申报项目类别（打√）：
指令性项目
指导性项目
计划类别：指令性项目指南代码： 101
宿迁市科技计划项目申报书
(工业、农业、社发)
项目名称： FISH检测技术在小圆细胞肿瘤临床病理诊断中
的应用
承担单位：宿迁市第一人民医院病理科
所在地区：宿迁市
单位地址：宿迁市宿支路120号邮编： 223800
项目负责人：王前玉贡其星电话:138******** 135******** 主管部门：
申报日期： 2015 年 11 月 15 日
宿迁市科学技术局
二〇一五年制
一、立项依据
1、本项目国内外、省内外科技创新发展概况和最新发展趋势；
小圆细胞肿瘤指一组组织形态学相似、生物学行为不同、治疗方法各异的不同肿瘤实体，包括低分化癌、淋巴造血系统肿瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、尤文肉瘤、部分亚型的滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、圆细胞脂肪肉瘤、间叶性软骨肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤等软组织肿瘤。由于肿瘤细胞形态变化差异小，部分肿瘤发病罕见，易致认识不足，误入诊断陷阱，影响或延误患者的正确治疗，故而小圆细胞肿瘤的诊断及鉴别诊断向来是临床病理诊断工作中的重点和难点。而且，在肿瘤进入个体化治疗的今天，穿刺活检标本增多，放化疗后病理形态学改变等等，这些都大大的增加了诊断的难度。所以，对于组织学形态不典型或组织学变异、免疫组化结果出乎预料、临床特征罕见的病例，仅凭肿瘤的组织形态学，和/或免疫表型来诊断远远不够，迫切需要分子病理学在识别肿瘤基因型上的支持和帮助。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术, 是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪观察荧光信号，来确定特异探针杂交的方式（扩增、断裂或者融合），从而评估目标基因在结构和数目上的异常，并与组织形态学相结合，加深对肿瘤表型及基因型的认识。目前FISH 作为一种稳定、可靠的分子病理学检测技术，已广泛应用于乳腺癌、胃癌、肺癌的目标基因检测，帮助评估患者预后、选择最佳临床治疗方案，在一些已知的含有特征性染色体易位的淋巴瘤及软组织肿瘤的病理诊断中也有重要的辅助诊断价值。
目前，FISH技术在小圆细胞肿瘤诊断和鉴别诊断中应用的国内报道并不多见，一方面，小圆细胞肿瘤种类繁多，需扎实的认识基础和广阔的诊断思路，而在我国基层医院，甚至缺少对于肿瘤分子遗传学的认识；另一方面，国内商业化探针品种的局限，也导致部分研究工作的搁浅。但FISH 检测技术作为最简便实用的分子遗传学检测手段，在小圆细胞肿瘤病理诊断和鉴别诊断中有巨大的潜能和广泛的前景，例如，BCL2、CCND1、MALT1、C-MYC分离探针在小B细胞淋巴瘤（如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤）中的鉴别诊断价值；BCL2、BCL6、C-MYC、P53探针对于弥漫大B细胞淋巴瘤的分子分型及预后意义及价值；EWSR1分离探针辅助诊断形态学变异的尤文肉瘤（如大细胞变异型、硬化型、造釉细胞瘤样型），鉴别诊断恶性黑色素瘤与软组织透明细胞肉瘤（两者形态学相似、免疫表型相同，但治疗方案却不同）；SYT、DDIT3、FOXO1分离
探针辅助诊断低分化滑膜肉瘤、圆细胞脂肪肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤；还有PAX3/FKHR及PAX7/FKHR的双色融合探针可帮助判断腺泡状横纹肌肉瘤的基因亚型，推测患者预后，选择最佳治疗方案，等等。针对小圆细胞肿瘤广泛开展FISH检测，还有助于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，甚至可发现新病种，如伴有CIC-DUX4融合基因未分化小圆细胞肉瘤的发现，以及缺乏ETV6-NTRK3融合基因有别于先天性纤维肉瘤的婴幼儿原始黏液性间叶肿瘤的发现等。
2、本项目研究的目的、意义（突出说明对科技、经济和社会发展的作用）；
本项目研究目的是确定不同FISH探针在不同小圆细胞肿瘤中的辅助诊断和预后价值，从而指导临床的具体治疗和评估患者预后，对小圆细胞肿瘤的诊断与鉴别诊断具有较大的推动作用。
（1）提高对小圆细胞肿瘤的组织形态学（包括变异型）、免疫表型、分子遗传学认识，增加诊断的准确性；
（2）为穿刺标本提供客观可信的辅助检查结果，尤其在穿刺标本容易出现细胞形态皱缩、免疫表达不理想时，增加诊断的客观性；
（3）深入认识肿瘤表型和基因型的特征，帮助判断病患预后，选择合理治疗方案；
（4）有益于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，并可能发现新病种；
（5）对于发生相同或相似染色体易位的肿瘤进行深入分析，有助于探讨疾病发生机制。
3、本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况；
随着肿瘤病理学的不断发展，肿瘤的认识及分类已经基于遗传学水平，因此，辅助的基因检测成为肿瘤分类、预后以及治疗的关键环节，国外的临床病理研究中对于FISH在淋巴瘤及软组织中的应用研究已经相当成熟，并认为FISH技术对一些肿瘤的诊断和鉴别诊断具有实际的临床指导意义。但是我市目前尚无统一的FISH检测平台，也没有进行相关的小圆细胞肿瘤FISH的研究，属于空白。开展FISH检测，还有助于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，甚至可发现新病种，提高对某些疾病的认识。
4、本项目研究国内外、省内外竞争情况及产业化前景。
FISH检测对肿瘤的诊断是一个强大的工具，目前国内较大规模的临床中心都配有FISH检测平台，通过FISH检测平台，可以验证肿瘤的遗传学规律，也已发现新的基因突变位点，对于肿瘤的辅助诊断具有非常大的支持
作用，该技术操作简便，实用性极强。
而在我国基层医院，甚至缺少对于肿瘤分子遗传学的认识；另一方面，国内商业化探针品种的局限，也导致部分研究工作的搁浅，通过该项目的研究有可能发现新的融合性基因类型，并且摸索探针设计、制作的经验，以便广泛用于临床诊断中。
二、研究内容
1、具体研究开发内容和重点解决的关键技术问题；
研究的主要内容：
（1）筛选不同的小圆细胞肿瘤，纳入研究组；
（2）重新HE检查以及相关免疫组化，提高对小圆细胞肿瘤的组织形态学（包括变异型）、免疫表型、分子遗传学认识，拓展诊断思路，增加诊断的准确性；
（3）探讨相关的小圆细胞肿瘤与FISH探针表达的敏感性与特异性，为FISH阳性或阴性结果的准确解读积累宝贵经验；
（4）收集临床病理资料（如年龄、部位、肿瘤大小、转移以及预后信息），并分析这些资料与不同FISH检测探针异常的相关性以及预后分析，结合预后及遗传学表达特点，深入认识肿瘤表型和基因型的特征，帮助判断病患预后，选择合理治疗方案；
（5）初步探讨相关软组织肿瘤的发生、发展及转归的作用机制，有益于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，并可能发现新病种。
关键技术问题：
（1）筛选合适的小圆细胞肿瘤；
（2）FISH探针的设计及制作。
2、项目的特色和创新之处；
常用的分子遗传学的方法有核型分析、Southern blotting、PCR、比较基因组杂交（CGH）及FISH等技术。FISH分析是一种简单、敏感性高、特异性强的方法，可用于检测肿瘤样本中间期细胞核内染色体和基因数量及结构的异常，能同时对大量的细胞分析其染色体异常、细胞表型和组织形态，此特点是其它分子生物学技术如常规的细胞核型分析和流式细胞仪分析所不可及的。FISH最大的优点是可应用于常规福尔马林固定、石蜡包埋组织切片，能回顾性地检测和分析不同疾病组织的染色体的变化，而且即使仅有少量细胞的标本时，也可以有效检测出。
本研究将在江苏省人民医院病理科全程指导下具体实施，先期借助江
苏省人民医院的分子平台进行实验的操作，后续将建立宿迁地区的FISH 检测平台。
本研究的内容和思路不同于以往的其他研究，主要应用FISH方法研究不同类型小圆细胞肿瘤的基因突变状态，并收集相关的临床病理资料以及患者的随访信息，探讨FISH表达异常与小圆细胞肿瘤临床病理特征、预后等关系，结合预后及遗传学表达特点，深入认识肿瘤表型和基因型的特征，帮助判断病患预后，选择合理治疗方案。并初步探讨相关软组织肿瘤的发生、发展及转归的作用机制，有益于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，并可能发现新病种。
目前，系统性的进行小圆细胞肿瘤的FISH检测研究在国内尚属首次。本研究顺利完成，将为我国小圆细胞肿瘤的生物学研究以及发生机制开辟新的途径，预期某些研究可能还会影响肿瘤新分类与再认识，并可能发现新病种，同时也将为小圆细胞肿瘤的临床治疗探索一种有效的途径。
3、要达到的主要技术、经济指标及社会、经济效益。
（1）构建宿迁地区FISH检测平台，FISH检测平台建立后，可以进行小圆细胞肿瘤基因的检测，提高宿迁地区小圆细胞肿瘤的诊断认识水平，同时指导患者的进一步治疗，FISH检测平台的建立，还可以进行乳腺癌、胃癌、肺癌等靶向治疗药物的筛选工作。
（2）可以增加诊断的客观性，深入认识肿瘤表型和基因型的特征，帮助判断病患预后，选择合理治疗方案。
（3）探讨相关小圆细胞肿瘤的发生、发展及转归的作用机制，有益于发现新的染色体易位及其所产生的融合性基因，并可能发现新病种。
综上，本课题能够有效的提高宿迁地区的小圆细胞肿瘤的病理诊断水平，FISH平台的建立可以服务更多的肿瘤患者，具有非常大的社会、经济效益。
三、研究试验方法、技术路线以及工艺流程
本研究的试验方法：本研究主要采取回顾性研究及前瞻性研究。
1、病例收集；
（1）回顾性研究江苏省人民医院病理科自建科以来明确诊断的小圆细胞肿瘤，所有病例均有完整的临床病理资料，包括患者的年龄、肿瘤的最大径、肿瘤发病部位、区域淋巴结转移、术后有无再复发以及随访信息
等。参照WHO《软组织及骨肿瘤病理学和遗传学》、《造血与淋巴组织肿瘤病理学和遗传学》重新复习切片，筛选符合条件的小圆细胞肿瘤并进行相应FISH检测（表1）。
（2）宿迁市第一人民医院病理科标本采用前瞻性研究方案，入组资料条件同上述前瞻性研究资料，计划收集自建科之后的3年小圆细胞肿瘤标本，并集中时间进行FISH检测。
表1.入组小圆细胞肿瘤及对应探针
疾病名称FISH探针（主要构成）
低分化滑膜肉瘤SYT
尤文肉瘤/PNET、促结缔组织增生性小圆细胞肿
EWSR1
瘤、透明细胞肉瘤、小细胞型血管瘤样纤维组织
细胞瘤等
圆细胞脂肪肉瘤DDIT3
腺泡状横纹肌肉瘤FOXO1、PAX3/FKHR及PAX7/FKHR 横纹肌样瘤、近端型上皮样肉瘤等INI1
ALK
间变性大细胞淋巴瘤、ALK阳性的大B细胞淋巴
瘤、上皮样炎性肌纤维母细胞肉瘤
小B细胞淋巴瘤BCL2/CCND1/MALT1/C-MYC分离探针弥漫大B细胞淋巴瘤BCL2/BCL6/C-MYC/P53探针
2、石蜡切片及HE染色
所有存档蜡块5μm切片，HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
3、免疫组织化学标记
主要用于鉴别诊断，采用Envision法。
4、FISH检测
（1）FISH检测平台：本项目实验将全部在江苏省人民医院病理科分子实验室FISH检测平台实施。
（2）基本原理：FISH是基于DNA双链互补的特性，将荧光素标记的DNA 片段（探针）特异性杂交于靶核酸序列（染色体或基因）上，然后通过荧光显微镜内合适的滤光片下观察结合到细胞核内靶目标上的耀眼荧光信号，以此检测某一特定靶核酸序列变化，从而判定其结构和数目异常的一种技术（如图1），目前应用在临床病理中的探针多数已经商品化。
图1.FISH 检测原理图
（3）FISH 白片：所有入组病理在HE 及免疫组化诊断明确后，需要预
留FISH 白片要求：3-5um 涂胶片5张，60℃烤箱过夜。
（4）FISH 探针的类型和结果判读参考《间期荧光原位杂交技术及其
临床病理应用》（中华病理学杂志，2011（40）：130-134），具体使
用探针的类型详见表1.
5、数据统计与处理，采用SPSS 统计软件。
技术路线：
四、工作基础和条件
1、承担单位概况（人员、资产、业务与管理状况），拥有知识产权状况（包括本项目已有知识产权状况）；
宿迁市第一人民医院是按照三级甲等综合性医院标准规划建设，集医疗、教学、科研、公益“四位一体”的高等级公立医院。医院位于宿迁市市府新区，北依京杭大运河绿化风光带，南临古黄河生态公园，占地面积330亩，设计床位2000张，建筑面积约26.5万平方米。医院现有职工总数881人，其中卫生技术人员780人。
作为江苏省人民医院宿迁分院，江苏省人民医院从学科、人才、技术、服务、管理、品牌等方面对宿迁市第一人民医院进行全方位的管理和支持。医院专业设置齐全，拥有38个临床科室，健康管理中心、医学影像中心、内镜中心、临床检验中心、病理诊断中心等5个区域性公共平台。医院医疗设备配置齐全，设备总额2.4亿元，其中有高端CT、3.0T磁共振、大平板多功能DSA、大孔径模拟CT机、产科四维彩超、数字胃肠等大型影像设备。
医院图书馆藏书丰富，设有中文期刊阅览室、外文期刊阅览室、电子阅览室等，年征订中外文期刊500多种。有中国知网、维普、万方三种中文电子全文期刊文献检索库和外文全文推送文献服务数据库。近年来，我院承担国家自然科学基金1项，宿迁市科技计划项目4项，专利5项，发表SCI论文10余篇。
病理科为江苏省人民医院病理科长期援建单位，本部病理科将为其提供全程技术支持。江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）病理科建于1962年,是国家重点专科，江苏省病理质量控制中心，卫生部病理远程会诊试点省级中心。病理科分子实验室于2014年底通过临检中心质量体系认证。
江苏省人民医院病理科为南京医科大学临床病理硕士、博士学位授权点。现在编人数为46人，其中高级职称12人，中级职称13人，初级职称21人。近几年来，每年完成常规外科病理外检6万余例，细胞学检查4万余例，免疫组化8千余例，快速冰冻诊断7千余例，分子病理检查2千余例,病理会诊8千余例，尸体解剖30余例。近几年来，病理科培养博士、硕士生30余人，培养省内外进修医师100余人。科室设有亚专科及专业组：包括软组织病理、淋巴瘤病理、乳腺病理、消化病理、泌尿病理、分子病理等等都属于优势项目。科室检查项目齐全：能够开展200多种的免疫组化检查，以及FISH，PCR等分子病理检测，其中分子检测多次通过PQCC
室间质控，2014年底PCR及FISH实验室完成江苏省临检中心质量体系评审。
2、本项目现有的研究工作基础（包括与本项目研究有关的主要论文、专著情况，小试或中试成果情况，现有装备条件等）;
（1）本项目的FISH检测平台位于江苏省人民医院病理科分子实验室，该平台于2011年正式投入使用，能够进行乳腺、胃癌、肺癌、淋巴瘤以及软组织等相关基因的FISH检测，年FISH检测量2000余例，人员操作
具有丰富的临床实践经验，多次通过PQCC室间质控，2014年底PCR及FISH 实验室完成江苏省临检中心质量体系评审，具有独立的质量控制体系。
（2）目前发表有关的FISH检测论文包括：
1）贡其星，范钦和，张智弘. 涉及EWSR1基因易位的软组织肿瘤 [J]. 中华病理学杂志,2015(44):140-145
2）李霄，刘冲，宋国新，贡其星等. 荧光原位杂交检测EWSR1基因易位在尤因肉瘤家族肿瘤疑难病例诊断中的应用[J]. 临床与实验病理学杂志,2015(03):302-306
3）Lu TX, Gong QX, Wang L, et al. Immunohistochemical algorithm alone is not enough for predicting the outcome of patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP. Int J Clin Exp Pathol. 2015 Jan 1;8(1):275-86.
4）Gong QX, Wang Z, Li X, et al. Primitive myxoid mesenchymal tumor of infancy: report of two cases and review of the literature. Pathol Int. 2012 Aug;62(8):549-53.
3、项目负责人以往承担国家、省级和市级等各类科技计划项目完成情况（立项年度、项目编号、项目名称、计划类别、完成时间、完成效果）；
无
4、项目实施具备的人才队伍、经费配套投入能力及科技服务管理能力；
5、本项目实施可能对环境的影响及预防治理方案。
本课题的进行不会造成对环境的污染，并充分利用现有综合资源包括：江苏省人民医院病理科分子实验室、仪器设备、已积累的组织标本和病例资料，已经进行的与课题有关的预实验基础等。
可能的技术风险是荧光素及核酸的生物污染，将严格遵守江苏省人民医院病理科分子实验室FISH检测的操作规程进行操作。
五、项目研究预期成果及效益（重点是能提交的具有自主知识产权的创新性成果、高新技术产品、新样机、新设备、新品种、计算机软件、技术标准，以及在成果转化中可能产生的效益等）
1、培养FISH检测实验员，进行相关理论指导与培训；
2、探讨小圆细胞肿瘤中基因表达的规律，撰写论文。
3、将科研结果转化为临床实践工作，用于临床病理的辅助诊断，服
务患者。
六、计划进度安排与考核指标
七、承担单位承诺意见、盖章
承担单位参加单位
（法人签字）（法人签字）
盖章盖章
年月日年月日
八、科技主管部门、财政主管部门意见、盖章
是否同意配套支持：是 配套支持经费：万元
否
单位盖章单位盖章
年月日年月日