固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
um regulating horm ones[J ].J Controlled Release ,2000,66 (223):12721331 [接受日期] 2006203216 3 通讯作者: 周建平,教授;研究方向: 药物新制剂与新剂型; T el :025*********; E 2m ail :zhoujp60@1631com 壳聚糖微球给药系统 张祖菲, 周建平3, 霍美蓉 (中国药科大学药剂学教研室,江苏南京210009) [摘 要] 主要介绍壳聚糖微球的制备方法,影响其载药的主要因素,及其在缓控释、靶向给药、黏膜给药、生物 大分子给药等方面的应用。近年来壳聚糖微球作为新型给药系统备受关注。 [关键词] 壳聚糖微球;药物载体;制备方法;缓控释 [中图分类号] R944.9;T Q314.1 [文献标识码] A [文章编号] 1001-5094(2006)06-0261-06 Chito san Micro sphere s Drug Delivery Systems ZH ANG Zu 2fei , ZH OU Jian 2ping 3, H UO Mei 2rong (Department o f Pharmaceutics ,China Pharmaceutical Univer sity ,Nanjing 210009,China ) [Abstract] The preparation methods and technology ,factors affecting the drug loading efficiency ,applica 2tion and the prospect of chitosan microspheres were reviewed.Chitosan microspheres ,as a novel drug delivery system ,have been widely investigated in recent years. [K ey w ords] Chitosan microspheres ;Drug carrier ;Preparation methods ;C ontrolled release 壳聚糖(chitosan )是甲壳素脱乙酰化的产物,是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物,来源丰富、制备简单,具有良好的生物相容性。壳聚糖分子结构中含有呈弱碱性的游离氨基,能结合氢离子,使壳聚糖分子表面荷正电,因此,壳聚糖在酸性条件下呈现为线性高分子电解质,形成的溶液具有一定的黏度,溶液的浓度越高,壳聚糖的分子质量越大,相应的黏度则越大。壳聚糖的氨基属于较活泼的一级氨基,在中性介质中能与芳香醛或脂肪醛形成Schiff 碱,可以与具有双官能团的醛或者酸酐等交联,产物不易溶解,溶胀程度也较小,理化性质稳定。微球系以天然、合成或半合成高分子材料为基质,将药物均匀分散或包埋在骨架中而制成的球形 载体给药系统,属基质型骨架微粒,常见粒径为1～ 40μm 。目前,以壳聚糖为材料制备缓控释制剂的研究已经取得了较大的进展,其中壳聚糖微球因具有控制释药、组织靶向、提高药物稳定性等多方面的优势,已成为近年来新型给药系统研究的热点。本文就壳聚糖微球给药系统的研究进展进行综述。1 壳聚糖微球的制备方法 壳聚糖分子中含有氨基,易与其他化合物相应的活性基团发生反应,进一步交联形成微球。根据药物、载体材料壳聚糖的性质以及所需微球的释药性能和临床给药途径可选择不同的制备方法。目前,制备壳聚糖微球的方法主要有乳化交联、“液中
第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）
绿色原料——壳聚糖的应用研究进展 09化学1班 XXX 指导老师：沈友教授 (惠州学院化学工程系，广东，惠州，516007) 摘要:本文综述了绿色原料壳聚糖的应用研究进展，着重介绍了壳聚糖在食品，水处理，生物药用，造纸业等方面的应用。 关键词:壳聚糖应用食品水处理 前言 原料在化学品的合成中非常重要，其可以成为影响一个化学品的制造、加工与使用的最大因素之一。如果一个化学品的原料对环境有负面的影响，则该化学品也很可能对环境具有净的负面影响。要实现绿色化学，在选择原料时应尽量使用对人体和环境无害的材料，避免使用枯竭或稀有的材料，尽量采用回收再生的原材料，采用易于提取、可循环利用的原材料，使用环境可降解的原材料。 自然界的有机物，数量最大的是纤维素，其次是蛋白质，排在第三位的是甲壳素，估计每年生物合成甲壳素100 亿t。甲壳素N-脱乙酰基的产物壳聚糖就是一种重要的绿色原料。 壳聚糖化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，壳聚糖的外观为白色或淡黄色半透明状固体, 略有珍珠光泽, 可溶于大多数稀酸如盐酸、醋酸、苯甲酸等溶液, 且溶于酸后,分子中氨基可与质子相结合, 而使自身带正电荷。自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。壳聚糖无毒无害,具有良好的保湿性、润湿性,能防止静电; 化学稳定性良好, 但吸湿性较强, 遇水易分解。对壳聚糖进行化学改性, 得到的壳聚糖衍生物在许多物化性质方面都得到改善，其应用也更加受到关注。本文着重介绍了壳聚糖在食品，医药，水处理方面的应用进展。
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定 实验项目性质：综合性 所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定 计划学时：6学时 一、实验目的 1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。 2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 二、实验原理 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。 载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。 交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。 包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
选修一：考点4：制备和应用酶的固定化技术 【学习目标】 1．说出固定化酶概念和方法(A) 2．制备固定化酵母细胞(B) 【知识梳理】 （一）课题背景 酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。 实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。 设想：能否有一种方法使酶发挥它的优点，而没有这些缺点？ 固定化酶：优点：容易与水溶性反应物和生成物分离，可被反复使用 实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都 是通过一系列的酶促反应才能得到的 设想：细胞中有多种酶，能否用固定化酶类似的技术来处理细胞？ 固定化细胞：优点：成本低，操作更容易 （二）、固定化酶的应用实例 高果糖浆是指果糖含量为42%的糖浆能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 （三）、固定化细胞技术 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被化学结合或吸附，而个小的酶容易从包埋料中漏出。 包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法 〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶）。 （四）、实验操作 (1)制备固定化酵母细胞 制备固定化酵母细胞需要的材料是干酵母、CaCl2和海藻酸钠溶液 1.酵母菌的活化 活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 2.配制物质的量尝试为0.05mol/L的Cacl2溶液 3.配制海藻酸钠溶液 加热溶化海藻酸钠时要注意：微火加热并不断搅拌，防止海藻酸钠焦糊 4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
酶的固定化技术 摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。 关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞 Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future. Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell 前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
壳聚糖微球的制备及其在生物医药领域的应用 杨 婷,侯文龙,杨越冬* (河北科技师范学院理化学院,秦皇岛 066004) 摘要:壳聚糖是唯一天然碱性氨基多糖,它具有良好的生物相容性、低毒性和生物可降解性,是制备微球的 良好材料。本文综述了近年来国内外壳聚糖微球的制备方法,如喷雾干燥法、乳化交联法、逐层自组装法、界面 聚合法、溶剂蒸发法以及离子凝胶法,分析了不同制备方法的优点及不足。壳聚糖微球不仅可作为固定化酶或 细胞的载体,而且是一种具有广泛应用前景的新型药物载体,本文还对壳聚糖微球在固定化酶或细胞和包埋药 物领域的应用进行了概述。 关键词:壳聚糖;微球;生物医药;应用 微球能保护包埋物免受外界环境影响,以及屏蔽味道、颜色或气味,降低挥发性和毒性,控制可持续释放等多种作用。近年来,微球已被广泛应用于生物、医药和食品等多个领域[1~2]。壳聚糖(CS)是经甲壳素脱乙酰化的线性高分子,是唯一天然碱性氨基多糖,具有良好的生物相容性、低毒性、生物可降解性,有抗菌、防腐、止血和促进伤口愈合等特殊功能和抗酸、抗溃疡的能力,可阻止或减弱药物在胃中的刺激作用,是制备微球的良好材料,在生物医学[3]、药学[4~8]以及固定酶或细胞[9~10]领域倍受专家青睐。壳聚糖作为药物载体,具有控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用、提高疏水性药物对细胞膜的通透性、增强药物稳定性及改变给药途径等特点,是一种新型药物制剂辅料;壳聚糖作为固定化酶的载体,其机械性能良好、化学性质稳定、耐热性强,特别是分子中含有氨基,容易和蛋白质或酶结合,可络合金属离子,使酶免受金属离子的抑制;另外,壳聚糖来自于生物体,细胞毒性极低、亲和性好、安全性高,是固定细胞的良好材料。因此,近几年壳聚糖微球的制备和应用成为研究的热点。本文主要介绍了喷雾干燥、乳液交联、逐层自组装、界面聚合等多种制备壳聚糖微球的方法及其在生物医药等领域的应用。 1 壳聚糖微球的制备 1 1 喷雾干燥法 喷雾干燥法是工业中制备壳聚糖微球较广泛的方法之一,此方法是以热气流干燥雾化液滴为基础的。图1为喷雾干燥法工艺流程[11],首先将壳聚糖溶于酸性水溶液中,再将其它药物溶解或分散于该壳聚糖溶液,加入合适的交联剂,然后进入喷雾干燥器雾化,形成小液滴,溶剂瞬间蒸发可形成自由流动的粒子。微球的粒径取决于喷嘴的直径、喷雾流率、雾化压力、入口温度和交联程度等因素。Cev her等[12]以壳聚糖微球装载不同质量的盐酸万古霉素,将壳聚糖溶于1%(v/v)酸溶液得到0 5%(w/v)浓度的聚合物溶液,再将不同质量的盐酸万古霉素分散至该聚合物溶液中。然后将配制好的溶液进行喷雾干燥,其过程工艺参数为:入口温度130 2 ,出口温度90 2 ,喷雾流率600NL/h,喷嘴直径0 5m m。装载盐酸万古霉素的壳聚糖微球可以持续的保持药效。H e等[13]制备壳聚糖微球时也采用了喷雾干燥法,将配制好的壳聚糖水溶液与一定比例的戊二醛水溶液混合均匀,然后进行喷雾干燥,所用的喷嘴规格为0 5mm,入口温度与喷雾流率分别为160 和6m L/min,所制备出的壳聚糖微球的粒径在3~12 m之间。Williams等[14]在酸中配制一定比例的壳聚糖溶液,加入交联剂,调整参数:喷嘴直径0 3mm,入口、出口温度分别为142 3 、84 3 ,空气流量始终保持在450NL/h。Shi等[15]向壳聚糖酸溶液中加入 基金项目:河北省自然科学基金项目(B2009000862); 作者简介:杨婷(1984-),女,硕士研究生,主要从事天然产物化学研究工作; *通讯联系人:T el:0335 *******,E mail:kycyy d@https://www.doczj.com/doc/9017425221.html,.
2019年精选生物《生物技术实践》[第三章酶的应用技术实践第二节制备和应用固定化酶]苏教版巩固辅导[含答案解析]第四十五篇 第1题【单选题】 下列关于加酶洗衣粉的说法中，正确的是( ) ①加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好②加酶洗衣粉效果的好坏受很多因素影响③加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶④加酶洗衣粉相对普通洗衣粉来讲有利于保护环境． A、②③④ B、①②③ C、①② D、①③④ 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶酶的用量对果汁产量影响的曲线是
A、甲 B、乙 C、丙 D、丁 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 A、温度影响果胶酶的活性 B、若温度从10℃升高到40℃，酶的活性都将逐渐增强 C、40℃与60℃时酶的活性相等 D、该酶的最适温度一定是50℃ 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是( ) A、酶对高温不敏感，但对强酸、强碱非常敏感 B、加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境 C、固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D、酶的催化功能很强，但需给以适当的营养物质才能较长时间维持其作用 【答案】：
【解析】： 第5题【单选题】 下列关于纤维素酶的说法，错误的是( ) A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( ) A、反应产物对固定化酶的活性没有影响 B、实验室常用吸附法制备固定化酵母细胞 C、若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶 D、固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显【答案】： 【解析】：
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/9017425221.html, 壳聚糖的制备方法及研究进展 作者：张立英 来源：《山东工业技术》2018年第02期 摘要：壳聚糖作为一种碱性多糖被广泛应用于食品、生物、化工、医疗等领域。本文重点介绍了壳聚糖的制备方法及其研究进展，并对其发展趋势进行了展望。 关键词：壳聚糖；碱性多糖；制备方法 DOI：10.16640/https://www.doczj.com/doc/9017425221.html,ki.37-1222/t.2018.02.016 壳聚糖本身的分子结构类似于纤维素，因其多了一个带正电荷的胺基，使其化学性质较为活泼。目前壳聚糖正因其优良的生理活性在食品、化妆品、医药、化工、污水处理等方面展现出广阔的应用前景，近十年来国内外对于壳聚糖的开发研究热度一直持续不减，各种新颖的制备方法也是层出不穷。 1壳聚糖的来源 壳聚糖通常是由甲壳素（又名几丁质）经脱乙酰基作用获得，甲壳素在自然界中广泛存在于高等真菌以及节肢动物（虾、蟹、昆虫等）的外壳中，其中虾壳、蟹壳是工业生产壳聚糖的主要原料。由于大分子间的氢键作用，天然存在的甲壳素构造坚固，化学性质稳定，不溶于水、酸碱和一般的有机溶剂，这也使得甲壳素的应用范围非常有限，因此甲壳素只有经脱乙酰基处理成壳聚糖才能获得广泛应用。 2壳聚糖的制备方法 （1）化学降解法。传统的壳聚糖生产多采用化学降解法。作为壳聚糖工业生产最常用的制备方法，化学降解法简便易行，效率高，整个生产过程容易控制，但该法环境污染较为严重，对周边环境具有一定的破坏性。欧阳涟等从蟹壳中获取甲壳素，并通过脱乙酰反应制备出了壳聚糖。试验探究了影响产物壳聚糖脱乙酰反应的各种因素，如反应温度、碱液含量及反应时间等，最终确定制备高脱乙酰度壳聚糖的条件为反应温度70℃，碱液质量分数47%，反应时间10 h。 （2）微生物培养法。微生物发酵法生产壳聚糖起源于美国，我国从上世纪90年代开始研究。其主要原理是利用微生物自身生产的酶进行催化，从而脱去甲壳素中的乙酰基，进而制备壳聚糖。目前该领域研究重点主要集中在优良菌株的选育和培养基的优化上。 贺淹才等首先采用电解法从培养的黑曲霉湿菌体中制得甲壳素，然后采用碱提取法从培养的黑曲霉湿菌体中制备壳聚糖。试验基于黑曲霉细胞壁的主要成分为蛋白质与甲壳素，而蛋白质带有可电离的基团，于溶液中可形成带电荷的阳离子和阴离子，在外加电场作用下发生迁
壳聚糖微球的制备及对染料的吸附性能 壳聚糖微球对阴离子染料具有较大的吸附容量，而壳聚糖微球对阳离子染料吸附容量较小。壳聚糖微球对染料的吸附过程受溶液初始浓度、pH值等因素的影响；当pH=2、温度为298 K时，壳聚糖微球对AO7的吸附率达93%，该吸附过程为具有化学吸附的自发过程。 标签：壳聚糖微球染料废水pH值吸附吸附量 一、印染废水的处理意义 印染废水中的污染物绝大部分来自织物本身和加工过程使用的化学染料以及辅助剂。随着工业的快速发展，人类正面临着越来越缺乏的可用的淡水资源，因此要求越来越高的污水处理回收技术。印染行业是工业废水，印染废水中较多的有机物类型和较高的COD、BOD值，高色度，高毒性。纺织废水成分复杂和不稳定，因此在废水处理中印染废水处理已成为一个焦点。 二、印染废水的处理办法 印染废水的处理过程主要包括：预处理和后续处理。预处理工艺的作用主要是去除部分污染物，改善污水水质，以提高后续处理的效果。大量的工业实践证明，印染水的综合治理过程中废水的预处理工艺具有极其重要的地位，它关系到整个系统的运行稳定和排放水质达标，同时也涉及到运行成本的高低。印染废水后续处理是废水处理的关键环节，目前所用的方法主要有化学处理法、生化处理法和物理处理法 三、壳聚糖吸附处理染料废水的研究进展 壳聚糖吸附染料是通过氢键，范德华力，静电引力来实现的。Mckay等首次研究了壳聚糖对印染废水的吸附性能，研究表明，染料种类、温度、pH、溶液初始浓度等对壳聚糖吸附效果有较大影响。随后国内外学者开始对壳聚糖吸附染料废水进行研究，近年来取得了丰硕的成果。实验数据表明，壳聚糖对很多种染料都有良好的吸附效果，尤其是对酸性染料具有较大的吸附容量，而对碱性染料吸附容量较小；壳聚糖对多数染料的吸附过程符合Langmuir吸附等温线。Wong 等用蟹壳分离出的甲壳素制成的壳聚糖来处理五种酸性染料（酸性绿25、酸性黄10、酸性黄12、酸性红18和酸性红73）废水，发现Langmuir吸附等温线与这四种染料的吸附过程有很好的关联。林静雯[1]等对壳聚糖改性，使壳聚糖与丙烯酰胺形成接枝共聚物，然后用这种改性的壳聚糖来处理一种色泽为深蓝色的印染废水，发现其去除率达到76%，脱色率达到95.92%。Annadurai等研究了壳聚糖吸附处理活性黑13染料，实验过程中控制反应时间、染料的初始浓度、壳聚糖颗粒大小、pH和温度，并对其进行优化，得出最佳吸附条件。在最佳吸附条件下，吸附容量达到130.0 mg/g。通过吸附热动力学研究，表明吸附过程为吸热反应。朱启忠[2]等研究壳聚糖对酸性品红染料的吸附性能，研究发现在一定
固定化酶制备及酶活力测定 实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青 实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20 实验指导：易喻 摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。 关键词：固定化酶酶活力包埋法 Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity. 前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 正文： 1.实验过程 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 ①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
壳聚糖多孔微球制备与表征 摘要:用来源丰富且廉价，并具有许多优良生物性能的壳聚糖为原料，把他配成质量分数为1.5%的溶液，通过与戊二醛交联，用三氯甲烷作为制孔剂，制备一定粒径的壳聚糖多孔微球。用香兰素测试其吸附性能。 关键词：壳聚糖多孔微球吸附制备表征 在可生物降解天然大分子材料中, 壳聚糖是一类从虾、蟹等甲壳类动物中的甲壳素经化学方法脱乙酰基后提取的氨基高分子多糖, 它来源丰富、成本低廉, 是仅次于纤维素的第二大类天然大分子材料[ 1~ 3] . 它具有良好的生物相容性和生物降解性, 是目前唯一具备电正性特点的天然大分子, 已在医药、食品、农业、环保、日化等领域获得广泛的应用. 高分子微球由于其具有高分散性和大比表面积 的特点, 是一种性能优异的载体材料, 在药物控制释放、生物工程、废水处理等方面已被广泛研究, 有着广阔的应用前景[ 4] . 把壳聚糖材料制备成高分子微球,使壳聚糖和高分子微球的优异性能有机结合也是目前国内外较为热点的研究领域[ 5] . 壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，分子式为:(C6H11O4N)n,结构式为:
壳聚糖它是甲壳质经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖。具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能。广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉[6]。 香兰素是人类所合成的第一种香精,由德国的M·哈尔曼博士与G·泰曼博士于1874年合成成功的。通常分为甲基香兰素和乙基香兰素。甲基香兰素（vanillin），化学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，外观白色或微黄色结晶，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，为香料工业中最大的品种，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成份[7]。其用途十分广泛，如在食品、日化、烟草工业中作为香原料、矫味剂或定香剂，其中饮料、糖果、糕点、饼干、面包和炒货等食品用量居多。目前还没有相关报道说香兰素对人体有害。乙基香兰素为白色至微黄色针状结晶或结晶性粉末,类似香荚兰豆香气,香气较甲基香兰素更浓。属广谱型香料,是当今世界上最重要的合成香料之一,是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料,其香气是香兰素的3-4倍,具有浓郁的香荚兰豆香气,且留香持久。广泛用于食品、巧克力、冰淇淋、饮料以及日用化妆品中起增香和定香作用。另外乙基香兰素还可做饲料的添加剂、电镀行业的增亮剂,制药行业的中间体[8]。 香兰素为芳香酚类的代表, 被作为模型分子.为此, 针对香兰素分子中含有疏水性的苯环, 我们合成具有疏水性吸附能力的壳聚糖多
第二节固定化酶的制备和应用 1．掌握制备固定化酶的常用方法。(重点) 2．掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点) 1．固定化酶 固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．制备固定化酶的方法 (1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。 3．固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。 [合作探讨] 探讨1：对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？ 提示：物理吸附法。 探讨2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？ 提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。 探讨3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？ 提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。 [思维升华] 1．制备固定化酶的常用方法可用下图所示： 2．常用的制备固定化酶的方法
1．最广泛的细胞固定化方法 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 2．优点 (1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。 (2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。 [合作探讨] 探讨1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？ 提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。 探讨2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？ 提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。 探讨3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了什么？ 提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。 [思维升华] 1．制备固定化酵母菌细胞的操作流程 准备各种实验药品和器具
改性壳聚糖的研究进展 1壳聚糖的理化性质 壳聚糖(chitosan，(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)是甲壳素(chitin,(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)部分脱乙酰化的产物。甲壳素广泛存在于蟹、虾以及藻类、真菌等低等动植物中，含量极其丰富，自然界每年产量约在100亿吨，是仅次于纤维素的第二大多糖。它是由葡萄糖结构单元组成的直链多糖，此多糖中含有数千个乙酰己糖胺残基，因此在分子间形成很强的氢键，导致其不溶于水和普通有机溶剂，这就大大限制了其应用范围。 将甲壳素在碱性条件下加热，脱去N-乙酰基后可生成壳聚糖。人们常将N-脱乙酰度和粘度(平均相对分子质量)作为衡量壳聚糖性能的两项指标。N-脱乙酰度是判定壳聚糖溶解性的依据，脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基就越多，在酸中的溶解性就越好；而壳聚糖相对分子质量越大，分子之间的缠绕程度就越大，溶解度就越小。壳聚糖是自然界中唯一的一种碱性多糖，它一般是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。壳聚糖可溶于大多数稀酸，如盐酸、醋酸、苯甲酸溶液，且溶于酸后分子中氨基可与质子结合，使自身带上正电荷。甲壳素及壳聚糖的结构式如图1所示：
图1壳寡糖与壳聚糖的结构式 甲壳素和壳聚糖在自然界可以被各种微生物降解。微生物中的甲壳素酶(chitinase)可以随机地水解甲壳素的N-乙酰-β-(1-4)糖苷键。而壳聚糖可以被多种酶水解，包括壳聚糖酶(chitosanase)、麦芽糖酶、脂肪酶、以及各种来源的蛋白酶。在人体内甲壳素酶和壳聚糖酶并非普遍存在，通过测定显示N-乙酰壳聚糖在人血清中可以被人体内普遍存在的溶菌酶(lysozyme)降解。 壳聚糖的主链结构中引入了2-氨基，化学性质区别于3,6-羟基，与甲壳素相比增加了反应选择性的功能基团。由于C6-OH是一级羟基，C3-OH是二级羟基，空间位阻不同反应活性也不同，再加上C2-NH2，壳聚糖就具有三个活性不同的可供修饰的基团。根据不同的需要，被修饰的壳聚糖作为一种功能大分子广泛用于各种领域。由于壳聚糖只在酸性水溶液中溶解，而在中性或碱性水溶液中以及多数有机溶剂中不溶，限制了它的应用范围，因此科学家们采用衍生化的方法对壳聚糖进行改性获得了多种水溶性和可溶解于某些有机溶剂的衍生物，大大扩展了壳聚糖的应用范围。其中包括对壳聚糖进行N-,O-酰化，含氧无机酸酯化，醚化，N-烷基化，C6-OH和C3-OH的氧化，以及鳌合、交联等，在此过程中获得了许多性能良好，甚至是