T RFLP技术及其在微生物群落结构研究中的应用
罗佳捷1,2,李丽立1,张彬2
(1.中国科学院亚热带农业生态研究所,长沙 410125; 2.湖南农业大学经济动物研究所,长沙 410128)
摘要:作者介绍了末端限制性片段长度多态性(T R FL P)分析技术的基本原理和操作方法,并就该方法在生态环境中、动物和人体内微生物群落结构的研究应用情况做了综述。由于T RF LP分析技术不依赖于细菌培养,并且整合了自动测序仪的高分辨率和高通量特征,因此,对于分析复杂的群落结构比其它的指纹识别技术具有更明显的优势,最后分析了此种技术的不足之处并对它的应用前景做出了展望。
关键词:末端限制性片段长度多态性;微生物群落结构;指纹识别;自动测序
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2009)07 0075 04
近年来,不依赖于培养的基因指纹图谱(GFP)技术对微生物群落结构和动态分析成为分子微生物生态学中的热点内容,其中变性/温度梯度凝胶电泳(D/T GGE)、单链构象多态性(SSCP)和末端限制性片段长度多态性(T RFLP)应用最为广泛。其中, T RFLP是对RFLP技术的延伸,Liu等(1997)首先将T RFLP技术用于微生物群落分析中,与其它指纹图谱技术相比具有以下的优点: 高通量,能够迅速产生大量重复、精确的数据,用于微生物群落结构的时空演替研究; 数据的输出形式允许对大量信息的快速分析,由于片段分析软件已经预装于DNA测序仪中,这些软件能够自动将电泳结果数字化并以表格方式输出,用于标准统计分析,避免了将指纹图谱再数字化的程序; 根据末端限制性片段(TRFs)的长度与现有数据库进行对比,有可能直接
收稿日期:2008 12 30
作者简介:罗佳捷(1984-),男,湖南人,硕士生,研究方向:动物营养生理。
通信作者:李丽立(1955-),女,研究员,硕士生导师,动物营养生态。E mail:lili@https://www.doczj.com/doc/9518173912.html,
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571351);湖南省自然科学基金(08JJ3080);长沙市科技攻关项目(K
0802117 21)。鉴定群落图谱中的专个菌种; 由于产生T RFs的设备为DNA测序仪,所以精确度和分辨率都要较其它方法产生的图谱高(余素林等,2006)。随着自动测序仪在实验室中的不断普及,使用T RFLP技术可以大幅度提高在群落分析方面的水平。
1 T RFLP分析技术的基本原理和方法
T RFLP技术以分子系统学的原理为基础,综合运用了PCR技术、DNA限制性酶切技术、荧光标记技术和DNA序列自动分析技术,在DNA水平上通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析比较微生物群落结构和功能。利用T RFLP技术分析微生物群落时,首先根据微生物群落的特点及分析目的确定目标DNA片段,根据目标基因序列上的保守区域设计一对合适的引物,其中一个引物的5 端用荧光物质标记,常用的荧光物质有T ET、H EX、6 FAM等。接着采集样品,提取样品中微生物群落的总DNA,以总DNA为模板进行PCR反应,扩增得到的各种微生物目标DNA片段的一端就带有荧光标记。然后,将PCR产物用合适的四碱基限制性内切酶消化,Collins等(2007)报道,一种新的工具 restriction endonuclease picker(REPK)可以用来帮助试验者根据不同的测试对象来合理的
then the objectiv e gene was recov ered and pur ified.T he g ene w as introduced into male pronucleus o f BA L B/c mo use fert ilized ovum by micr oinjection,then w e g ot32mice w hich hav e been injected the Dpl1 155g ene,in w hich6w as positive by PCR; one F0g ener atio n o f T g mouse ex pressing Dpl w ithout G PI w as mated w ith a wild type mo use,then21F1generation mouse wer e g ot,in w hich10w ere po sitive by PCR identificat ion.Br ain tissue o f thr ee F1g ener atio n mice w hich w ere posit ive by P CR identif ication w as co llected,and was ident ified by Western blotting,there w as17ku Dpl1 155pro tein ex pressed in the brain. So w e hav e g ener ated T g mice ex pressing Dpl w ithout GPI w hich pr ovides T g animal models for inv estigating the bio no mics o f Dpl prot ein.
Key words:glycosy l pho sphatidy l inosit ol;Doppel;transgene;mouse
选择限制性内切酶。由于在不同菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异,酶切位点也会存在差异,酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。消化产物用DNA自动测序仪(选用genescan功能)进行检测获得峰值图,末端带荧光标记的片段(term inal re striction fragment,T RF)或者称作操纵分类单元(oper ational taxo nom ic unit,OTU)被检测到,而其它没带荧光标记的片段则检测不到。因为一种菌的T RF长度是惟一的,所以峰值图上的每一个峰至少代表了一种菌。以下是T RFLP技术的全过程。
群落总DNA PCR扩增
引物 PCR产物酶切
限制性内切酶
不同长度的限制性片段测序仪上电泳分离
标记片段识别
微生物群落峰值图
峰值图上峰所对应的横坐标代表了T RF的片段长度,是根据该T RF与标准样品中长度已知的DNA片段在电泳中的位置进行比较后计算得到的;峰的纵坐标代表含有荧光物质T RF的荧光强度;峰的面积则代表了具有相同片段长度所有T RF的荧光强度的总和,即它所代表的这种菌种的相对数量。单纯使用T RFLP技术可以提供微生物的种类和相对数量的信息,但无法确定是何种微生物。只要结合克隆文库分析或是核酸杂交分析,就能确定微生物的种类。
2 T RFLP分析技术的应用
目前绝大多数关于T RFLP的资料都是用它来进行微生物群落结构及功能的分析及不同群落结构的比较。其中尤其以调查生态环境中及动物和人体内细菌群落的构成及其影响为主。
2.1 对生态环境中微生物群落结构及功能的研究 Cecile等(2006)运用T RFLP技术分析以调查法国孔雀湖生态系统中的小真核生物群落结构,结果发现在湖中5m深的地方,含氮物质和总磷的浓度对小真核生物的结构有很大影响,而在更深的地方则是细菌和溶解氧的天下;H eath等(2008)花了2年时间对来自墨西哥东北部水利条件不同的2个海湾的100份海底沉积物样品进行了T RFLP分析,得出的结果大大增进了人们对于占据了海洋中浅海床大部分的沙质和渗透性的沉积物中的微生物群落结构的了解;Per ez等(2005)对来自全球4个大陆上16个位点的沉积物样品中的异化硫酸盐还原酶基因进行了T RFLP分析,以研究硫酸盐还原细菌在受污染的沉积物中的多样性、分布模式及范围,结果显示硫酸盐还原细菌不是像大多数真核的生物体那样按照生物地理的分布模式而存在,它们在印度的沿太平洋海岸地带具有最复杂的生物多样性;Pas cal等(2005)通过对16S rDNA进行T RFLP分析来测定在活性污泥中土壤保持时间对细菌多样性的影响,试验结果表明,T RFLP分析法是用来分析活性污泥系统中由于操作参数的改变而引起的细菌群落结构多样性变化的一种强有力的工具。
另外,Santosh等(2006)运用T RFLP技术对在稻田中和森林土壤中使用含氮肥料对于产甲烷细菌的不同影响做了分析;在探测耕种土壤中安息香酸代谢菌群及它们的生长的试验中也可以运用到T RFLP分析技术(Gr aham等,2008)。目前,T RFLP技术已经越来越多的运用到了生态环境中微生物群落结构和功能的研究中,这对于人们更多更深入的了解生态环境,更加有效的保护和利用它们起到了巨大的作用。
2.2 对动物体内微生物群落结构及功能的研究 Ole等(2005)曾在评定日粮中氧化锌和硫酸铜对刚断奶仔猪的胃肠道生态系统的影响的试验中运用了T RFLP分析,试验结果表明,日粮中高剂量的氧化锌可以减少可消化的营养物质的发酵,从而为动物机体提供更多的能量,促进动物的生长,而硫酸铜的作用则比氧化锌要有限得多;Fairchild等(2005)则运用T RFLP分析来测定口服四环素对鸡肠道微生物群落结构的影响,结果提示在生产环境中动物体内基因转移的抵抗性所产生的混乱的生态及遗传因素导致了抗生素抗药性的流行;Knut等(2004)对食品架上真空包装的大马哈鱼和黑鳕中的微生物群落结构的测定中运用了T RFLP分析,结果鉴定出20种不同的菌种,并且发现在不同的鱼样品中细菌种类的分布有着惊人的差异;Valeria等(2008)运用T RFLP技术分析了48只用大麦或添加了外源酶的饲料喂养的鸡肠道各段的微生物群落结构,发现除了十二指肠和空肠,其它肠段之间的微生物群落有很大的不同,并且在回肠和盲肠之间发现了很显著的由日粮差别引起的微生物群落结构差异。此外,Tan等(2007)运用T RFLP技术分析发现慢性的螺杆菌属幽门感染不会显著的影响鼠科动物胃部的微生物群落结构;Julie等(2006)曾用T RFLP技术分析野生大猩猩粪便中的微生物多样性。现在,
T RFLP技术越来越多的运用到动物(特别是经济动物)体内尤其是胃肠道内的微生物群落结构分析,这对于人们了解动物胃肠道微生物环境,合理饲喂动物,取得更好的经济效益很有帮助。
2.3 对人体内微生物群落结构及功能的研究 Marco等(2005)运用T RFLP分析对女性阴道内的微生物群落结构做出了快速的测定,试验结果表明,T RFLP分析技术在对阴道内的微生物群落进行比较及获得占数量优势的细菌种类的相关信息方面可以起到很重要的作用;Ro gers等(2004)通过对16S r DNA进行T RFLP分析来测定囊肿性纤维化肺传染病情况下的细菌群落结构多样性。在对34个成年病人的71个痰样品进行分析后,得出的结果显示,在囊肿性纤维化的肺部存在的细菌种类有着巨大的复杂性,尽管它们存在的意义还没有被详尽的阐明,但却改变了人们对囊肿性纤维化肺传染病的认识;Jeffrey等(2003)通过对培养的血液样品进行T RFLP分析,得出的结论是通过这种方法可以快速的确认应该使用哪种合适的抗生素,从而减少了经常使用广谱抗生素的必要性;H idenori等(2005)对3个尸检个体的各个肠段微生物群落结构进行了T RFLP分析,结果显示不同个体不同肠段的微生物群落结构有明显的差异。另外,Lay er等(2006)通过将几种方法进行比较,结果发现T RFLP分析在临床上对葡萄球菌的鉴定方面具有较高的准确性;使用T RFLP技术分析人类的粪便,进而也可以了解到人类肠道微生物群落结构(Ko ji 等,2003)。随着T RFLP分析技术在人类身上利用的增加,人们会对自身特别是胃肠道内微生物群落结构有更深入的了解,这对很好的利用有益微生物,抑制有害种类及合理的预防和治疗相关疾病大有裨益。
3 T RFLP分析技术的缺陷及应用前景
T RFLP技术作为一种新兴的指纹识别技术,在研究微生物群落结构方面有极其明显的优势,但同时又存在着一些不足之处。首先,T RFLP技术依赖于PCR扩增,这就无法避免差异性扩增的影响。此外,当近缘种微生物在扩增片段靠近荧光标记端的切点一样时,该技术无法区分出这些近缘种,所以在T RFLP的峰值图上,一个峰代表的有可能不只是一个种,也就是说无法完全鉴定至种甚至是属的水平。而且峰值图上每个峰定量的结果也只是一个相对的含量,不可能真正代表该微生物在某一生态系统中的绝对含量。
样品中的总DNA的提取和限制性内切酶的选择是影响到分析结果的关键因素。对于后者,可以分别用几种限制酶进行分析,综合几种酶切的结果并对多个图谱进行综合分析,这样可以提高检出效率。这种做法要求几种酶在各自的反应体系中分别进行酶切,而不是进行在同一个反应体系的双酶切,原因是双酶切并不一定比单酶切产生更多的T RF,甚至可能比单酶切产生的T RF片段要少。待测片段的长度也会影响结果,这是因为随着片段长度的增加,测序仪检测分辨率降低,测序仪检测500bp 以上精度不够,可以通过毛细管电泳技术来提高1000bp以下的分辨率(余素林等,2006)。T RFLP 技术尽管还存在着一些缺陷,但不可否认的是T RFLP技术目前仍然是最好的分析微生物群落结构的工具之一。随着核酸测序技术的不断发展、数据库中核酸序列的不断丰富,用分子手段进行微生物群落结构分析以成为传统方法不可缺少的补充,而且必将得到更加广泛的应用。另外,随着T RFLP 技术自身参数的不断优化,它必然会在微生物群落结构调查,微生物与环境、宿主之间的关系方面发挥更大的作用。
参考文献
1 Cecile L,Delp hine B,Ludw ig J,et al.S uccession and regulation
factors of s mall eukaryote commu nity com position in a lacustrine ecosystem(lake pavin).Applied and Environm ental M icrobiolo gy,2006,72(4):2971~2981.
2 Collin s R E,Rocap G.REPK:An analytical w eb s erver to select
restriction endonu cleas es for term inal r estriction fragm ent len gth polymorph isms analysis.Nucleic Acids Res earch,2007,35:58~
62.
3 Fairchild A S,Smith J L,Idris U,et al.Effects of orally adminis
tered tetracycline on the intestinal com munity structure of chick en s and on tet determinant carriage by commen sal bacteria an d campylobacter jeju ni.Applied and En vir onm ental M icrob iology, 2005,71(10):5865~5872.
4 Graham M P,Eugene L M.Field based stable isotope pr ob ing re
veals the id entities of b enz oic acid metaboliz ing m icroorganisms and their in s itu grow th in agricultu ral soil.Applied and Envir on men tal M lcrobiolocy,2008,74(13):4111~4118.
5 H eath J M,Evan H,M ik e H,et al.Ch aracterization of nitrif
ying,denitrifying,and overall bacterial communities in permea ble m arin e sediments of the northeastern gulf of m exico.Applied
and Environmental M icrobiology,2008,74(14):4440~4453.
6 H idenori H,Rei T,T ak ahiro N,et al.M olecular an aly sis of jeju
nal,ileal,caecal and rectosigm oidal hum an colonic microbiota u s ing16S rRNA gene libraries and terminal restriction fragm ent length polymorp hism.J ournal of M edical M icr ob iology,2005, 54:1093~1101.
7 Jeffrey E C,Jenn ifer A S,Ku rt D R.Rapid identification of bac
teria from positive blood cultur es by term inal res triction fragm ent length polymorphism profile analysis of th e16S rRNA Gen e.
Journal of Clinical M icrob iology,2003,41(8):3790~3800.
8 Julie C F,Jessica M R,Alicc M P,et al.Fecal bacterial diversity
in a w ild gorilla.Applied and E nvironmen tal M icrobiology,2006, 72(5):3788~3792.
9 Kent A D,S mith D J,Ben son B J,et al.W eb based ph ilogen etic
ass ignment tool for analysis of terminal restriction fragm ent length polym orphism s profiles of microbial com munities.Appl
E nviron M icrobiol,2003,69(11):6768~6776.
10Knu t R,Tove M,S igrun E H,et al.Explorative multivariate a nalysis of16S rRNA gene data from m icrobial communities in m odified atmosphere packed s alm on and coalfish.Applied and
E nvironmen tal M icrob iology,2004,70(8):5010~5018.
11Koji N,T akayos hi H,M aremi S,et al.Application of new prim er enzym e combin ations to term inal restriction fragment length p olymorphism profiling of bacter ial populations in human feces.
Ap plied and Environmental M icrob iology,2003,69(2):1251~ 1262.
12Layer F,Ghebrem edhin B,M oder K A,et https://www.doczj.com/doc/9518173912.html,parative study u sing various methods for identification of S tap hyloc occ us sp e cies in clinical specimens.Applied an d Environm ental M icrobiol ogy,2006,44(8):2824~2830.
13Liu W T,M arsh T L,Chen H,et al.Ch aracter ization of microbi al diversity b y determining terminal restriction fragment length p olymorphism s of g enes encoding16S rRNA.Appl Environ M i crob iol,1997,63(11):4516~4522.
14M ars h T L.T erminal res triction fragment len gth polymor ph ism:an emerging meth od for characterizin g diversity among
h omologous populations of amplicons.Cur r Opin M icrobiol,
1999,2(3):323~327.
15M arco J L,Catherine C D,Larry J F,et al.Characteriz ation of microb ial comm unities found in the human vagina by analysis of term inal res triction fragment length polymorphism s of16S rRNA genes.Applied and Environm ental M icrobiology,2005,71
(12):8729~8737.
16Ole H,Nuria C,Hanne D P,et al.Influen ce of dietary zin c oxide an d copper sulfate on the gastrointestinal ecosystem in newly w eaned piglets.Applied and Environmental M icrobiology,2005, 71(5):2267~2277.
17Pas cal E S,Peter G S,Daniel B https://www.doczj.com/doc/9518173912.html, e of16S rRNA g ene termi nal restriction fragment analy sis to assess th e im pact of solid s re tention time on the bacterial diversity of activated slu dge.Ap plied and E nvironmental M icrob iology,2005,71(10):5814~ 5822.
18Perez J R,K erkh of L J.Phylog eography of sulfate redu cing b ac teria among disturbed sediments,disclos ed by analysis of the diss imilatory sulfite reductase genes(dsrAB).Applied and En vironmen tal M icrob iology,2005,71(2):1004~1011.
19Rogers G B,Carroll M P,S erisier D J,et al.C har acterization of bacterial comm unity diversity in cystic fib rosis lung infections b y use of16S rib os om al DNA terminal restriction fragmen t len gth polymorph ism profiling.Journal of Clin ical M icrobiology,2004, 42(11):5176~5183.
20Santosh R M,Pau l L E,Viogilio F,et al.Differential effects of nitrogen ou s fertilizers on m ethane cons uming m icrobes in rice field an d fores t soils.Ap plied an d En viron mental M icrob iology, 2006,72(2):1346~1354.
21T an M P,M aria K,M aja G,et al.Chr on ic helicobacter pylori in fection does not significantly alter the microbiota of the m urine stomach.Applied and En vir on mental M icr obiology,2007,73
(3):1010~1013.
22Valeria A T,Kathy O K,M aylene L,et al.Application of meth ods for identifying broiler ch icken gut bacterial s pecies linked w ith increased energy m etabolism.Applied and Environmental M icrob iology,2008,74(3):783~791.
T RFLP Analysis Technique and its Application on Analyzing
Microbial Community Structure
LU O Jia jie1,2,LI Li li1,ZH ANG Bin2
(1.T he Inst itute of Subtr opical Ag ricultur e,the Chinese A cademy o f Sciences,Chang sha410125,China;
2.Institut e o f Eco no my A nimal Sciences,Chang sha410128,China)
Abstract:T he adv ance of t erminal restrict ion fr agment leng th polymor phism(T R FL P)in analyzing micro bial community st ruct ur e in env iro nment,anima l and human as well as the fundamental principle and o per ational appro ach of T R FL P w ere de tailed.T R FL P has many adv ant ages over the other g enetic f ing erpr inting pro files o n analy zing micr obial co mmunity structur e ow ning to its higher r eso lv ing pow er and hig her thr ough o ut put by integ rated w ith automatic sequencers and its cult ur e inde pendent.In addit ion,the disadv antag es and the foreg ro und of this technique w ere summarized.
Key words:T RFL P;micr obial co mmunit y structure;fing erpr int ing;auto matic sequencing
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望 摘要: 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等中起着重要作用。随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进, 土壤微生物群落结构多样性, 尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状, 并对其未来研究方向进行了合理展望。 关键词:微生物,群落结构, 土壤微生物群落 Review and prospects on methodology and affecting factors of soil microbial community structure Abstract:Soil microorganisms are important components of soil ecosystem and play central roles in biogeochemicalcycling such as organic matter decomposition, mineral nutrient release, and energy transformation. Along with the intensive comprehension of the importance of microbial community structure diversity and the rapid development of methodology, more and more studies have focused on soil microbial community structure diversity. This review introduces the current development of methodology and affecting factors of soil microbial community structure diversity. We also discussed the directions of future research on soil microbial community structure diversity. Key words: biodiversity, community structure ; soil；microbial community 引言 土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等。土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素, 土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用。由于土壤中微生物个体微小, 数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因, 目前为止大约仅1～10%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物在陆地生态系统中重要作用的认识。虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群
1、史前期（约8000 年前一1676 ) ,各国劳动人民,①未见细菌等微生物的个体；②凭实践经验利用微 生物是有益活进行酿酒、发面、制酱、娘醋、沤肥、轮作、治病等）。 在17世纪下半叶，荷兰学者吕文虎克用自制的简易显微镜亲眼观察到细菌个体之前，对于一门学科来说尚没形成。这个时期称为微生物学史前时期。在这个时期，实际上人们在生产与日常生活中积累了不少关于微生物作用的经验规律，并且应用这些规律，创造财富，减少和消灭病害。民间早已广泛应用的酿酒、制醋、发面、腌制酸菜泡菜、盐渍、蜜饯等等。古埃及人也早已掌握制作面包和配制果酒技术。 这些都是人类在食品工艺中控制和应用微生物活动规律的典型例子。积肥、沤粪、翻土压青、豆类作物与其它作物的间作轮作，是人类在农业生产实践中控制和应用微生物生命活动规律的生产技术。种痘预防天花是人类控制和应用微生物生命活动规律在预防疾病保护健康方面的宝贵实践。尽管这些还没有上升为微生物学理论，但都是控制和应用微生物生命活动规律的实践活动。 2、初创期（1676 一1861 年）,列文虎克,①自制单式显微镜,观察到细菌等微生物的个体；②出于个人 爱好对一些微生物进行形态描述。微生物的形态观察是从安东·列文虎克（Antony Van Leeuwenhock 1632-1732）发明的显微镜开始的，它是真正看见并描述微生物的第一人，他的显微镜在当时被认为是最精巧、最优良的单式显微镜，他利用能放大50～300倍的显微镜，清楚地看见了细菌和原生动物，而且还把观察结果报告给英国皇家学会，其中有详细的描述，并配有准确的插图。1695年，安东·列文虎克把自己积累的大量结果汇集在《安东·列文虎克所发现的自然界秘密》一书里。他的发现和描述首次揭示了一个崭新的生物世界——微生物世界。这在微生物学的发展史上具有划时代的意义。这是首次对微生物形态和个体的观察和记载。随后，其他研究者凭借显微镜对于其它微生物类群进行的观察和记载，充实和扩大了人类对微生物类群形态的视野。但是在其后相当长的时间内，对于微生物作用的规律仍一无所知。这个时期也称为微生物学的创始时期。 3、奠基期（1861 一1897 年）,巴斯德,①微生物学开始建立；②创立了一整套独特的微生物学基本研究方法；③开始运用“实践―理论―实践”的思想方法开展研究；④建立了许多应用性分支学科；⑤进入寻找人类动物病原菌的黄金时期。继列文虎克发现微生物世界以后的200年间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和分门别类阶段。直到19世纪中期，以法国的巴斯德和德国的柯赫为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术。从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人。(1)巴斯德 巴斯德原是化学家，曾在化学上做出过重要的贡献，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做出了卓越的贡献。主要集中在下列三个方面：①彻底否定了“自然发生”学说。“自生说”是一个古老学说，认为一切生物是自然发生的。到了17世纪，虽然由于研究植物和动物的生长发育和生活循环，是“自生说”逐渐消弱，但是由于技术问题，如何证实微生物不是自然发生的仍是一个难题，这不仅是“自生说”
第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖 敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州 310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.doczj.com/doc/9518173912.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209 中图分类号:Q143,Q938,S154 文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial
目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主要有平板计数法、荧光染色法、Biolog微平板分析、微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸(PLFA)谱图、荧光原位杂交(FISH)技术等。近年来，变性梯度凝胶电泳、随机扩增多态性DNA标记、单链构象多态性等方法在湿地研究中也开始应用，对湿地中微生物的研究起到显著的推动作用。以期为利用现代分子技术研究人工湿地中微生物种群净化机理提供参考。 1 PCR-DGGE(Polymerase Chain Reac-tion and Denaturing Gradient Gel Electro-phoresis) 1.1 DGGE 原理 DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的，主要是用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyers等首次将DGGE 技术应用于分子微生物学研究领域。DGGE利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分开。与其它电泳系统相比，它不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开，而是根据序列的不同将片段大小相同的DNA序列分开。当双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相同碱基对数目的双链DNA分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时,即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力大，DNA分子的迁移速度随之减小，产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低可检测到只有1个碱基差异的DNA片段。 1.2 PCR-DGGE 在人工湿地研究中的应用 1.2.1 微生物数量、丰度及多样性 Dong等用PCR-DGGE技术鉴别分析用来处理猪圈废水的湿地基质中微生物的情况，得出菌种的分布与总磷、硝酸盐、磷酸盐的浓度显著相关，从进水到出水中微生物的多样性及丰度显著降低，其优势种为Pseudomonas sp.(假单胞菌), Arthrobac-ter sp.(节细菌属), Bacillus sp.(杆状菌)。通过系统发育分析表明一部分16S rRNA的基因序列与不可培植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝化细菌的活动对湿地中氮的去除起着重要的作用。Yin等利用DGGE技术分析处理受污染景观湖水的三个水平潜流湿地中微生物的多样性、总的微生物群落的改变以及氨氧化细菌的组成。通过PCR对携带单加氧酶的基因序列进行扩增，得出季节的变化对微生物群落的多样性和组成具有影响；序列分析说明湿地中氨氧化细菌是不可培养的，其菌群中含有大量的亚硝化单胞菌类似序列。Guo等利用
第四章种群和群落 第3节群落的结构 授课人：授课时间: 授课地点： 一、教材分析 本节属于高中生物必修3第四章种群与群落中第三节，是之后要学习的群落演替以及生态系统的基础，因此，是本章的重点内容之一。 群落的结构在课程标准中相关的具体内容标准为“描述群落的结构特征”。该条内容标准属于了解水平，要求同学们能够对群落的结构进行简单的描述，能从生命系统的角度说出群落是具有一定的组成和结构。 二、学生分析 在前面的学习中，学生就已经掌握了种群的相关知识，这为本节的学习奠定了基础。但学生毕竟有着基础和其它方面非智力因素的差异，因此要进行因材施教。从疑问的设置，到问题的回答要适合不同层次的学生；从基础知识的掌握，再到能力的培养，包括探索创新能力，学习兴趣等，教师要对不同层次学生进行相应点拨。 三、教学目标 1、知识与能力 1).学生能识别群落，说出群落水平上研究的问题。 2)学生能分析群落的物种组成，并说明不同群落有不同物种组成的原因。 3)学生能举例说出一个群落中不同生物种群间的种间关系。 4)学生能说出群落的空间结构，理解群落的空间结构形成是生物适应环境的结果。 2、过程与方法 通过分析讨论让学生学会合作学习，培养分析归纳问题的能力。凭借概念对具体的生物学现象作出判断和推理，训练学生应用知识、解决问题的能力。 3、情感态度与价值观 通过对群落动态规律的研究，懂得合理开发利用生物资源、保护生态平衡的重要意义，从而进一步树立环保意识。 四、教学重点和难点 1、教学重点 1)群落的结构特征； 2)丰富度的概念； 3)生物种群内各物种之间的关系； 4)种群的空间特征及应用。 2、教学难点 1)生物种群内各物种之间的关系； 2)种群的空间特征及应用。 五、教学思路 在引入课题中，通过设问，引导分析池塘中的各种种群，从而引出群落的概念。在此基础上，进一步引导学生探究的欲望，通过剖析某池塘中的生物群落，引出群落水平上所研究的问题和群落结构
微生物应用技术答案B 一、填空题（每空0.5分，共15分） 1、互生、共生、拮抗 2、有机质化、无机质化 3、共代谢作用、唯一碳源和能源 4、侵染性、专一性、有效性 5、生物体、生理活性物质 6、微生物杀菌剂、微生物除草剂、微生物植物生长调节剂 7、白色农业 8、乳酸菌、肠道细菌 9、同型乳酸发酵菌株、异型乳酸发酵菌株和兼性异型乳酸发酵菌株。 10、酵解、磷酸己糖、三羧酸循环 11、感官鉴定、化学鉴定、物理指标、微生物检验 12、防腐剂保藏法、辐照食品保藏法 二、名词解释（每题5分，共30分） 1、微生物拮抗关系：是指一种微生物在其生命活动过程中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其他微生物的生长繁殖，甚至杀死其他微生物的现象。 2、微生物肥料：微生物肥料是指一类含有活的微生物并在使用后能获得特定肥料效应，能增加植物产量或提高产品质量的微生物制剂。 3、微生物农药：是指由“微生物”（包括细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫或基因修饰的微生物）及其代谢产物和由它加工而成的具有杀虫、杀菌、除草、杀鼠或调节植物生长等具农药活性的物质。 4、微生物饲料：微生物饲料是指利用微生物个体繁殖或其新陈代谢活动来生产和调制的饲料，包括提供反刍动物能量的青贮饲料、提供各种动物蛋白质的单细胞蛋白、作为动物饲料添加剂使用的微生物酶制剂及益生菌剂等。 5、菌群演替：在一个生态区域中，原有的微生物菌群经过一般的发展时期后，由于某种内外环境因素的改变，原有的微生物菌群被另一种新的微生物菌群所取代。
6、食品的腐败变质：是指食品在一定的环境因素影响下，由微生物为主的多种因素作用下所发生的有害的变化，即造成其原有化学性质或物理性质和感观性状发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程 三、写出下列英文缩写的中文全称（每空1分，共10分） 根土比（R/S）五日生化需氧量（BOD5） 根圈促生细菌（PGPR）苏芸金芽孢杆菌（B.t.) 菌体蛋白（SCP）光合细菌（PSB） 乳酸菌（LAB）超高温瞬时灭菌法（UHT） 水分活度（Aw）糖酵解途径（EMP） 四、简答题(每题9分，共45分) 1、试述微生物在碳循环中的作用。 微生物在碳循环中的作用：微生物在碳素循环中具有非常重要的作用，它们既参与固定CO2光合作用，又参与再生CO2的分解作用。 （1）光合作用：参与光合作用的微生物主要是藻类，蓝细菌和光合细菌，它们通过光合作用，将大气中和水体中的CO2合成为有机碳化物。特别是在大多数水生环境中，主要的光合生物是微生物，在有氧区域以蓝细菌和藻类占优势；而在无氧区域则以光合细菌占优势。 （2）分解作用：自然界有机碳化物的分解，主要是微生物的作用。 陆地和水域的有氧条件中，通过好氧微生物分解被彻底氧化为CO2；在无氧条件中，通过厌氧微生物发酵被不完全氧化成有要酸、甲烷、氢和CO2。 2、简述根瘤的形成过程（主要步骤）。 特定的根瘤菌与相应的豆科植物相互辩认使根瘤菌特异地吸附在根毛上→二者相互作用使根毛变形，主要表现卷曲或分枝→细菌进入根内→形成侵入线→侵入线发展，进入根皮层后导致一部份细胞转化为分生组织，细胞分裂和分化，根瘤开始发育→根瘤菌从侵入线内释放到根瘤细胞中繁殖，而后转化成类菌体形态→豆血红蛋白出现，固氮作用开始。 3、微生物农药的优缺点（与化学农药相比）。 优点： 1、无污染，不积累 2、微生物农药对防治对象不产生抗性 3、对害虫天敌危害小 4、持效期长 5、刺激植物生长 6、取材容易，费用低廉 7、操作简单，安全可靠 缺点： 1、药效发挥缓慢 2、制剂成分复杂，活性成分易分解
思考题 名词解释 应用微生物学、 微生物：微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物，个体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。微生物包括细菌、病毒、霉菌、酵母菌等。（但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）、 细菌：广义的细菌即为原核生物是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区（nuclear region)(或拟核)的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌（eubacteria）和古生菌（archaea）两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。 放线菌：放线菌（Actinomycete）是原核生物的一个类群。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。、 酵母菌：子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。是遗传工程和细胞周期研究的模式生物。 霉菌：是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。 微生物培养基：通常只人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。广义上说，凡是支持微生物生长繁殖的介质或材料均可以作为微生物的培养基。培养基种类繁多。 微生物农药：直接利用细菌、真菌和病毒等产生的天然活性物质或生物活体本身开发的，对植物病虫草害进行防治的农药。 群体生长：一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断吸收营养物质并进行新陈代谢。如果同化作用速度超过了异化作用，则其原生质总量不断增加，于是出现个体生长现象。如果这是平衡生长，即各个细胞组分是按恰当比例增长时，到达一定程度就会发生繁殖，从而引起个体数目增加，这时原有的个体已经发展为一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长。在微生物的研究和应用中，只有群体生长才有实际意义。 分批培养：一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断吸收营养物质并进行新陈代谢。如果同化作用速度超过了异化作用，则其原生质总量不断增加，于是出现个体生长现象。如果这是平衡生长，即各个细胞组分是按恰当比例增长时，到达一定程度就会发生繁殖，从而引起个体数目增加，这时原有的个体已经发展为一个群体。随着群体中各个个体的进一步生
大学生选修课应用微生物学论文 当人类在发现和研究微生物之前，把一切生物分成截然不同的两大界－动物界和植物界。随着人们对微生物认识的逐步深化，从两界系统经历过三界系统、四界系统、五界系统甚至六界系统，直到70年代后期，美国人Woese等发现了地球上的第三生命形式－古菌，才导致了生命三域学说的诞生。该学说认为生命是由古菌域（Archaea）、细菌域（Bacteria）和真核生物域（Eucarya）所构成。在图示“生物的系统进化树”中，左侧的黄色分枝是细菌域；中间的褐色和紫色分枝是古菌域；右侧的绿色分枝是真核生物域。 生物界的微生物达几万种，大多数对人类有益，只有一少部份能致病。有些微生物通常不致病，在特定环境下能引起感染称条件致病菌。能引起食品变质，腐败，正因为它们分解自然界的物体，才能完成大自然的物质循环。 微生物技术作为生命科学和生物技术的主要分支之一，是它们发展的先导和基础，特别是在解决人类所面临的人口健康、资源紧缺、粮食危机等方面，其具有不可替代的重要作用。下面本文将在微生物在污水处理和制氢两个方面论述微生物在环保和能源方面的巨大作用。 古菌域包括嗜泉古菌界（Crenarchaeota）、广域古菌界（Euryarchaeota）和初生古菌界（Korarchaeota）；细菌域包括细菌、放线菌、蓝细菌和各种除古菌以外的其它原核生物；真核生物域包括真菌、原生生物、动物和植物。除动物和植物以外，其它绝大多数生物都属微生物范畴。由此可见，微生物在生物界级分类中占有特殊重要的地位。 在当今社会中，随着全球工业和经济的迅速发展，人们对能源的需求正在逐渐增大，但目前人类使用的绝大部分是不可再生的矿物质能源，其数量是十分有限的，从而造成了能源的短缺。与此同时，在人类发展的过程中，由于不注重对环境的保护而一味的发展，对地球造成了大量的污染，这些污染已严重影响了人类社会的发展，甚至关系到人类的生死存亡。因此有科学家预测说能源和环保将是人类社会在今后发展的两大主题。 生命进化一直是人们关注的热点。Brown等依据平行同源基因构建的“Cenancestor”生命进化树，认为生命的共同祖先Cenancestor是一个原生物。原生物在进化过程中产生两个分支，一个是原核生物（细菌和古菌），一个是原真核生物，在之后的进化过程中细菌和古菌首先向不同的方向进化，然后原真核
应用微生物学习题解答 第一章 1. 解释名词： (a) spontaneous generation: 自然发生说。此概念乃系『生物生自无生物』，相似 词为abiogenesis（偶然发生说）。 (b) biogenesis: 生源论。此概念乃系『生物生自生物』。 (c) generation time: 世代时间。菌细胞分裂增殖一倍细胞数所需时间。相似词 为mass doubling time（倍增时间）、doubling time（倍加时间）。 (d) agar: 洋菜胶或琼脂。系为萃取自红藻类海草之复合多糖，主要由agarose （琼脂糖）及agaropectin（琼脂胶）这两种多糖所组成。 2. 科霍假说。 3. 有害人体之细菌：(a) Vibrio parahemolyticus (肠炎弧菌)，引起胃肠炎之致病原； (b)Legionella pneumophila（嗜肺退伍军人协会杆菌），引起退伍军人症之致病原。 有害人体之真菌：(a) Aspergillus flavus（黄曲菌），黄曲毒素（aflatoxin）生产菌；(b) Candida albicans（白色念珠菌），引起念珠菌病（candidiasis）之致病原。 4. 有益人体之细菌：(a) Lactobacillus bulgaricus (保加利亚乳酸杆菌)，可用来制作酸奶；(b)Bacillus natto（纳豆菌），可用来制作纳豆。 有益人体之真菌：(a) Saccharomyces cerevisiae（啤酒酿母菌），可用来酿制啤酒；(b) Aspergillus oryzae（米曲菌），可用来生产曲酸、酱油、味噌等。 5. 微生物六大优点如下：体积小表面积大、培养简单、繁殖迅速、于温和条件下进行、菌株育种容易、种类多。 6. 显微镜（microscopes）主要分为光学显微镜（light microscopes）及电子显微镜（electron microscopes）。显微镜法（microscopy）则有明视野显微镜法（bright field microscopy）、暗视野显微镜法（dark-field microscopy）、荧光显微镜法（fluorescence microscopy）、位相差显微镜法（phase-contrast microscopy）、电子显微镜法（electron microscopy）。
生活污水处理厂微生物群落结构解析 发表时间：2018-11-27T16:00:33.133Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第21期作者：安海金[导读] 其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。 安海金 山西华瑞鑫环保科技有限公司山西省太原市 030024摘要：本文的研究对象是A城的城市生活污水处理厂，研究方法为高通量测序技术，最终获得解析功能单元中微生物群体结构结果。通过高通量测序得出ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。 关键词：生活污水；微生物群体；结构解析引言：随着工业经济的不断发展，国家越来越重视对工业污染的处理要求，污水处理也是一项重要内容。如果污水处理不达标，排放出不符合要求的污水，会直接对湖水、河水产生负面影响，比较常见的就是水体富营养化。在城市污水处理的过程中，脱氮除磷是重要内容，污水处理厂中存在大量的微生物菌属，了解其群落结构特征可以为脱氮除磷在理论上提供帮助，便于脱氮除磷工作在实际工作中的推 进。目前，城市污水处理厂使用的主要方法是氧化沟工艺，从微生物群体结构出发来解析的还比较少。本文以A城的污水处理厂为例，使用污水处理厂中的活性污泥作为研究对象，采用高通量测序技术从各级分类水平上分析污水处理厂中的微生物多样性以及其群落结构特征，希望能为氧化沟污水处理提供补充性的理论支持。 1材料与方法 1.1污水处理厂概况 A城污水处理厂位于市区东南河边，每天处理污水量达10—15吨。该污水处理厂的进水水质中TP（总磷）为2.7mg/L，氨氮为18.7mg/L，YN（总氮）为24.5mg/L，化学需氧量为242.8mg/L，升华需氧量为109.5mg/L。处理污水主要使用氧化沟，水力停留时间为十小时。 1.2高通量测序 该方法是指将氧化沟厌氧池中的活性泥污放入冰盒后带回实验室立即试验，借助试剂盒的帮助提取微生物基因组DNA，为了检测抽取基因的完整性，需要使用到1%的琼脂糖凝胶电泳，之后用试剂盒来检验基因组DNA的浓度。每个样品需重复三道工序，首先进行3分钟的95℃预变；之后是保持30s的95℃、55℃、72℃的循环，包含25个循环；最后是在72℃下保持5分钟。对PCR产物进行琼脂糖电泳并回收，使用Qubit2.0DNA检测产物的定量，再通过IlluminaMiseq测试平台对PCR产物做高通量测序。 1.3微生物群落结构分析 通过对所得序列的质量控制除去不合格的引物序列、短片段和低质量序列，对剩下的序列进行相似性分析，使用uclust软件划分操作分类单元。同时对所选序列进行物种分类，分为门、纲、目、科、属这几个基本单位，根据各单位内的序列数量进行统计分析，绘制物种有关图表。 2结果与讨论 2.1污水处理效果 试验时的污水温度处于25—35℃的区间内，笔者对该污水处理厂的进水浓度进行了累计频率分析，结果为该污水处理厂的出水水质是符合一级B类排放标准的。在该污水处理厂升级改良后，出水水质满足一级A类排放标准。 2.2污泥中微生物多样性分析 最初共获得了28560条有效序列，通过质量控制后分为4435个分类操作单元，即OUT。对有效序列进行的是α指数多样性分析，结果为ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。后续可根据OUT数目、ACE指数、Chaol指数等绘制丰富度稀疏图或Shannon指数图等，从数值中可以分析出序列数量是接近饱和的，这也表明了污泥中有较多的微生物物种，并且其丰度与多样性都很高。 3微生物群落结构解析 3.1门水平群落结构分析 试验结果表明大部分的细菌为变形菌门和浮霉菌门这两类，这两类细菌也是比例超过了20%比例的细菌。变形菌门细菌都是革兰氏阴性菌，有学者指出变形菌门有利于污水中有机物的祛除。浮霉菌门对去除水体中的氨氮和亚硝酸盐氮也有很大的作用，它主要存在于淡水水体、海洋沉积物、污水处理系统、土壤等厌氧环境中。其他占比比较大的细菌还有酸杆菌门、衣原体门、放线菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，这些细菌都可以处理污水中的有机物，具有相似的作用。 3.2纲水平群落结构分析 在纲水平下，浮霉菌纲是最主要的，比例达23%左右，其他比较重要的有γ-变形菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲等，加起来的比例在25%左右。α-变形菌纲是一种自养微生物，可以在硝化过程中发挥作用；γ-变形菌纲与β-变形菌纲具有相同点，都为兼性异氧菌，参与COD 的降解过程，在污水处理中发挥重要作用。 3.3目水平群落结构分析 目水平下的细菌种类较多，比例最高的是浮霉菌目，比例在20%以上，明显高于其他目。变形菌门比例也不低，但种类很多，包括根瘤菌目、红螺菌目、假单胞菌目、黄色单胞菌目、军团菌目、交替单胞菌目、脱硫弧菌目、伯克氏菌目、交替单胞菌目等。衣原体目的比例也比较多，同样包括很多种类，比如鞘脂杆菌目和暖绳菌目等。 3.4科水平群落结构分析
100学年度第一学期微生物应用技术 Final Examination 学生__________ 学号:_____________ ★请勿选择你报告的题目来回答 I. 解释名词 (30分选六题): 1. 何谓Molecular farming, 为何用植物? 2. 生分解性 3. 芽孢杆菌在工业上的应用优势 （1）Bacillus及其代谢产物已广泛应用于食品、医药、饲料中，目前尚未发现有任何毒副作用，是一种安全的菌种。 （2）Bacillus可以耐受不良的环境，如80℃的高温环境，pH2-3的酸性环境。 并且对营养要求简单，代谢快，易于分离和保存。 （3）Bacillus不仅对革兰氏阳性菌有抑菌作用，对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制效果。 4. 生物相容性 用来描述生物医用材料与生物体相互作用情况的概念。 若生物材料相容性好，表示： a.该材料能够与身体相互适应 b.不会对身体有显着或严重的不良反应 c.身体也不会引起材料性能的改变 可分为：血液反应、免疫反应、组织反应、生物化学反应 5. 解说液化淀粉的功用 6. Plant Transformation 7. 白色生技的应用 8. NDM-1超级细菌 9. 抗药性结核分枝杆菌产生 10. 专利三特性 （1）排他性：为了保护一发明或创作其正当权益，而向政府提出申请，经过审查认为符合专利法的规定，因而给予申请人在一定期间享有专有排除 他人未经其同意而制造、贩卖、使用或为上述目的而进口该物品之权， 或专有排除他人未经其同意而使用该方法及使用、贩卖或为上述目的而 进口该方法直接制成物品之权，这种排他性就是专利权特性。 （2）时间性：发明、新型、新式样专利均自公告之日起给予专利权。 专利权只在专利权期限内有效，期限届满，权力消灭，技术内容即成公 共财产。 （3）地域性：专利系采属地主义，因此，虽已向外国申请专利，但如欲在我国
环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不