实验研究/论著 热休克凋亡食管癌细胞负载自体树突状细胞制备
及其表型特征的分析
孙振宇, 李成万, 顾敏威, 孙琦, 赵永, 陆晓
南通大学第三附属医院无锡市第三人民医院胸外科,江苏无锡214062
Preparation and characterize of autologous dendritic cells loaded by heat
shocked apoptotic esophagus cancer cells
S UN Zhen y u,L I Cheng w an,G U M in w ei,S UN Qi,ZH A O Yong,L U X iao
Dep ar tment of Gener al T hor acic S ur ger y,T hir d A f f iliated H os p ital o f N antong Univ er sity,W ux i N o.3P eop le s
H osp ital,W ux i214062,P.R.China
摘要 目的:建立自体热休克凋亡食管癌细胞抗原制备、树突状细胞(DC)体外诱导以及抗原负载方法,为DC肿瘤疫苗的临床应用提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的食管癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采用人工肝素抗凝采集外周静脉血,分离单个核细胞(PBM C),贴壁法获得单核细胞,经GM CSF与IL 4体外诱导成未成熟树突状细胞(imDC);负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗,并对DC疫苗的形态、数量及表型特征进行分析。结果:肿瘤细胞抗原每克组织得率(9.89
2 46) 106,平均凋亡率(67.60
3 23)%。imDC活率>95%,imDC表型分析为CD11c+HL A-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+和CD11c+CD86+,表达率分别为(88.30 3.59)%、(1.25 0.55)%、(6.13 1.79)%和(72 90 5.01)%。DC 疫苗活率>95%,DC疫苗表型为CD11c+ H L A-DR+、CD11c+CD80+、CD11c+ CD83+和CD11c+CD86+,表达率分别为(89.60 3.91)%、(34.20 3.85)%、(6
4 90 8.05)%和(86 10 6 22)%。负载自体抗原DC诱导CT L杀伤自体肿瘤细胞的杀伤率为(65.90 6.25)%,明显高于杀伤食管癌肿瘤细胞株的杀伤率 (32.56 2 68)% ,P<0 01。结论:本方法稳定、安全及可靠,可制备出在体外诱导特异性CT L的DC肿瘤疫苗。
中华肿瘤防治杂志,2011,18(2):98-101[ABSTRAC T] OBJECTIVE:T o establish a method for the pr epa rat ion of heat sho cked esophagus cancer cells ant igen,and autolo g ous dendr itic cell(DC)induced in v itro including t he ant igen load ing.METHODS:Sing le cell suspensio n w as obtained fr om the sur g ical fresh tissues o f esophag us cancer by enzy me digestion,and then the cell antig en w as prepared thro ug h apoptosis induced by betulinic acid after heat sho ck.T he peripheral venous bloo d w as co llected under ant icoag ulatio n adopting art ificial hepar in,and the separated per ipher al blood mo no nuclear cells(PBM C)by adherent methods wer e induced into immature DC(imDC)by G M CSF and inter leukin IL 4in vitr o.DC tumo r v accine was prepared follow ing cell antig en loading,and then the DC tumo r vaccine s config ura tio n,quantity,and phenoty pe char acter w ere analyzed.RESULTS: Tumor cell antig en gaining rate was(9.89 2.46) 106per g ram tis sue and average apoptotic rate was(67.60 3.23)%.imDC s viability was mor e than95%.T he imDC phenotype char acter analy sis sho wed that the expressio n r ate of CD11c+HL A-DR+,CD11c+CD80+, CD11c+CD83+and CD11c+CD86+were(88.30 3 59)%,(1.25 0 55)%,(6.13 1.79)%,(72.90 5.01)%,respectively.DC vac cine's viability w as more than95%.T he DC phenotype character analy sis showed that the expression rates of CD11c+HLA-DR+,CD11c+ CD80+,CD11c+CD83+,and CD11c+CD86+were(89 60 3 91)%,(34.20 3.85)%,(64.90 8.05)%and(86.10 6 22)%,respectiv ely.T he CT Ls induced by autolog ous antig en loaded DC was significantly higher against autolo gous tumor cells (65.90 6 25)% than that against tumor cell lines (32.56 2 68)%,P< 0 01 .C ONC LUSIONS:T he method for autologous dendritic cells loaded by heat shocked apoptotic esophagus cancer cells is of stabiliza tion,security and credibility.T he mature DC tumor vaccines can be prepared fo r the potential clinical application.
Chin J Cance r Pr ev T r eat,2011,18(2):98-101
第一作者简介 孙振宇,男,江苏无锡人,硕士,主任医师,主要从事心胸外科疾病治疗的研究工作。
E mail:lucksun888@https://www.doczj.com/doc/9817267619.html,
通讯作者简介 李成万,男,江苏无锡人,主任医师,主要从事外科科研工作。
E mail:mol_7449@hotmail.co m
关键词 食管肿瘤/免疫学;癌症疫苗/免疫学;抗原,CD;树突细胞/免疫学
[KEYWOR DS] esophageal neoplasms/immuneolog ic;cancer vaccines/immuneolog ic;antigens,CD;dendriteic cells/immuneo logic 中图分类号 R735.1 文献标识码 A 文章编号 1673-5269(2011)02-0098-04
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,食管癌的治疗以手术为主,辅以放化疗;其术后复发及转移率较高,如何清除术后残存的肿瘤细胞,是提高患者生存率的重要研究方向。树突状细胞(dendritic cell, DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞,经抗原刺激后的DC将携带的抗原信息传递给静息型T淋巴细胞,激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答,特异性地杀灭肿瘤细胞[1 4]。研究者用DC疫苗治疗3例食管癌患者,发现1例患者病情进展,2例患者肿瘤减退;其中,第3例患者在第2次注射后,右锁骨上淋巴结的转移灶开始消退[5 6]。本研究将建立自体食管癌细胞抗原负载自体DC的实验方法,为食管癌DC疫苗的制备提供依据,为其临床应用提供基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
RPM I1640培养基购自JRH公司,人重组GM CSF与IL 4购自R&D公司,AB血清购自无锡市中心血站,淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司;FITC标记的小鼠抗人CD86、PerCP标记的小鼠抗人H LA DR、PE标记的小鼠抗人CD11c以及FIT C标记的小鼠抗人CD83单克隆抗体均购自BD 公司;内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司。流式细胞仪购自FACSCA LLBUR、BD公司。1.2 方法
1.2.1 食管癌组织单细胞悬液的制备 收集2009 03-2009 09我院心胸外科9例食管癌患者的肿瘤组织(男6例,女3例。年龄51~80岁,中位年龄64岁)。均在手术过程中,无菌采集新鲜食管癌肿瘤组织,称质量后,用含双抗的生理盐水洗涤3次,剔除结缔组织、脂肪及坏死组织,剪碎至1~2mm3大小,加入胶原酶,37 酶解30~50min,将消化后的细胞悬液过细胞筛(200目),收集单细胞悬液。
1.2.2 凋亡细胞抗原制备 凋亡细胞抗原制备参考文献[7]。用RPM I1640培养基调整细胞浓度至106mL-1,将细胞置于40 、5%CO2培养箱中3h,取出细胞培养瓶,加入白桦脂酸至终浓度为10 g/mL,将细胞培养瓶移至37 、5%CO2培养箱继续培养诱导细胞凋亡。收获凋亡细胞,加入无菌PBS洗涤4次,获得凋亡肿瘤细胞抗原。用台盼蓝染色法进行计数与活细胞鉴别。用FITC Annexin V和PI标记细胞,进行流式检测,计算细胞凋亡率,凋亡率以Annexin V(+)计算[8]。软琼脂克隆法检测细胞体外成瘤能力[9]。
1.2.3 抗原负载的DC制备 1)PBM C采集:采用人工肝素抗凝采集患者外周血100m L,置于冰上运输至实验室,2000r/m in,20 离心10min(离心半径12cm),获得血细胞,稀释2倍后,Ficoll分离法分离血细胞获取PBM C。2)树突状细胞诱导:用RP M I1640培养基重悬新鲜制备的PBMC后铺于6孔细胞培养板中,放置于37 、5%CO2培养箱中90min 后,洗去未贴壁细胞,于培养板内加入含100ng/mL GM CSF,50ng/mL IL 4的RPM I1640完全培养基,第3天进行换液,第5天收获未成熟DC(imDC),台盼蓝染色进行细胞计数,部分细胞作为抗原负载,部分用于细胞表型检测。3)抗原负载DC:用RPM I1640完全培养基重悬imDC,加入凋亡肿瘤细胞抗原(DC 细胞抗原=3 1),至37 、5%CO2培养箱共同培育48h,收获DC,台盼蓝染色进行细胞计数与表型检测。
4)流式检测表型:参照文献[10]方法进行流式检测,应用CellQuest软件进行分析。
1.2.4 淋巴细胞增殖反应 将自体食管癌抗原负载DC,未负载DC作为刺激细胞分别按1 104、5 103、2.5 103和1 103接种于96孔培养板,每孔加入1 105T淋巴细胞,终体积为200 L;以相应DC和T细胞作为对照。混合培养4d后,按文献[11]方法加入CCK 8溶液20 L,继续静置培养3h后,用酶标仪在450nm处测定吸光度A值,空白培养基孔作为对照,计算刺激增殖指数(SI)。
SI(%)=
各刺激组OD值-T细胞组OD值-DC组OD值
T细胞组OD值
100% 1.2.5 CT L杀伤试验 分别将负载抗原的DC、未负载抗原的DC及自体PBL按1 20的比例加入96孔板,终体积为200 L,培养7d,收获细胞作为效应细胞(CT L);分别将收获培养的食管癌细胞及1株食管癌细胞株T E 10(购自南京凯基生物技术有限公司)作为靶细胞,按1 104/孔接种于96孔板,按效应细胞(E) 靶细胞(T)=20 1的比例加入效应细胞2 105/孔,设置效应细胞、靶细胞和空白对照组,孵育48h后,按1.2.4方法测定A值,计算杀伤率。
杀伤率(%)=(1-
实验组O D值-效应细胞O D值
靶细胞OD值
) 100% 1.3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行t检验。检验水准 =0.05。
2 结果
2.1 食管癌细胞抗原制备
9例食管癌患者的自体肿瘤组织制备得到的单细胞数量平均为(26.80 5.14) 106,每克组织平均得率为(9.89 2.46) 106,细胞活率为(83.80 4 34)%;凋亡后,抗原得率为(78.80 4.01)%,凋亡率为(67.60 3.23)%,抗原体外成瘤试验均为阴性,内毒素检测均合格(表1)。
2.2 未成熟DC数量及表型分析
收集诱导5d的悬浮细胞,即为imDC,台盼蓝染色计数,9例患者的平均数量为(5.67 0.90) 106,细胞活率均>95%。流式细胞仪FACS分析显示,9例患者的im DC中,CD11c+H LA-DR+细胞为(88 30 3.59)%;CD11c+H LA-DR+细胞中,CD80+细胞为(1.25 0.55)%,CD83+细胞为(6.13
1 79)%,CD86+细胞为(72.90 5.01)%(表2)。
2.3 抗原负载的DC数量及表型分析
抗原负载imDC48h后收获细胞,即为DC疫苗,台盼蓝染色计数,9例患者的mDC平均数量为(4 50 0.73) 106,细胞活率>95%。流式细胞仪FACS分析显示,CD80+、CD83+和CD86+细胞比率较imDC有明显升高,呈现典型的成熟DC表型。9例患者的DC疫苗中,CD11c+H LA-DR+细胞为(89.60 3 91)%;CD11c+H LA-DR+细胞中,CD80+细胞占(34 20 3 85)%,CD83+细胞占(64.90 8 05)%,CD86+细胞占(86.10 6.22)%(表3)。
表1 9例食管癌患者肿瘤组织单细胞悬液制备结果
患者编号食管癌组织
质量(g)
单细胞数量
( 106)
单细胞得率
( 106g-1)细胞活率(%)
凋亡细胞抗原
得率(%)
凋亡率(%)软琼脂成瘤试验
001 2.321.39.2680.270.668.3无克隆002 3.131.210.0689.678.670.6无克隆003 2.528.511.4085.481.465.8无克隆004 3.421.0 6.1890.578.971.6无克隆005 3.134.611.1684.775.162.6无克隆006 2.025.212.6079.583.568.1无克隆007 3.721.8 5.8978.282.663.1无克隆008 2.632.612.5481.677.668.0无克隆009 2.524.99.9684.980.670.6无克隆
x- s 2.80 0.5526.80 5.149.89 2.4683.80 4.3478.80 4.0167.60 3.23-
表2 9例食管癌患者的imDC数量及表型结果
患者编号imDC数量( 106)CD11c+HLA-DR+(%)CD11c+CD80+(%)CD11c+CD83+(%)CD11c+CD86+(%) 001 6.491.2 1.268.671.6
002 5.985.6 1.869.176.2
003 5.784.3 2.347.282.2
004 6.987.60.89 4.665.6
005 4.692.70.86 4.168.1
006 5.189.8 1.48 5.975.3
007 4.689.10.96 4.774.6
008 5.082.40.81 5.374.2
009 6.892.00.78 5.769.0
x- s 5.67 0.9088.30 3.59 1.25 0.55 6.13 1.7972.90 5.01
表3 9例食管癌患者的DC数量及表型结果
患者编号mDC数量( 106)CD11c+HLA-DR+(%)CD11c+CD80+(%)CD11c+CD83+(%)CD11c+CD86+(%) 001 5.190.335.653.881.6
002 4.695.640.371.288.9
003 4.685.230.275.994.6
004 5.684.635.258.478.9
005 3.885.638.168.181.3
006 4.190.129.465.179.5
007 3.594.335.952.995.3
008 3.889.129.670.288.6
009 5.291.333.668.185.9
x- s 4.50 0.7389.60 3.9134.20 3.8564.90 8.0586.10 6.22
2.4 淋巴细胞增殖试验
制备获得的DC作为刺激细胞,在不同比例下刺激淋巴细胞,淋巴细胞显著增殖,P<0.05;自体抗原负载的DC与未负载抗原的DC均能显著刺激淋巴细胞的增殖,差异无统计学意义,P>0.05。当DC细胞与T细胞比例在1 20时,增殖比例最高,在1 100时刺激指数为2 27,表明较少的DC也能很好的刺激T细胞的增殖。
2.5 C TL杀伤试验
负载自体抗原的DC组诱导CT L杀伤自体肿瘤细胞的杀伤率为(65.90 6.25)%,明显高于杀伤食管癌肿瘤细胞株的杀伤率 (32.56 2.68)%,P< 0 01 ,而且高于未负载DC诱导的CT L的杀伤率 (26.90 3.63)% ,P<0.01;而两组对于食管癌细胞株的杀伤率分别为(32.56 2.68)%和(29.54 4 21)%,差异无统计学意义,P>0 05。表明负载自体抗原的DC诱导了特异性的CTL,杀伤肿瘤细胞。
3 讨论
DC启动特异性抗肿瘤细胞免疫应答大致可分为3个步骤:DC对肿瘤抗原的摄取、加工与递呈(肿瘤抗原肽与M H C 或M H C 类分子形成复合物);携带抗原信号(T细胞激活的第一信号)的DC迁移(m i g ratio n)至淋巴结并特异性地激活相应T淋巴细胞克隆(T细胞受体TCR对M H C 抗原肽复合物的识别);激活的T细胞识别相应肿瘤细胞并使之溶解。同时DC表达多种免疫协同刺激分子(CD40、CD80和CD83等)与T细胞表面相应配体结合提供第二信号,参与静息型T细胞(naive T)的激活。另外,DC的成熟状态和其诱导的免疫反应的类型和程度有密切关系。成熟DC启动免疫应答,而不成熟的DC参与免疫耐受[12]。在本研究中,通过对imDC及成熟DC (mDC)分别检测其CD80、CD86和CD83的表达,结果显示,未成熟DC低表达CD80和CD83;而成熟DC 高表达CD80和CD83,CD86表达也有明显的增加。
肿瘤抗原的抗原性与免疫原性是影响DC疫苗的重要参数,本研究通过采集手术患者的自体肿瘤组织,制备抗原携带了肿瘤细胞的全部抗原信息,3~5g肿瘤组织制备的抗原量即能满足DC疫苗的制备需要。
热休克可以使肿瘤细胞高表达热休克蛋白(heat shock proteins,H SP),DC表面表达多种HSP受体(如CD91、CD40、TLR2/4或LOX1),通过受体介导的内吞机制将能使DC高效地摄取HSP 多肽复合物抗原,用富含HSP的肿瘤细胞负载DC可提升DC负载的效率[7]。本研究采用先将肿瘤细胞处于热休克状态,诱导细胞高表达HSP,再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含HSP的凋亡细胞抗原。本研究采用人工采集患者外周血,Ficoll分离PBMC作为DC的来源,通过GM CSF和IL 4培养5d后,加入患者自体热休克凋亡肿瘤抗原负载DC,制备成携带肿瘤抗原信息的成熟DC,在体外能有效刺激T细胞的增殖,通过对比其对自体肿瘤细胞及细胞株的杀伤率,结果两者差异有统计学意义,表明能够诱导特异性CTL的产生;同时样本采集安全、简单,制备时间较短,降低污染风险,适合临床应用。
综上所述,本研究建立了一种稳定、安全以及可靠的从自体食管癌组织制备热休克凋亡细胞抗原的方法,并用此抗原负载自体DC制备成具有成熟DC表型的肿瘤疫苗的方法,为其临床的进一步应用打下了良好的基础;但仍需进行更大样本的制备,以稳定制备工艺;同时进行动物的体内试验,验证安全性及有效性,为临床真正运用到肿瘤患者提供可靠的依据。
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收稿日期:2010-09-17 修回日期:2010-11-24
(编辑:边莉)
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞的增殖、分化、癌变、衰老和凋亡 一、单项选择题： 1．下图为人体细胞的分裂、分化、衰老和凋亡过程的示意图，图中①—⑥为各个时期的细 胞，a —c 表示细胞所进行的生理过程。据图分析，下列叙述正确的是 A ．⑤与⑥的基因型相 同，蛋白质的种类也相同 B ．细胞的衰老与凋亡就会引起人体衰老与死亡 C ．若⑤⑥已失去分裂能力，则其细胞内遗传信息的流动方向为DNA →RNA →蛋白质 D ．与①相比，②的表面积与体积的比值增大，与外界环境进行物质交换的能力增强 2．下列关于观察减数分裂实验的叙述中，错误．． 的是 A ．可用蝗虫卵母细胞、蚕豆花粉母细胞的固定装片观察减数分裂 B ．用桃花的雄蕊比用桃花的雌蕊制成的装片中，容易观察到减数分裂现象 C ．能观察到减数分裂现象的装片中，可能观察到同源染色体联会现象 D ．用洋葱根尖制成装片，能观察同源染色体联会现象 3．动物和人体内具有分裂和分化能力的细胞称为干细胞。对下图的相关叙述中，错误的是 A ．a 过程表示干细胞能自我更新 B ．b 、c 过程表示干细胞具有分化能力 C ．a 、b 、c 过程中细胞的遗传信息表达情况不同 D ．b 过程形成的细胞直接组成器官，可供器官移植使用 4．为了观察减数分裂各时期的特点，实验材料选择恰当的是 ①蚕豆的雄蕊 ②桃花的雌蕊 ③蝗虫的精巢 ④小鼠的卵巢 A ．①② B ．③④ C ．①③ D ．②④ 5．下列关于植物组织培养的叙述中，错误．． 的是 A ．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B ．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C ．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D ．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 6．关于细胞生命历程的说法，错误．． 的是 A ．细胞分化由遗传物质控制 B ．细胞癌变过程中遗传物质发生改变 C ．细胞衰老过程中部分酶活性改变 D ．人在胚胎发育后期尾的消失是通过尾部细胞衰老死亡而实现的 二、多项选择题： 24．下列关于细胞衰老的说法正确的是 A ．生物体内绝大多数细胞都要经过未分化、分化、衰老和死亡这几个阶段 衰老、凋亡 a b b c c ① ② ③ ④ ⑤上皮细胞 ⑥骨骼肌细胞
实验目的： 1.了解凋亡细胞的形态学特征，加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。 2.了解并掌握细胞凋亡检测的方法和基本原理。 实验原理： 细胞凋亡时，出现一系列形态学变化，包括凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，染色质的DNA出现缺口甚至断裂，出现DNA碎片，并逐渐形成凋亡小体等，经相应的染色后可以在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察到这些变化。从而把凋亡的细胞和正常的细胞区分开来。
细胞凋亡是指细胞对环境的生理、病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。细胞凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境的一种死亡过程。 1．细胞凋亡与细胞程序性死亡： 细胞程序性死亡的概念是指一个多细胞生物体中某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体没有炎症反应，而且这种死亡对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，但是一般认为这两个概念可以交互使用，具有同等意义。2．细胞凋亡与坏死的区别： 虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分、有局部严重的炎症反应。坏死是一个被动的过程，其细胞及组织的变化与凋亡有明显的不同。
高中生物细胞凋亡的知识点(一) ［背景知识互动］ 1.人的自然寿命是多少岁？人的寿命的长短与什么有关？ 2.人体每天都有哪些细胞死亡？举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 ［典型例题探究］ 【例1】什么是细胞凋亡？ 解析：高等真核生物的大多数细胞，在丧失生理功能或严重受损时，激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化，其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案：细胞凋亡是指生物体生长发育过程中，由基因控制的，按照一定的程序发生的'细胞死亡，因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体，被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化，但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段，它们是：________、________、 ________。 解析：.细胞凋亡的过程的三个阶段为： 凋亡的起始：细胞皱缩，细胞连接消失，内质网膨胀，染色体固缩并沿着核膜分布，但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成：核膜破裂，染色体断裂为大小不等的片段，与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围，在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起，这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离，脱落至细胞间质，最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案：凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1
四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用 的比较研究 [ 08-05-16 15:17:00 ] 作者：马淼编辑：studa20 【摘要】目的比较新疆四种野生甘草活性成分对人乳腺癌细胞的增殖 抑制作用，以期筛选出药效最佳的甘草种类。方法采用MTT法检测不同样品对BCAP37细胞的增殖抑制作用，Hoechst33258荧光染色法检测各样品诱导BCAP37细胞凋亡的作用。结果4种甘草的活性成分对人乳腺癌BCAP37 细胞具有显著的增殖抑制与诱导凋亡的作用，且存在显著的种间与产地间差 异。结论抗癌药效最佳的甘草种类为阿拉尔甘草。 【关键词】甘草活性成分人乳腺癌BCAP 37细胞 Comparative Study on the Anti-proliferation and Apoptosis- inducing Effects of Active Components from Four Glycyrrhiza Species on Human Breast Cancer BCAP-37 Cell Abstract:ObjectiveTo select the optimal glycyrrhiza species for medicinal utilization by comparing the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of active components from four wild glycyrrhiza species in Xinjiang on human breast cancer BCAP37 cell. MethodsThe anti-proliferation effects of different samples on BCAP 37 cell were measured by MTT assay. The cell apoptotic rate was detected by Hoechst 33258 stain.ResultsActive components of four Glycyrrhiza species inhibited the proliferation of BCAP37 cells and induced apoptosis significantly. What's more, there were significant interspecific and spatial variations in the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects. ConclusionThe optimal Glycyrrhiza species for anticancer utilization is Glycyrrhiza alalensis L. Key words:Glycyrrhiza; Active Component; Human breast cancer BCAP37 Cell 甘草是我国十分重要的中药材，素有“十方九草”的美誉。近年来，随着对甘草开发利用的不断深入，甘草被广泛用于药品、食品、保健品、化妆品 等领域［1］，甘草的市场需求量剧增。我国是世界上甘草出口大国，其中 80％为野生甘草，仅有20％为栽培甘草。我国甘草储量锐减，由建国初期 200～250万吨下降到50～70万吨［2］。现存的野生甘草资源已无法满足日益 增长的市场需求，因此，人工栽培甘草势在必行，野生优质甘草品种的筛选显
伲福达----硝苯地平缓释片 欣康----单硝酸异山梨酯缓释片0号----复方利血平氨苯蝶啶片洛汀新----盐酸贝那普利 代文----缬沙坦胶囊 络活喜----苯磺酸氨氯地平片 安博诺---厄贝沙坦氢氯噻嗪片安博维----厄贝沙坦片 波依定----非洛地平缓释片 寿比山----吲达帕胺片 迪之雅----坎地沙坦酯片 倍博特----缬沙坦氨氯地平片 安内真----苯磺酸氨氯地平片 雅施达----培哚普利片 施慧达-苯磺酸左旋氨氯地平片博苏----富马酸比索洛尔 科素亚----氯沙坦钾片 蒙诺----福辛普利钠片 尼莫同----尼莫地平片 元治----贝尼地平片 达爽----盐酸咪达普利片 司乐平----拉西地平片 畅泰----普罗布考片 金络----卡维地洛片 麦利平----马来酸氨氯地平片 双克----氢氯噻嗪片 开富特----复方卡托普利片 纳催离----吲达帕胺缓释片 立普妥----阿托伐他汀钙片 本店有两种规格：10mg、20mg 可定----瑞舒伐他汀钙片 舒降之----辛伐他汀片 本店有两种规格：20mg、40mg 来适可----氟伐他汀钠胶囊PSS----藻酸双酯钠片 力平之----非诺贝特胶囊 阿乐----阿托伐他汀钙片 培达片----西洛他唑片 多烯康----多烯酸乙酯软胶囊 冠心舒片----肠多糖片 波立维----硫酸氢氯吡格雷片 保肾康----阿魏酸哌嗪片 脑复康----吡拉西坦片 能气朗----辅酶Q10片 克林澳-马来酸桂哌齐特注射液 思考林----胞磷胆碱钠胶囊 西比灵----盐酸氟桂利嗪胶囊 申维----艾地苯醌片 倍他乐克----美托洛尔 常用规格：25mg、50mg、47.5mg 可达龙----盐酸胺碘酮片 心得安----普萘洛尔片 心律平----普罗帕酮片 脑复新----盐酸吡硫醇片 敏使朗----甲磺酸倍他司汀片 脑清片----氨基比林咖啡因片 依克度软膏----鱼石脂软膏 怡开----胰激肽原酶肠溶片 佛迪----果糖二磷酸钠 西地兰----去乙酰毛花苷 达吉----复方消化酶胶囊 泌特----复方阿嗪米特肠溶片 怡瑞/普瑞博思----西沙必利片 瑞波特----雷贝拉唑钠肠溶片 兰悉多----兰索拉唑片 洛赛克----奥美拉唑镁肠溶片 耐信----埃索美拉唑镁肠溶片 丽珠得乐----枸橼酸铋钾颗粒 达喜----铝碳酸镁片 泮立苏----泮托拉唑肠溶胶囊 苏打----碳酸氢钠 施维舒----替普瑞酮胶囊 膜固思达----瑞巴派特片 黄连锁----盐酸小檗碱片 硫苦----硫酸镁 胃舒平----复方氢氧化铝片 艾迪莎----美沙拉嗪缓释颗粒剂 胃炎颗粒----庆大霉素普鲁卡因维 B12颗粒 尼为孚-马来酸曲美布汀分散片 谓安新----甘羟铝片 宝乐安----酪酸梭菌活菌散 妈咪爱----枯草杆菌二联活菌 思密达----蒙脱石散 爱西特----药用炭片 易蒙停----盐酸洛哌丁胺胶囊 泻痢停----颠茄磺苄啶片 吗丁啉----多潘立酮片 瑞琪----枸橼酸莫沙必利片 杜密克----乳果糖口服溶液 果导片----酚酞片 肠虫清----阿苯达唑片 胃复安----甲氧氯普胺片 654-2----消旋山莨菪碱片 泰洛平---盐酸吡格列酮胶囊 拜糖平----阿卡波糖片 万苏平----格列美脲片 美吡达----格列吡嗪片5mg 迪沙----格列吡嗪片2.5mg 孚来迪、诺和龙----瑞格列奈片 0.5mg、1mg、2mg 达美康----格列齐特片
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，
易栓症组合： 1) 蛋白C活性测定 2) 蛋白S活性测定 3) 抗凝血酶III活性测定 4) 纤溶酶原活性测定 5) 狼疮抗凝物检测（dRVVT试验） 6) 狼疮抗凝物检测（SCT试验） 样本要求：2.7ml蓝色帽抗凝管2管。 出报告时间：组合中除蛋白S外当天出结果，蛋白S两周后出结果。 结果解释： 1.蛋白C活性测定 蛋白C是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，通过灭活FVa和FVIIIa来调节凝血酶的产生。遗传性杂合子蛋白C缺陷是静脉血栓（VTE）形成的中等危险因素；而严重的纯合子蛋白C缺陷与致命的中枢神经系统事件、视网膜血栓形成事件和新生儿紫癜爆发有关。 获得性蛋白C缺陷比遗传性蛋白C缺陷常见，原因可分为以下3类： a) 合成减少：肝脏疾病、维生素K 缺乏、维生素K拮抗剂（华法令） b) 消耗增多：急性血栓形成、DIC、急性内科疾病、创伤 c) 血液稀释：出血后晶体液复苏、血浆置换后 2.蛋白S活性测定 蛋白S是不具有酶活性的辅因子，可以加速活化蛋白C（APC）水解FVa和FVIIIa。蛋白S主要在肝脏合成，需要维生素K存在才能合成有功能的蛋白S。大约60%的蛋白S 与补体调节蛋白 C4b结合不具有活性；另外游离存在的40%的非结合蛋白S才具有活性。蛋白S遗传性杂合子缺陷被认为是VTE的轻、中度危险因素；严重的遗传性蛋白S缺陷被报道与新生儿紫癜爆发有关。与蛋白C一样，获得性蛋白S缺陷比遗传性常见，减低原因可分为三类，与蛋白C相同（见上蛋白C减低的原因）。此外，蛋白S活性减低还可见于口服避孕药、激素替代治疗和怀孕的中后期（详见后附的孕期凝血系统的变化）。 3．抗凝血酶活性测定 抗凝血酶（AT）灭活Xa、凝血酶（FIIa）和其他丝氨酸蛋白酶。遗传性杂合缺陷是VTE的主要危险因素，纯合突变未见报道。获得性抗凝血酶缺陷见于肾病综合征（丢失大于合成），肝衰竭爆发、末期肝脏疾病和DIC。怀孕相关的AT变化很小。普通肝素输注可诱导AT缺陷，而低分子肝素治疗不会。L-天冬酰胺酶（用于治疗急性淋巴母细胞白血病）可以减少肝脏合成AT。 4．纤溶酶原活性测定 异常纤溶酶原血症与VTE有关。获得性纤溶酶原缺陷与溶栓治疗、菌血症和DIC有关。 5．狼疮抗凝物检测 狼疮抗凝物（LA）存在可延长各种磷脂依赖的凝固时间。磷脂在凝血瀑布激活中发挥关键作用，而LA本质上抗磷脂抗体，在与磷脂-蛋白复合物结合后，会干扰凝血瀑布激活而导致凝固时间延长。所以LA试验测定分筛查和确认两步： a) 磷脂依赖的凝固时间延长(筛查试验) b) 加入过量磷脂后，磷脂依赖的凝固时间缩短而被纠正（确认试验）
细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精
确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小
第10卷 第1期中 华 男 科 学 Vol.10 No.1 2004年1月 National Journal of Andrology Jan.2004 ?论著? survivin 蛋白在前列腺癌中的表达及其与 肿瘤细胞凋亡的关系 高吴阳1,胡传义1,易慕华2 (三峡大学仁和医院,1.泌尿外科,2.病理科,湖北宜昌443001) 摘要: 目的:探讨新的凋亡基因survivin 蛋白在前列腺癌(PCa )的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系。 方法:采用免疫组化SP 法和DNA 原位未端标记T UNE L 法分别测定42例PCa 组织及10正常前列腺(NP )组织中survivin 蛋白的表达和细胞凋亡。 结果:survivin 蛋白在PCa 中的阳性表达为80.59%,与病理分级、临床分期和淋巴结转移密切相关(P <0.05),而NP 中无阳性表达;PCa 组织及NP 组织中细胞凋亡指数(AI )分别为3.03±1.33、1.07±0.77,其差异有显著意义(P <0.05);survivin 蛋白的表达与细胞AI 呈负相关(r =-0.679,P <0.001)。 结论:survivin 蛋白的异常表达而引起的细胞凋亡抑制,在PCa 的发生、发展中起一定的作用;联合检测survivin 蛋白和AI ,有助于对肿瘤细胞的分化程度作出正确评价,以指导临床治疗及估计预后。关键词:survivin 蛋白;凋亡;前列腺癌;免疫组化 中图分类号:Q255;R737.25 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)0120012203 Expression of survivin Protein in Prostatic Carcinoma Tissues and Its Correlation with Apoptosis of Cancer Cells G ao Wuyang ,Hu Chuanyi ,Y i Muhua Department o f Urology (Gao WY ,Hu CY ),Department o f Pathology (Yi MH ),Rehe Hospital ,Three Gorges Univer sity ,Yichang ,Hubei 430031,China Correspondence to :Gao Wuyang Abstract : Objective :T o investigate the expression of survivin protein in the tissues of prostatic carcinoma and its correlation with apoptosis of cancer cells. Methods :Expression of survivin protein and apoptosis index (AI )were detected by immunohistochemical and terminal de 2oxynucleotidyl transterase 2mediated dUTP biotin nich end labeling (T UNE L )technique in the tissues of 42cases of prostatic carcinima (PCa )and 10cases of normal prostate (NP ). Results :Survivin prosteins were expressed in 34of the 42(80.59%)cases of PCa.The positive rate of survivin was strongly ass ociated with pathological grades ,clinical stages and lymphmetastasis in PCa (P <0.05).In contrast ,NP did not express survivin.Survivin protein expressioin was negatively correlated with AI in PCa (r =-0.679,P <0.001). Conclusions :Apop 2tosis inhibition by survivin may participate in the onset and progression of PCa ,and the detection of survivin protein and AI in PCa may help to evaluate the degree of cell diferentiation ,decide therapeutic strategies and estimate prognosis. Natl J Androl ,2004,10(1):12214K ey w ords :survivin protein ;apoptosis ;prostatic carcinoma ;immunohistochemistry 前列腺癌(prostatic carcinoma ,PCa )是男性泌尿生殖系肿瘤中最重要的一种,其病因和发病机制尚 ?21?收稿日期:2003207215;修回日期:2003210208 作者简介:高吴阳(19622),男,湖北宜昌市人,副主任医师,本科,从事泌尿男科学专业。通讯作者:高吴阳
细胞凋亡(Apoptosis) 是生物界广泛存在的一种现象,与其它的生命现象一样具有同等重要的生理学或病理学意义。尽管其最终结果也是导致细胞死亡,但其诱导因素、发生机制和过程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡(即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡) 。 细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。细胞坏死性死亡是被动的病理性死亡,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化,内质网扩张,核染色质不规则移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏,细胞膜破裂,胞浆外溢,这种死亡过程常常引起炎症反应。细胞凋亡则是在某些因素的诱导下,由细胞内在的有规律的机制引起的,是主动的生理性细胞自杀。其特征是细胞首先变圆,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化,核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,胞膜内陷将细胞自行分割为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体,后被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬。由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜破裂,没有细胞内容物外泄,故不引起炎症反应,在生理条件下,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的遗传信息,或由邻近细胞和其微环境提供的信号决定的,其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环境中活性物质、激素等。 这些刺激信号的增加或减少调节着细胞产生和凋亡,维系着机体细胞的有序状态 细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人细胞凋亡形态学检测方法。 细胞凋亡( apoptosis)的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。 目前对细胞凋亡的认识不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。 光学显微镜观察 凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞积缩小.胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。 检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微镜测量工具可作凋亡计数。 本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法.可用于凋亡现象的初步观察，作为分析指标之一。 视频时差显微技术（video time-lapse microscopy） 本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可检测培养基中凋亡细胞，但不能用于病理组织。 检测方法：收集2x105细胞/ml培养，置于多空培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔30秒作序列摄影，连续24小时。如同时进行荧光染色，可参荧光显微镜下观察和摄影。
药品商品名和通用名对照表 一：心脑血管用药 拜唐苹------阿卡波糖片 卡博平------阿卡波糖片 达美康------格列齐特片 迪沙------格列吡嗪片 赛乐特------盐酸帕罗西汀 波利维------硫酸氢氯吡格雷片泰嘉------硫酸氢氯吡格雷片优甲乐------左甲状腺素钠片 诺和龙------瑞格列奈片 美迪康------盐酸二甲双胍片 麦特美------盐酸二甲双胍缓释片优降糖------格列本脲片 拜新同------硝苯地平控释片 欣然------硝苯地平控释片 果味钾------枸橼酸钾颗粒 补达秀------氯化钾缓释片 司乐平------拉西地平片 欣可静------益气复脉胶囊 金纳多------银杏叶提取物片 美多芭------多巴丝肼片 伲利安------坎地沙坦酯胶囊 维尔雅------坎地沙坦酯片威力坦------马栗种子提取物 可定------瑞舒伐他汀钙片 敏使郎------甲磺酸倍他司汀片 络活喜------苯磺酸氨路地平片 弥可保------甲钴胺片 阿乐------阿托伐他汀钙片 立普妥-------阿托伐他汀钙片 科素亚------氯沙坦钾片 依苏------马来酸依那普利片 诺金平------替米沙坦片 特立康------替米沙坦片 元治------盐酸贝尼地平片 新脑力隆------二维三七桂利嗪胶囊波依定------非洛地平缓释片 恬尔心------盐酸地尔硫卓片 合心爽------盐酸地尔硫卓片 利旨平------非诺贝特胶囊 奥勃兰------长春胺缓释胶囊 北京0号------复方利血平氨苯蝶啶代文------缬沙坦胶囊 依姆多------单硝酸异山梨酯缓释片索尼特------单硝酸异山梨酯缓释片
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。
精品文档与其它的生命现象一样具有同等重要(Apoptosis) 是生物界广泛存在的一种现象,细胞凋亡但其诱导因素、发生机制和过的生理学或病理学意义。尽管其最终结果也是导致细胞死亡, ) 。(程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡细胞坏死性死 亡是被动的病理性死细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。核染色质不规则,,,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化内质网扩张亡过程常常引起炎症,这 种死亡,细胞膜破裂,胞浆外溢移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏是主动的生理由细胞内在的 有规律的机制引起的,反应。细胞凋亡则是在某些因素的诱导下,内质网扩胞浆浓缩,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,性细胞自杀。其特征是细胞首先变圆,胞膜内核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化,后被吞噬细胞或邻周细胞陷将细胞自行分割 为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体,故不没有细胞内容物外泄,所识别、吞噬。由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜破裂,,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的 遗传信息,引起炎症反应,在生理条件下其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环,或由邻近 细胞和其微环境提供的信号决定的境中活性物质、激素等。维系着机体细胞的有序状态这些刺激信号的增加或减少调节着细胞产生和凋亡, 根据死亡细胞在形态学、细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，细胞凋亡的检测 下面细胞凋亡的检测方法有很多，生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。人根据凋亡细胞固有的形态特征，细胞凋亡的形态学检测介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡形态学检测方法。的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般 ( apoptosis)细胞凋亡的形态学特征。但形态改变仍是确目前对细胞凋亡的认识不断得到深化， 检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，定细胞凋亡的最可靠的方法。光学显微镜观察染色的组织凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞以.切片中细胞积缩小分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。染色，在高倍物镜下观察凋亡细Giemsa检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或胞的形态改变，结合显微镜测量工具可作凋亡计数。常 缺乏较为特但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，本方法简便易行，可用于凋亡现象的初步观察，作为分析征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法. 指标之一。video time-lapse microscopy）视频时差显微技术（尤其是观察细胞表通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，本方法用于细胞培养，和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可检测培养基中凋亡细胞，但不能用于病理组织。培养，置于多空培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像细胞/ml检测方法：收集2x105如同小时。24秒作序列摄影，每隔装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，30连续时进行荧光染色，可参荧光显微镜下观察和摄影。. 精品文档电子显微镜观察核的碎裂和染色质浓缩成半月板或帽状附于核膜，凋亡细胞的典型形 态改变如胞质的固缩，本方在透射电镜下得到最佳体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。凋亡小体形成等，由于样品法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。范围局限，在凋亡数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。检查方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，乙醇逐级透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，醋酸枸橼酸电子重染色，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。脱水，CO2