.75±0.04
2.59
3.50 3.26±0.14
4.78 3.16±0.11 3.75 甲苯磺丁脲
55.92 55.31±3.64 7.90 55.08±5.25 9.53
氯唑沙宗
1.26 1.16±0.01
2.23 1.11±0.03
3.07 2.51 2.35±0.11 6.08 2.51±0.13 5.43 40.22 42.34±0.74 6.41 40.26±0.52 1.30 睾酮 1.02 0.96±0.09 6.07 0.95±0.02 2.28 2.04 1.90±0.02 2.98 2.00±0.05 2.72 32.68 32.33±0.57 1.54 31.93±0.3 1.21 0.78 0.77±0.04 7.53 0.77±0.01 1.96 1.56 1.51±0.11
4.11 1.57±0.12 7.90 对乙酰氨基酚
24.91
24.57±0.27 3.60 24.73±0.18 0.74 0.26 0.26±0.01 5.86 0.26±0.01 3.31 0.52 0.56±0.01 5.60 0.53±0.04 7.62 4’-OH 甲苯 磺丁脲
8.33
8.36±0.05 2.42 8.31±0.03 0.45 0.94 0.91±0.03 2.14 0.95±0.06 6.68 1.87 1.90±0.07 4.73 1.88±0.03 1.62 6-OH 氯唑沙宗
30.00
29.90±0.21 3.53 29.23±0.64 2.19 0.47 0.45±0.02 7.75 0.42±0.03 7.68 0.94 0.93±0.04 8.92 0.90±0.07 8.39 6β-OH 睾酮
15.00
15.20±0.74 9.94 14.84±0.88 5.99
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2.4.7 储备液稳定性
将“2.1”项下标准储备液与内标储备液在4℃下放置14天，于0、7、14天精密吸取10 μL标准储备液和50 μL内标溶液，然后用甲醇定容至1 mL，涡旋混匀，取20 μL进行分析，记录峰面积。待测物和内标的RSD% 均小于7.24%。
3 小结
采用SPE技术，同时提取肝微粒体样品中探针药物及其代谢产物，并建立HPLC-DAD方法同时检测大鼠肝微粒体中探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮及其代谢产物的含量，该法线性范围分别为：非那西丁0.73~92.90 μmol?L-1、甲苯磺丁脲0.87~111.85 μmol?L-1、氯唑沙宗0.63~80.44 μmol?L-1、睾酮0.51~65.36 μmol?L-1、对乙酰氨基酚0.39~49.82 μmol?L-1、4’-OH甲苯磺丁脲0.13~16.65 μmol?L-1、6-OH氯唑沙宗0.47~59.99 μmol?L-1、6β-OH睾酮0.23~30.00 μmol?L-1；最低定量浓度分别为：非那西丁0.73 μmol?L-1、甲苯磺丁脲0.87 μmol?L-1、氯唑沙宗0.63 μmol?L-1、睾酮0.51 μmol?L-1、对乙酰氨基酚0.39 μmol?L-1、4’-OH甲苯磺丁脲0.13 μmol?L-1、6-OH 氯唑沙宗0.47 μmol?L-1、6β-OH睾酮0.23 μmol?L-1；八种待测物低、中、高三种浓度的日内、日间精密度≤10.44 %；平均相对回收率均在86.15%~105.56% 之间；平均提取回收率为均在79.86%~88.62% 之间；稳定性考察，待测物和内标储备液4℃下放置14天稳定，未经处理的含有探针药物、代谢产物的肝微粒体样品在冰浴中放置1 h稳定，经预处理后的样品室温放置9 h内稳定。此分析方法简单、快速、准确，可用于肝微粒样品中探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睾酮及其代谢产物的含量测定。
4 讨论
4.1流动相选择
参照文献[14-16]中一种或几种待测物的色谱条件，确定梯度洗脱程序，使得八种被分析物达到完全分离，并控制分析时长为28 min。由于待测物的组分结构中有羟基活性基团和氢溴酸盐（内标），为保证较好的峰形，在流动相中加入适量的酸以减少拖
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尾现象。考察了不同的酸种类（醋酸、甲酸和磷酸）和酸浓度（0、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%），结果表明，0.02%的磷酸作为流动相水相时，各色谱峰峰形良好。
4.2 柱温的选择
分别考察了20、25和30℃柱温，结果发现柱温越低，各色谱峰的分离度越大，分析时长越长，综合考虑分离度、分析时长和环境温度，选择25℃柱温。
4.3样品前处理
参考文献[14-16]，分别考察了直接沉淀法、液液萃取法和固相萃取法对样品进行前处理，直接沉淀法和液液萃取法对四种探针药物的平均提取回收率分别为57.20% 和59.56%，对四种代谢产物的平均提取回收率为38.92%和41.58%。考察固相萃取（SPE）法时，考虑到底物和代谢产物之间极性差异较大，选择Waters OASIS@ HLB （hydrophilic-lipophilic balance）小柱，其填料是（可浸润）亲水-亲油平衡共聚物，对极性和非极性物质均有较强的保留能力。对八种待测物的平均提取回收率均大于82.76%。鉴于孵育体系中代谢物的生成量较少，选择对样品提取率最高的SPE法，以提高检测灵敏度。
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： (1)形成单键的c电子；(2)形成双键的n电子；(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： (c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c，冗是成键轨道，n是非键轨道， c* , n *是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含 有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的 横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A （吸光度）、T （透射比或透光率或透过率）、 1-T （吸收率）、?（吸收系数）中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。 250 A /nm 翠腔的紫外光谨图 四、紫外光 谱中常用的几个术语 1. 发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基团，不论是否显示颜色 都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（ C=C C=O N=N 、三键、苯环等） 200 300
分子荧光光谱法实验报告 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效
率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长，纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A 三、实验试剂和仪器试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙 醇。 仪器：Fluoromax-4荧光分光光度计；1cm比色皿；
第十二章荧光分析法（药学） 一、A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法（）。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案：A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。 A、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案：B 3荧光量子效率是指（）。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案：B 4.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱
C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：C 5.荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性 E、激发光的强度 答案：A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是（）。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案：A
8.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案：D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比，必须使（）。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案：C 10.在测定物质的荧光强度时，荧光标准溶液的作用是（）。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案：D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器
第十一章 荧光分析法 、选择题 1．荧光分析法是通过测定 ( ) 而达到对物质的定性或定量分析。 A 、激发光 D 、散射光 2．下面 ( )分析方法不属于分子发射光谱法。 3．荧光发射光谱含有 ( )个发射带。 A 、 1 B 、 2 C 、 3 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B 、 荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像 C 、 荧光光谱属于分子的受激发射光谱 D 、 荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应 B 、 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应 C 、 荧光光谱的形状与激发光波长无关 D 、 荧光波长大于激发光波长 6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激 发三重态， 再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级， 然后发出光辐射跃迁至基态的各个振 动能级，这种光辐射称为 ( )。 A 、分子荧光 B 、分子磷光 C 、瑞利散射光 D 、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是 ( )。 A 、振动弛豫只能在同一电子能级内进行 B 、振动弛豫属于无辐射跃迁 C 、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动 能级 D 、振动弛豫是产生 Stokes 位移的原因之一 8．荧光寿命指的是 ( )。 A 、 从激发光开始照射到发射荧光的时间 B 、 受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间 C 、 从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间 D 、 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间 9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是( ) A 、 具有长共轭的 n~ ；跃迁的物质具有较大的荧光效率 B 、 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大 C 、 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体 学习资料 D 、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同 10．采用下列 ( )措施可使物质的荧光效率提高。 学习资料 B 、磷光 C 、发射光 A 、紫外一可见分光光度法 C 、磷光分析法 B 、荧光分析法 D 、化学发光分析法 D 、不一定
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
荧光分光光度法 一、 实验目的 1、学习荧光分光光度法的基本原理； 2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法； 3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。 二、 实验原理 荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS ）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。荧光（fluorescence ）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见，荧光是一种光致发光。 任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum ）和发射光谱（emission spectrum ）或称荧光光谱（fluorescence spectrum ）。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。 荧光强度（F ）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即 该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。 三、 仪器与试剂 F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL ）；牛血清白蛋白（BSA ） 四、 实验内容 1、 开机准备：接通电源，启动电脑。打开光谱仪主机电源，预热15分钟。 2、 运行FL solution 软件，设定检测方法和测量参数： EX （激发波长）：280nm EM （发射波长）：340nm EX 扫描范围：210nm ～330nm EM 扫描范围：290nm ～450nm EX 缝宽：2.5nm ，EM 缝宽：2.5nm 扫描速度：240nm/min PMT 电压：700V 3、 激发光谱和发射光谱的绘制： 先固定激发波长为280nm ，在290～450nm 测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm 附近为最大发射波长λem ；再固定发射波长为λem ，测定激发波长为200nm ～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm 附近为最大激发波长λex 。 4、 退出FL solution 软件，关闭光谱仪主机电源，关闭计算机。 Kc F
实验四苯甲酸钠的含量测定 一、目的 掌握双相滴定法测定苯甲酸钠含量的原理和操作 二、操作 取本品1.5g，精密称定，置分液漏斗中，加水约25mL，乙醚50mL和甲基橙指示液2滴，用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，乙醚层用水5mL洗涤，洗涤液并入锥形瓶中，加乙醚20mL，继续用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，即得，每1mL的盐酸滴定液(0.5mol/L)相当于72.06mg的C7H5O2Na。 本品按干燥品计算，含C7H5O2Na不得少于99.0％ 三、说明 1.苯甲酸钠为有机酸的碱金属盐，显碱性，可用盐酸标准液滴定。 COO Na +H C l COOH +N aC l 在水溶液中滴定时，由于碱性较弱(Pk b=9.80)突跃不明显，故加入和水不相溶混的溶剂乙醚提除反应生成物苯甲酸，使反应定量完成，同时也避免了苯甲酸在瓶中析出影响终点的观察。 2.滴定时应充分振摇，使生成的苯甲酸转入乙醚层。 3.在振摇和分取水层时，应避免样品的损失，滴定前，使用乙醚检查分液漏斗是否严密。 四、思考题 1.乙醚为什么要分两次加入?第一次滴定至水层显持续橙红色时，是否已达终点?为什么? 2.分取水层后乙醚层用5mL水洗涤的目的是什么? 实验五阿司匹林片的分析 一、目的 1.掌握片剂分析的特点及赋形剂的干扰和排除方法。 2.掌握阿司匹林片鉴别、检查、含量测定的原理及方法。 二、操作 [鉴别] 1.取本品的细粉适量(约相当于阿司匹林0.1g)，加水10mL煮沸，放冷，加三氯化铁试液1滴，即显紫堇色。 2.取本品的细粉(约相当于阿司匹林0.5g)，加碳酸钠试液10mL，振摇后，放置5分钟，滤过，滤液煮沸2分钟，放冷，加过量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并发生醋酸的臭气。 [检查] 游离水杨酸 取本品的细粉适量(约相当于阿司匹林0.1g)，加无水氯仿3mL，不断搅拌2分钟，用无水氯仿湿润的滤纸滤过，滤渣用无水氯仿洗涤2次，每次1mL，合并滤液和洗液，在室温下通风挥发至干；残渣用无水乙醇4mL溶解后，移至100mL量瓶中，用少量5％乙醇洗涤容器、洗液并入量瓶中，加5％乙醇稀释至刻度，摇匀，分取50mL，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液[取盐酸液(1mol/L)1mL，加硫酸铁铵指示液2mL后，再加水适量使成100mL] 1mL，摇匀；30秒钟内如显色，和对照液(精密称取水杨酸0.1g，置1000mL量瓶中，加冰醋酸1mL，
RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异 一、实验目的 1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。 2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。 二、实验原理 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR 最常用的方法是DNA 结合染料SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA 结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。 三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪 实验材料：MCF7细胞 实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒 四、实验步骤 4.1 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus） 1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA； 2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直至裂
解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟； 3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈 乳白色，室温静置5min； 4)12,000 g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三 层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。 5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 6)向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀 后，室温下静置10分钟。 7)12,000g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。 8)弃上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹 管底，让沉淀浮起来，并静置3-5 min； 9)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量(可以根据沉淀 的多少确定）的RNase-free 水溶解沉淀。测浓度，记录A260/280。 4.2 1%琼脂糖凝胶电泳（取少部分进行跑电泳，留足够的量做反转录） 4.3 反转录 试剂体积（10μl） RNA500 ng Gene specific primers(2μM）RT primer1μl 5×ReverseTranscriptase M-MLV 2μl Buffer dNTP (10mM)0.5μl
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,就是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱就是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要就是三种电子: (1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致就是: (σ)＜(π)＜(n)＜(π*)＜( σ* ) σ,π就是成键轨道,n 就是非键轨道,σ* ,π* 就是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动与转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级与转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图就是由横坐标、纵坐标与吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语
1、发色基团与助色基团 发色基团:就是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论就是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱与的基团都就是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常就是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应与减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其她发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级与转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重
实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量五．数据处理 1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 苯丙氨酸的荧光光谱图 苯丙氨酸扫描激发波长在214nm和285m两处出现最高峰，本实验选择214nm为最大激发波长。此外，激发波长曲线在280－300nm处出现了一个十分完美的峰，此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证，如图，我们通过同步扫描荧光光谱技术获得的激发波长也在215nm，与之前基本吻合。 色氨酸的荧光光谱图
色氨酸扫描激发波长在217nm处有一个最大峰，所以激发波长为217，发射波长为361。发射波长曲线在450－460nm处出现了一个十分完美的峰（在这张图上没显示出来），此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证。 六．讨论与思考 1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？ 从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，根据我们得到的初步结果对仪器进行设置，然后对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。 2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？ 激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现以很强的峰，是倍频峰。不适合定量分析。 3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。 同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，提高对荧光性质相近化合物同时测定的选择性和灵敏度。同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱， 得到的峰比较窄，更明显。同步荧光光谱不是荧光物质的激发光谱和发射光谱
荧光分析法 思考题和习题 1．如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？ 荧光：是某些物质吸收一定的紫外光或可见光后，基态分子跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫回到第一激发态的最低振动能级，在发射光子后，分子跃迁回基态的各个不同振动能级。这时分子发射的光称为荧光。荧光的波长比原来照射的紫外光的波长更长。 磷光：是有些物质的激发分子通过振动弛豫下降到第一激发态的最低振动能层后，经过体系间跨越至激发三重态的高振动能层上，再通过振动弛豫降至三重态的最低振动能层，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能层．这种光辐射称为磷光。磷光的波长比荧光更长。 瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时．不发生能量的交换，仅是光子运动的方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长和入射光相同。 拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换，使光于能量发生改变。当光子将部分能量转给物质分子时，光子能量减少，波长比入射光更长；当光子从物质分子得到能量时，光子能量增加，波氏比入射光为短。这两种光均称为拉曼光。 为了消除瑞利光散射的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行，并通过调节荧光计的狭缝宽度来消除 为消除拉曼光的影响可选择适当的溶剂和选用合适的激发光波长 2．何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？ 荧光效率又称荧光量子效率，是物质发射荧光的量子数和所吸收的激发光量子数的比值称，用Ψf表示。 以下分子结构的物质有较高的荧光效率： (1)长共轭结构：如含有芳香环或杂环的物质。 (2)分子的刚性和共平面性：分子的刚性和共平面性越大，荧光效率就越大，并且荧光波长产生长移。 (3)取代基：能增加分子的π电子共轭程度的取代基，常使荧光效率提高，荧光长移，如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等。 3．哪些因素会影响荧光波长和强度？ (1)温度：物质的荧光随温度降低而增强。 (2)溶剂：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有增强。溶剂如能与溶质分子形成稳定氢键，荧光强度减弱。 (3)pH：荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH对该荧光物质的荧光强度有较大影响。 (4)荧光熄灭剂：荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 (5)散射光的干扰：包括瑞利光和拉曼光对荧光测定有干扰。 4．请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法） 配位滴定：利用铝与EDTA的配位反应进行滴定分析，因铝与EDTA的反应速率比较缓慢，而且铝对指示剂有封蔽作用，因此铝的测定一般用EDTA作为标准溶液，返滴定法或置换滴定法测定。 仪器分析法：利作铝离子与有机试剂如桑色素组成能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以来测定铝离子的含量。另可采用原子吸收分光光度法或原子发射光谱法进行测定。
分子荧光光谱法实验报告范文 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，
使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。 三、实验试剂和仪器
第十二章荧光分析法（药学） A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法（）。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案：A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。 A、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案：B 3荧光量子效率是指（）。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案：B 4.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：C 5.荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性
E、激发光的强度 答案：A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是（）。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案：A 8.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案：D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比，必须使（）。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案：C 10.在测定物质的荧光强度时，荧光标准溶液的作用是（）。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案：D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器 E、吸收池 答案：B 12.激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经过振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为（）。 A、分子荧光 B、分子磷光 C、瑞利散射光 D、拉曼散射光
分子荧光光谱实验报告 篇一：分子荧光光谱实验报告 分子荧光光谱实验报告 一、实验目的： 1.掌握荧光光度法的基本原理及激发光谱、发射光谱的测定方法；学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性分析。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.了解影响荧光产生的几个主要因素。二、实验内容：测定荧光黄/水体系的激发光谱和发射光谱； 首先根据已知的激发波长（如果未知，则用紫外分光光度计进行测量，以最大吸收波长为激发波长）测定发射光谱，得到最大发射波长；然后根据最大发射波长测定激发光谱，得到最大激发波长；然后在根据最大激发波长测定测定发射光谱； 根据所得数据，用origin软件做出光谱图。三、实验原理： 某些物质吸收光子后，外层电子从基态跃迁至激发态，然后经辐射跃迁的方式返回基态，发射出一定波长的光辐射，此即光致发光。光致发光现象分荧光、磷光两种，分别对应单重激发态、三重激发态的辐射跃迁过程。本实验为荧光光谱的测定。
激发光谱：在发射波长一定的条件下，被测物吸收的荧光强度随激发波长的变化图。 发射光谱：在激发波长一定的条件下，被测物发射的荧光强度随发射波长的变化图。 各种物质均有其特征的最大激发波长和最大发射波长，因此，根据最大激发波长和最大发射波长，可以对某种物质进行定性的测定。 四、荧光光谱仪的基本机构 五、实验结果与讨论： XX00 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 150000 100000 50000 0Wavelength (nm) 400000 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 300000 XX00 100000 Wavelength (nm)
1、分子处于受激态后，去活化过程有哪些方式？分子荧光是如何发生的？ 处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余的能量而返回至基态。 无辐射跃迁（不是以光辐射的形式放出）： 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。只能在同一电子能级内进行。 内部能量转换：简称内转换。是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。 外部能量转换：简称外转换。是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。 体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。 辐射跃迁： 分子荧光：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 2、哪些物质容易发生电子由单线激发态到三线激发态的体系间跨越？ 含有重原子如碘、溴等的分子时，体系间跨越最为常见，原因是在高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。另外，在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。 3、如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？ 荧光：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。荧光波长总比激发光波长长。 磷光：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。磷光的波长比荧光更长。因为分子在激发三重态的寿命较长，所以磷光发射比荧光更迟。 瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长与入射光波长相同。 拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种散射光是拉曼光。 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。（P224） 4、如何测定激发光谱与荧光光谱？ 固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度与激发波长的关系曲线，即激发光谱，其形体与吸收光谱极为相似。 使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即荧光光谱。 5、何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？ 荧光效率，又称荧光量子产率，是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。 共轭程度越大，分子的刚性越强，荧光效率越大。
核黄素测定实验报告 篇一：实验八荧光光光度法测定核黄素的含量 实验八荧光光度法测定核黄素的含量（见教材p118） 一. 实验目的 1. 了解荧光法测定核黄素的原理和方法； 2. 学习荧光光度计的操作和使用。 二. 实验原理 某些具有π-π电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为分子荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度IF与入射光的强度I0、荧光量子效率?F以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为IF=K?FI0εbc。式中为比例常数，与仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度IF与荧光物质的浓度c成正比。 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二
氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。 OHHO OHH3CHNOOHOHHOOHH3CH3C－2HH3CH二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下： 核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，由还原前后的荧光差数可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。 注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。 三. 仪器与试剂 1. 实验试剂：核黄素标准品；冰醋酸；核黄素药片；连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠 2. 实验仪器：荧光光度计（F-2500型）天平（感量0.0001g） 3. 实验器材 普通试管： 容量瓶：
材料分析与表征方法实验报告 热重分析实验报告 一、实验目的 1.了解热重分析法的基本原理和差热分析仪的基本构造。 2.掌握热重分析仪的使用方法。 二、实验原理 热重分析指温度在程序控制时，测量物质质量与温度之间的关系的技术。热重分析所用的仪器是热天平，它的基本原理是，样品重量变化所引起的天平位移量转化成电磁量，这个微小的电量经过放大器放大后，送入记录仪记录；而电量的大小正比于样品的重量变化量。当被测物质在加热过程中有升华、汽化、分解出气体或失去结晶水时，被测的物质质量就会发生变化。 三、实验原料 一水草酸钙CaC2O4·H2O 四、实验仪器 美国TA公司TGA55 升温与降温速率（K/min） 0.1-100℃/min 天平灵敏度（μg） 0.1μg 温度范围（°C）室温-1000℃ 五、操作条件 第一组：10℃／min空气条件下和20℃／min空气条件下，对TG和DTG曲线进行对比。 第二组：10℃／min空气条件下和10℃／min氮气条件下，对DSC进行对比。 第三组：10℃／min氮气条件下，得到TG、DTG、DSC曲线。 六、结果与讨论
含有一个结晶水的草酸钙(242CaC.OHO)在100℃以前没有失重现象,其热重 曲线呈水平状,为TG曲线的第一个平台。DTG曲线在0刻度。 在100℃和200℃之间失重并出现第二个平台。DTG曲线先升后降，在108.4℃达到最大值，即失重速率的最大值。DSC曲线先降后升，在188.4℃达到最小值，即热功率的最小值。这一步的失重量占试样总质量的12.47%，相当于每 mo CaC2O4·H2O失掉1mol H2O,其热分解反应为： CaC2O4·H2O CaC2O4 + H2O 在400℃和500℃之间失重并开始呈现第三个平台,DTG曲线先升后降，在510.4℃达到最大值，即失重速率的最大值。DSC曲线先降后升，在103.1℃达到最小值，即热功率的最小值。其失重量占试样总质量的18.76%,相当于每 mol CaC2O4分解出1mol CO,其热分解反应: CaC2O4 CaCO3 + CO 在600℃和800℃之间失重并开始呈现第四个平台,DTG曲线先升后降，在749.2℃达到最大值，即失重速率的最大值。DSC曲线先降后升，在758.9℃达到最小值，即热功率的最小值。其失重量占试样总质量的29.38%,相当每 mol CaC2O4分解出1mol CO2,其热分解反应: CaCO3 CaO + CO2 六、结论
第十一章荧光分析法 一、选择题 1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。 A、激发光 B、磷光 C、发射光 D、散射光 2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。 A、紫外一可见分光光度法 B、荧光分析法 C、磷光分析法 D、化学发光分析法 3．荧光发射光谱含有( )个发射带。 A、1 B、2 C、3 D、不一定 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（） A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像 C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱 D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是（） A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应 B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应 C、荧光光谱的形状与激发光波长无关 D、荧光波长大于激发光波长 6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。 A、分子荧光 B、分子磷光 C、瑞利散射光 D、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。 A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行 B、振动弛豫属于无辐射跃迁 C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级 D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一 8．荧光寿命指的是( )。 A、从激发光开始照射到发射荧光的时间 B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间 C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间 D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（） A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率 B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大 C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体