技术·食品工程＞＞＞ C EREALS AN D OILS PROCESSING 酶法提取枸杞多糖工艺研究 梁敏1邹东恢1，2郭建华1，2 （1．齐齐哈尔大学2．黑龙江省普通高校齐齐哈尔大学农产品加工重点实验室） 【摘要】本文研究了酶法提取枸杞多糖的最佳工艺条件以及枸杞中多糖的分离方法。采用木瓜蛋白酶处理，对作用温度、加酶量、最适pH值、作用时间进行正交试验。确定了酶法提取枸 杞多糖的最佳工艺：加酶量0．3％，酶解反应的pH值为7．0，温度为45℃，反应时间为2h，提取 率可达14．9％。 【关键词】枸杞多糖；酶法提取；正交试验；工艺 中图分类号：TS255．7文献标识码：A文章编号：1673-7199(2010)03-0104-03 枸杞子为茄科植物枸杞的成熟果实，是我国传统的滋补中药材。《本草纲目》中记载枸杞子具有坚筋骨、补精气诸不足、明目安神、令人长寿等功效。目前人们对枸杞子多糖进行了较广泛的研究，发现枸杞多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗疲劳、护肝、防辐射、抗缺氧等功效，且无任何毒副作用，因此枸杞多糖的分离纯化及其药理作用研究已成为一个热点课题。近年来生物酶广泛应用于各个领域，在国内也开始将其应用于药物提取中，枸杞多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，提高了多糖的纯度，对枸杞多糖的研究开发具有现实意义。 1试验方法与工艺过程 1．1试验原料 从市场中购得新鲜枸杞，清洗干净，去除杂质，之后适当切块放入真空干燥箱干燥，待枸杞恒重，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的枸杞粉依次通过40、60、80、100目的筛，过筛之后把各级枸杞粉分别装到清洁干燥的烧杯中，置于真空干燥箱中待用。 1．2试验试剂与仪器 木瓜蛋白酶，北京世纪时尚科贸有限公司；Sephadex G－75，Pharmacia；苯酚，天津市科密欧化学试剂开发中心；葡萄糖、活性炭，天津市凯通化学试剂有限公司；使用试剂均为分析纯。真空干燥箱，上海益恒试验仪器有限公司；电热恒温水浴锅、离心机、透析袋、THZ－82A台式恒温振荡器，上海跃进医疗器械厂；HL－2S恒流泵，上海青浦沪仪器厂；九阳料理机，山东九阳小家电有限公司；SHZ－D（III）循环水式真空泵、722紫外分光光度计、PB－10pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；BSZ－100自动部分收集器，上海沪西仪器厂；Lambda－35紫外可见分光光度计，美国PE公司。 1．3试验方法与步骤 称取80目的枸杞粉3g，放入到250mL的三角瓶中，然后加蒸馏水35mL混合均匀后置于40℃水浴锅中，水浴30min，调节pH值，加入一定比例木瓜蛋白酶混合，加入5mL蒸馏水溶解，枸杞溶液放在水浴中预热至酶解温度，将酶液加入到枸杞溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，将三角瓶放到沸水锅中，10min沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至5000r／min离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液。 1．4葡萄糖标准曲线的制定 以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制标准曲线，获得线性回归方程。直线方程为：Y＝ 104
食品分离技术作业 姓名_______________ 院系_______________ 专业班级_______________ 学号_______________ 时间___年___月___日
摘要 本文简要地介绍了植物多糖提取的两种方法：溶液提取法和部分沉淀法，对于影响多糖提取的不同因子选取不同方法；从多个方面介绍了多糖提取后的分离、纯化方法，及其分离纯化原理和主要步骤，并在最后对分离方法的可行性做出评价。 关键词：植物多糖分离纯化溶剂提取法部分沉淀法 植物多糖的分离纯化 一、多糖的物化性质 A.分子结构：多糖在溶液状态下有着高级结构，代表活性状态。不同植物提取的多糖， 一级结构上有很太差异，采用酸解、色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等手段，可以确定单糖的组成及取代基团。 B.溶解性：难溶于冷水，在热水或碱液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁酵、乙醚、醋 酸乙酯等有机溶剂 C.热稳定性：热不稳定，当温度大于4O℃时，分解加快。 D.酸碱稳定性：pH小于5时开始降解，小于3时有20％降解；大于7时氧化加快。 E.化学性质：与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应阳性，常用于定量分析；可与部分有机、无机 离子络合，如与十六烷基三溴化铵(CTAB)、氢氧化钡等结合沉淀 F. 二、植物多糖的提取 多糖不同的植物中，有着不同的含量和贮存位置，因此针对不同的植物有着不同的分离方法。 图1:不同植物中多糖的提取方法
A.溶剂提取法 a)水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 图2：加水比对多糖提取的影响[1] b)酸碱提法[2] 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。 图3：热碱提取多糖结果[3] c)生物酶提取法[4] 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 B.部分沉淀法 a)金属盐沉淀法
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
多糖的分离纯化及生理作用 多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。 多糖的提取和纯化 1. 多糖的提取 1.1 热水浸提法：其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）,干燥后可得粉末状的粗多糖。 1.2 微波辅助提取法： 其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。 1.3 超声辅助法： 其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。 1.4 索氏提取法： 将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。 1.5 醇提法： 先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。 醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。 2.多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种： 2.1 分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为
目录 摘要 (1) 英文摘要 (2) 1 引言 (3) 2 材料与方法 (4) 2.1 实验材料与仪器设备 (4) 2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制与曲线的绘制 (4) 2.2.2 枸杞多糖溶液的提取方法 (5) 2.2.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量 (6) 3 实验结果与分析 (6) 3.1 单因素选择试验 (6) 3.2提取率与浸提温度之间的关系 (6) 3.3 提取率与料水比之间的关系 (7) 3.4 提取率与浸提时间之间的关系 (8) 3.5 正交试验优化工艺条件 (9) 4 结论 (10) 参考文献 (11) 致谢 (12)
枸杞子多糖提取工艺的探索 化学化工学院应用化学专业 摘要：利用正交分析法对枸杞多糖的提取工艺进行优化。以枸杞为主要原料，先采用单因素试验法分别对影响枸杞多糖提取率的主要因素进行分析研究，最后再利用正交试验法优化选取一个最佳的工艺条件。试验结果表明，枸杞多糖的热水浸提法最佳工艺条件为浸提温度90℃，料水比1:20，浸提时间2h。 关键词:枸杞多糖;水浸提取;单因素试验；正交试验
Exploration of Lycium Barbarum Polysaccharides Extraction Technology College of Chemistry and Chemical Engineering Applied Chemistry Specialty Chen Fei (20907031003)Director: Xu Han (Lecture) Abstract: To optizime the extraction technology of lycium barbarum polysaccharides by orthogonal methodoloy. The main factors were studied effecting the extraction of lycium barbarum polysaccharides by single factor experiments. And then, the optimum extraction conditions of lycium barbarum polysaccharides was studied by orthogonal experiment. The optimized conditions for the extraction of polysaccharides was obtained as follows: extraction temperature 90℃, material to water1∶35(W∶V) , extraction time 2 h. Keywords:lycium barbarum polysaccharides; flooding extraction; single factor experiments; orthogonal experiment
多糖分离纯化的基本原则和方法 多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂志易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类： 第一类难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。 第三类粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取
第25卷 第3期 2008年6月 黑龙江大学自然科学学报JOURNAL OF NAT URAL SC I E NCE OF HE I L ONGJ I A NG UN I V ERSI TY Vol 125No 13 June,2008 枸杞多糖分离纯化及性质研究 张 晶1,2, 韩喜江1, 李艳波2 (1.哈尔滨工业大学化学系,哈尔滨150001;2.哈尔滨学院生化学院,哈尔滨150080) 摘 要:对东北枸杞中提取的多糖,通过DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱和Sephadex G -100 凝胶色谱柱进行了分离纯化,通过凝胶色谱和液相色谱对其纯度进行了鉴定,并通过红外光谱初步分析了其基团构成。 关键词:枸杞多糖;分离纯化;纯度鉴定 中图分类号:R28412,TS244文献标志码:A 文章编号:1001-7011(2008)03-0377-04 收稿日期:2008-01-16 作者简介:张 晶(1973-),女,实验师,硕士,主要研究方向:应用化学、食品化学 0 引 言 枸杞是一种食药两用植物,具有多种药理作用和生理功能。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一,其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目,已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰 老、抗疲劳、降血压、降血糖、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用[1-2]。鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理 功能,因此,对其提取分离方法及纯化的研究显得尤为重要[3]。本文重点对牡丹江地区枸杞多糖的分离纯 化及组成结构作了初步探讨。 1 实验材料和方法 111 材料与仪器 牡丹江地区枸杞子;其它试剂均为分析纯。自动部分收集器,台式干燥箱,紫外分光光度计,Perkin -El 2mer 红外光谱仪,Aglilent 1100液相色谱仪等。 112 枸杞多糖提取 称取100g 枸杞子60℃烘干,放置干燥器18h 后粉碎,称取10g 干燥的枸杞粉,用氯仿-甲醇(2∶1)300mL,用索氏回流装置于60℃回流脱脂。残渣风干后,加入适量水,在100℃,料水比1∶15条件下水浴提取4h,抽滤,将滤液蒸发浓缩为原体积的1/4后,将浓缩液滴入3倍体积的95%乙醇中,静置,抽滤,固形物 分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤,水浴加热干燥得枸杞粗多糖[4]。 113 枸杞多糖分离纯化 11311 DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱层析 将分离提取的枸杞粗多糖110g 溶于水,上DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱,梯度洗脱法洗脱各级分,洗 脱液分别为蒸馏水、011mo1?L -1,0125mol ?L -1和015mol ?L -1NaCl,011mol ?L -1Na OH 各100mL,流 速为30滴每分钟,自动部分收集器收集洗脱液,将收集到的样品溶液分别在280nm 波长下比色,然后用硫 酸一蒽酮法测定总糖含量。以试管数目为横坐标,以吸光度为纵坐标作DE AE -cellul ose (OH -)色谱柱洗脱 曲线图。分别合并各主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥,得LBP -1,LBP -2,LBP -3和LBP -4.11312 Sephadex G -100凝胶色谱柱。 收集多糖含量最多的组分,进行凝胶色谱分离。流速为013mL ?m in -1,每支试管接收3mL 洗脱液,硫 酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况。以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作流出曲线,合并主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥。
第一章综述 1前言 1.1枸杞 1.1.1枸杞的自然属性 枸杞(Lycium barbarum)别名苟起子、甜菜子、地骨子等，是茄科植物枸杞(Lycium chinense Miller)的成熟果实。是我国重要的药用植物资源，是我国受原产地保护的药食两用的药材和传统出口创汇产品。早在2000多年前，人们已经开始了对枸杞的利用。《诗经》记载“陟彼北山，言采其杞”。宋?苏轼《小圃?五咏》赞枸杞曰“根茎与花实，收拾无弃物”。《本草纲目》中记：“久服杞子，坚筋骨，轻身不老，耐寒暑”。《本草汇言》记“枸杞能使气可充，血可补，阳可生，阴可长，火可降，风湿可去，有十全之妙焉”。《保寿堂方》载“春枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。根据《郭案驼种树书》记载，大约在1200多年前，我国就开始栽种枸杞了。此外，《神农本草经》、《食疗本草》、《本草纲目》和《本草备要》等古书中都有关于枸杞的记载。 枸杞具有滋补肝肾,益精明目的作用。作为我国常用中药，枸杞被广泛应用于临床，主治肝肾阴亏，头晕目眩，腰膝酸软，消渴遗精，目昏多泪，虚劳咳嗽。枸杞子又作为“药食同源”的植物性平补保健食品，被广泛用于泡酒、泡茶、泡水、煲汤、煮粥等。大量研究表明枸杞中含有多种可被利用的生物活性成分，其中最具有提取利用价值的是枸杞多糖，其次是枸杞色素和枸杞籽油。 枸杞的生长状况 枸杞属约有80个种，多数分布在南、北美洲。以美国的亚利桑娜州和阿根廷形成两个分布中心，南美洲种类最多。欧亚大陆约有10个种。约在17世纪中叶引到法国，后来在欧洲，地中海国家，韩国以及北美洲国家都有栽种。我国有7个种和3个变种，多数分布在西北和华北。目前我国人工栽培的构祀有宁夏枸杞及北方枸杞。枸杞原产我国北方，河北、内蒙古、山西、陕西、甘肃、宁夏、新疆和青海等省都有野生，而中心分布区域在甘肃河西走廊、青海柴达木盆地以及青海至山西的黄河沿岸地带。常生于土层深厚的沟岸、山坡、田埂和宅旁。据统计我国枸杞种植区面积已经由1996年的45万亩迅速增加到100万亩，年产量达3000万公斤以上，其中新疆、宁夏、内蒙古、河北等省地区的枸杞种植面积和产量居全国前列。有500多年栽培历史的宁夏，所产枸杞以粒大、皮薄、肉厚、营养丰富、药用价值高而享誉国内外，远销港澳、东南亚、西欧及北美等地区和国家。2001年，宁夏省枸杞种植面积达25万亩，占全国枸杞种植面积的17%，年产量达115.5万公斤，全区枸杞干果产量和出口量分别占全
一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与
酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 1．5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。另外，超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。超声提取的影响因素有：超声时间、超声频率（一般低频中提取效率高，但也有例外）、料液比和温度等。 1．6 微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力强、选择性高、加
枸杞多糖的提取工艺研究 [摘要]枸杞为茄科植物枸杞的干燥成熟果实，主产于河北与宁夏，是一种食药两用植物，味甘、性平、入甘、肾经，具有多种药理作用和生物功能。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一。其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目，已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰老、增强造血功能、防止遗传损伤、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用。鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理功能，引起了人们的广泛关注。本试验研究超声辅助提取法在枸杞多糖提取中的应用，采用正交实验的方法筛选出提取枸杞多糖的最佳提取条件。当加水量为20倍，提取时间为40min，提取温度为80℃，超声功率为250W 时枸杞多糖得率最高，可达到3.06%。 [关键词]枸杞多糖；超声辅助提取；正交实验 多糖（Polysaccharide）又称多聚糖，由是由十个以上的单糖基通过普键连接而成的一类结构复杂的大分子化合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖可以水解，最终水解得到单糖。枸杞多糖是枸杞的有效成分之一，经研究发现，枸杞多糖既是保健功能因子，又是一种非特异性免疫增强剂，具有调节免疫功能、降血糖、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增加造血功能、防止遗传损伤等作用。 本实验采用正交试验方法研究超声辅助提取法在枸杞多糖提取中的应用，并筛选出提取的最佳工艺条件。 1 实验材料与仪器 2实验步骤与方法 2.1 多糖含量标准曲线的绘制：采用H2SO4苯酚法对其加以改良。精密称取无水葡萄糖标准品25.0mg，置于25ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配成1mg/ml的储备液，分别精密吸取储备0、0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml，置25ml 容量瓶中，加5%苯酚溶液1.0ml，摇匀，用移液管迅速垂直滴加浓硫酸各5.0ml，再用蒸馏水稀释至刻度，沸水浴中煮沸15min；冷却后用分光光度计在490nm波长处测定其吸光度值；以试样糖含量C（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。 2.2 枸杞多糖得率计算：多糖得率=枸杞粗多糖质量（g）÷枸杞原料质量（g）×100% （公式2-1） 2.3 超声辅助提取枸杞多糖 2.3.1 枸杞多糖提取工艺流程：枸杞→粉碎→石油醚回流脱脂（水浴温度60℃）→过滤→滤渣风干→样品称重（预处理样）→超声波法提取→抽滤→粗
多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化 摘要本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。 关键词多糖；提取；纯化；活性炭 多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。 (2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。 另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。 1. 多糖的提取[12] 1.1 热水浸提法： 1.1.1多糖提取条件的优选 根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。 1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M 氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法
枸杞多糖的提取与鉴定 1242818杨立君实验原理 强酸可以使糖类脱水生成糠醛。生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。颜色的深浅可以作为定量的标准。这一方法具有很高的灵敏度，糖含量在30μg左右就能进行测定，所以可以作为微量测糖之用。 一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适]1[。 实验试剂 1.标准葡萄糖试剂：将葡萄糖105℃烘干至恒重（2h），准确称取50mg,无离子水定容至500mL,终浓度为0.1mg/mL. 2.蒽酮-浓硫酸试剂：称取0.1997g蒽酮，溶于100mL浓硫酸，现用现配。 3.葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖]3[],2[ 4.硫代硫酸钠溶液，活性炭，正丁醇，无水乙醇，丙酮。三氯甲烷，甲苯胺乙醇溶液 实验器材 分光光度计，超速离心机，电炉，烧杯，试管，干燥器，滤纸，层析缸以及其他相关玻璃仪器 实验流程 (一) 提取 枸杞干果粉碎，氯仿- 甲醇（2∶1）回流脱脂8~10 h 近无色，挥干溶剂以后将脱脂后的枸杞样品放入烧杯中，分3次加15、12、10 倍量的蒸馏水于90 ℃水浴提取，每次2 h；收集3 次的滤液减压浓缩至约200 mL，转移到大烧杯中，加4 倍量的95%乙醇，沉淀12 h 后抽滤，并依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚 洗涤，干燥后便得到枸杞多糖的粗制品。]4[ （二）纯化 多糖粗品加水溶解，4 000 r/min 离心10 min 后取上清液，加30%双氧水适量，40 ℃保温4～6 h 后，加三氯甲烷-正丁醇（4∶1，Sevag 法）溶液沉淀蛋白，取上清液；此步骤反复多次，直到无白色絮状沉淀出现。将除去蛋白的多糖溶液浓缩后，转移到分子排阻为8 000～10 000 Da 的透析袋中，流水透析24 h 后，蒸馏水透析过夜，溶液颜色变淡，浓缩后 真空干燥得枸杞多糖精制品。]4[ (三) 理化性质分析 将枸杞多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中，观察其溶解性。另在浓硫酸存在下观察枸杞多糖与α-萘酚的作用，于界面处观察颜色变化。 （四）蒽酮比色法测定含量
多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘’。 1.2。2分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2· Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;
不同工艺的枸杞多糖提取率比较及其体外抗氧化性研究 枸杞多糖是一种优质的水溶性植物多糖，提取自宁夏枸杞的果实。现代药理研究已表明，枸杞多糖能够改善老年人易疲劳、食欲不振、视力模糊等症状，同时还是枸杞子中调节人体免疫、延缓衰老的主要活性成分。 枸杞多糖作为西安源森生物公司的主打产品，已被广泛应用于食品饮料以及保健品领域。为向客户提供更高品质的产品，日前，西安源森生物实验室就枸杞多糖的不同提取工艺进行对比研究，并对枸杞多糖体外抗氧化性进行了测定。 实验概述: 1. 西安源森生物实验室分别用三种提取方法：浸泡提取法、超声波提取法和微波提取法提取枸杞多糖；然后采用硫酸- 苯酚法对多糖含量进行定性定量分析，得出不同提取方法所得的枸杞多糖含量及提取率； 2. 根据枸杞粗多糖对自由基的清除率以及对超氧阴离子的清除作用的测定，比较同浓度条件下的VC 与枸杞多糖对抗氧化活性。枸杞多糖体外抗氧化性结论。 一、三种提取方法提取枸杞多糖的提取率研究 （一）实验材料与试剂 1. 材料 宁夏枸杞西安源森生物实验室自产地直接采购； 2. 试剂 （1）5% 苯酚； （2）8mmol/L HCl；25mmol/L 邻苯三酚溶液； （3）0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)；10%三氯乙酸； （4）邻苯三酚(焦性没食子酸，分析纯)； （5）三羟基甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯)； （6）1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl, DPPH)。 （二）仪器与设备 （1）索氏提取装置，HH-S 数显恒温水浴锅； （2）YHW-102 型远红外干燥箱； （3）KQ3200 型超声波清洗仪； （4）WFJ-7200 型可见光分光光度计； （5）LDZ5-2 低速自动平衡离心机； （6）WP700 型微波炉； （7）TU-1900 双光束紫外可见分光光度计； （8）DL-1 万用电炉规格(单联电压220V，功率：LX/KW)； （9）ZDHW 型调温电热套(规格250ml，功率150W)； （10）JA2003 型电子天平。 （三）实验步骤 1.枸杞预处理 将宁夏枸杞放于60℃恒温箱中恒温干燥24h→称量→剪碎→回流脱脂（回流两次，每次3 h）→弃去溶剂，残渣风干，残渣即为经过预处理的枸杞。 2. 利用三种方法进行枸杞多糖的提取 （1）浸泡法提枸杞多糖 用电子天平称取等量经预处理后的枸杞，浸泡3h，然后用90℃的水浴提取1.5h，用脱脂棉过滤，重复提取3 次，弃去残渣，合并滤液，浓缩，离心(3000r/min，30min)，弃去残
生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖大类. 多糖地提取首先要根据多糖地存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理. 动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚地混合液进行回流脱脂，释放多糖. 植物多糖提取时需注意一些含脂较高地根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性地有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖地提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等. ．溶剂法 ．．水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用地一种方法. 多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强地溶剂. 用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到左右，利用多糖不溶于乙醇地性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置，多糖地质量分数和得率均较高. 影响多糖提取率地因素有：水地用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等. 文档收集自网络，仅用于个人学习 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取地提取方法.但由于水地极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性地成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续地分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．酸提法 为了提高多糖地提取率，在水提醇沉法地基础上发展了酸提取法. 如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团地多糖在较低值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出.文档收集自网络，仅用于个人学习 由于＋地存在抑制了酸性杂质地溶出，稀酸提取法提取得到地多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键地断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用. 因此酸提法也存在一定地不足之处.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖地浸出，可提高多糖地收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓地碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品地风味和色泽.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来地一种新地提取分离技术. 超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时地状态，这种流体兼有液体和气体地特点，密度大，粘稠度小，有极高地溶解，渗透到提取材料地基质中，发挥非常有效地萃取功能. 而且这种溶解能力随着压力地升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分地活性和无溶剂残留等优点. 由于地超临界条件（＝．℃，＝．）容易达到，常用于超临界萃取地溶剂，在压力为～时地超临界足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物.文档收集自网络，仅用于个人学习 该法地缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限. ．酶解法 ．．单一酶解法 单一酶解法指地是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率地生物技术. 其中经常使 用地酶有蛋白酶、纤维素酶等. 蛋白酶对植物细胞中游离地蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离地蛋白质水解，降低它们对原料地结合力，
1.2.2 离子交换层析鹿茸多糖初级分离纯化采用DEAE－52 离子交换柱。称取鹿茸多糖80mg，溶于10mL 蒸馏水中，4000r /min 离心10min，取上清液样，依次用蒸馏水，0.3、0.5、0.7、1mol /L NaCl 溶液梯度洗脱，流速控制为0.5mL /min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测多糖含量，绘制洗脱曲线，合并同一吸收峰的洗脱液，蒸馏水透析24h，减压浓缩，冷冻干燥，即得DEAE－52 纯化多糖。 1.2.3 凝胶排阻层析鹿茸多糖进一步分离纯化采用Sepharose CL－6B 凝胶排阻层析柱。将经DEAE－52 分离后的多糖溶于蒸馏水，浓度为10mg /mL，以2mL /次上样，蒸馏水洗脱，流速控制为30mL /h，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，收集、合并相同洗脱组分，透析，冷冻干燥即得SepharoseCL－6B纯化多糖。 1.2.4 鹿茸多糖紫外扫描将Sepharose CL－6B 纯化后精制多糖配 成一定浓度溶液，190～400nm 下进行紫外光谱扫描，以蒸馏水作空白。 2.2.4粗多糖的分离纯化 2.2.4.1粗多糖的离子柱层析 取水提粗多糖样品和碱提水溶性多糖样品溶于蒸馏水中,配制成20mg/mL的溶液,4000印m离心10min,取上清液用DEAE一SepharoseFastFlow离子柱层析(2.6-40cm)进行初步分离,上样量为25mL"首先以蒸馏水洗脱,再用0.1,0.2,0.4,0.6,2mol几的NaCI进行梯度洗脱,自动部分收集仪分步收集流分,洗脱液每10mL收集一管,苯酚硫酸法检测,根据糖显色反应结果合并相同流分"