桑葚中花青素的提取与检测 桑椹所含花青素色价高、抗氧化能力强，是一种理想的营养强化剂和着色剂[1]。桑椹最大加工品为桑椹汁。为了去除生长过程和收获环节原料沾带的杂质及微生物，桑椹汁加工前需对原料进行有效清洗。花青素易极溶于水，更易溶于乙醇等亲水有机溶剂，因此，桑椹清洗水呈浓重的紫黑色，表明桑椹果实中的一部分花青素已溶于清洗水。在以往的研究中发现，盐酸、柠檬酸等溶液对花青素具有一定的保护作用[2]。由于桑椹汁加工中原料需经历灭酶、浓缩、杀菌等诸多强热处理以及冗长的加工过程，产品中的花青素损失、劣化严重。如能在热处理以前的清洗过程提取分离出部分花青素，既避免了有效成分的破坏，又可获得高品质的副产品，使桑椹资源合理、充分地利用。为此，依据桑椹汁加工流程，设想在不影响主产品产量和品质的前提下，通过选择对桑椹花青素溶出效率高的浸提介质和对原料整体性破坏较小清洗方法，在桑椹汁加工前分离出部分高品质花青素。 1 实验材料、流程及检测方法 1.1 实验材料 桑椹为北京大兴区产，品种为黑珍珠。采集完熟果实并剔除烂果及杂质，低温贮藏。 1.2 实验试剂和主要仪器 无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、柠檬酸钠购于北京化学试剂公司；AB-8 大孔树脂购于南开大学化工厂；ZFQ85A 旋转蒸发器，上海医械专机厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；JA1003N 电子天平，上海精密科学仪器有限公司；GZX-9023MBE 数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；PHS-25 型酸度计，上海精密科学仪器有限公司紫外—可见分光光度计，北京普析仪器有限公司。高效液相色谱，安捷伦科技有限公司 1.3 实验流程 依据主要产品为桑椹浓缩汁的加工流程，在清洗水中提取桑椹花青素的试验工艺流程确定为：桑椹果实——强化清洗——洗水精滤——上柱吸附——解吸——浓缩脱溶——干燥——花青素粗提物为了保持桑椹鲜果的完整性，避免因破损造成的糖和酸的溶出损失，增加花青素浸提量，提高浸提液中花青素含量，降低果胶等胶体物质进入，清洗过程将采用对原料损伤较轻的模拟移动床逆流淋浸原理，以阶段浸泡、逆流阶段浸泡、逆流淋洗为浸提单元组合浸提流程。 并尝试使用蒸馏水及对花青素具有良好溶出和保护效果，且对主产品生产无明显不利影响的柠檬酸和乙醇溶液为浸提介质。在吸附分离工序将比较、优选分离花青素常用的AB-8、D101、NKA、X-5 中的优者为吸附介质[3]。 1.4 实验方法 清洗介质：5%柠檬酸溶液、5%乙醇溶液、蒸馏水。 清洗方法：以1:1 料水比循环喷淋5min、浸泡2min、逆流淋浸（3 级以上，2min/级）。 精滤介质：0.45μm 微滤膜。 吸附介质：大孔树脂AB-8、D101、NKA、X-5。 吸附解吸参数：上样流量2BV/h，0.1%HCL 的80%乙醇洗脱[4]。 色价的测定[5]：用分光光度计测定10g/L 色素溶液在最大吸收波长处的吸光值后，依据郎伯—比尔定律计算色价。桑椹色素的色价E1cm1%（λmax）为：E1cm1%（λmax）=色
Design-Expert 软件在响应面优化法中的应用 （王世磊郑州大学450001） 摘要：本文简要介绍了响应面优化法，以及数据处理软件Design-ExpertDesign-Expert的相关知识，最后结合实例，介绍该软件在响应面优化法上的应用实例。 关键词：数据处理，响应面优化法，Design-Expert软件 1.响应面优化法简介 响应面优化法,即响应曲面法( Response Surface Methodology ，RSM)，这是一种实验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。它囊括了试验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值[1]。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。 响应面优化法，考虑了试验随机误差；同时，响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法[2]。 响应面优化法，将实验得出的数据结果，进行响应面分析，得到的预测模型，一般是个曲面，即所获得的预测模型是连续的。与正交实验相比，其优势是：在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。 当然，响应面优化法自然有其局限性。响应面优化的前提是：设计的实验点应包括最佳的实验条件，如果实验点的选取不当，使用响应面优化法师不能得到很好的优化结果的。因而，在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素与水平。 结合文献报道，一般实验因素与水平的选取，可以采用多种实验设计的方法，常采用的是下面几个： 1.使用已有文献报道的结果，确定响应面优化法实验的各因素与水平。 2.使用单因素实验[3]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 3.使用爬坡实验[4]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 4.使用两水平因子设计实验[5]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 在确立了实验的因素与水平之后，下一步即是实验设计。可以进行响应面分析的实验设计有多种，但最常用的是下面两种：Central Composite Design-响应面优化分析、Box-Behnken Design-响应面优化分析。 Central Composite Design，简称CCD，即中心组合设计，有时也成为星点设计。其设计表是在两水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，通常实验表是以代码的形式编排的,实验时再转化为实际操作值（,一般水平取值为0,±1,±α,其中0为中值,α为极值, α=F*（1/ 4）； F 为析因设计部分实验次数, F = 2k或F = 2 k×（1/ 2 ），其中 k为因素数，F = 2 k×（1/ 2 一般 5 因素以上采用，设计表有下面三个部分组成[6]：(1) 2k或 2 k×（1/ 2 ）析因设计。(2)极值点。由于两水平析因设计只能用作线性考察,需再加上第二部分极值点,才适合于非线性拟合。如果以坐标表示,极值点在相应坐标轴上的位置称为轴点(axial point) 或星点( star point) ,表示为(±α,0,…, 0) , (0,±α,…, 0) ,…, (0, 0,…,±α)星点的组数与因素数相同。(3)一定数量的中心点重复试验。中心点的个数与CCD设计的特殊性质如正交
实验报告课程名称：发酵工艺及其优化实验名称：响应面优化实验专业：生物工程 学号： 060512212 姓名：韦达理 实验地点：笃行楼303 实验日期：2015年5月16日常熟理工学院
[实验目的和要求] 1. 了解响应面优化实验的原理。 2. 熟悉design expert软件的基本操作。 3. 熟悉响应面优化实验的具体流程。 4. 优化香菇多糖发酵培养基 [实验器材] Design expert软件 [实验原理和方法] 香菇多糖：是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较低。而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此已得到广泛应用于重视。 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法（又称回归设计）。 响应面曲线法的使用条件有：①确信或怀疑因素对指标存在非线性影响；②因素个数2-7个，一般不超过4个；③所有因素均为计量值数据；试验区域已接近最优区域；④基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为：①确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据；②创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计；③确定试验运行顺序(Display Design)；④进行试验并收集数据；⑤分析试验数据；⑥优化因素的设置水平。 响应面优化法的优点：①考虑了试验随机误差②响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法③与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。
食品科学研究中实验设计的案例分析 —响应面法优化超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究 摘要：选择对ACE 抑制率有显著影响的四个因素：超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4)，进行四因素三水平的响应面分析试验，经过Design-Expert优化得到最优条件为超声波处理时间28.42min、超声波功率190.04W、超声波水浴温度55.05℃、酶解时间2.24h，在此条件下燕麦ACE 抑制肽的抑制率87.36%。与参考文献SAS软件处理的结果中比较差异很小。 关键字：Design-Expert 响应面分析 1.比较分析 表一响应面试验设计 因素 水平 -1 0 1 超声波处理时间X1(min) 20 30 40 超声波功率X2(W) 132 176 220 超声波水浴温度X3(℃) 50 55 60 酶解时间X4(h) 2.Design-Expert响应面分析 分析试验设计包括：方差分析、拟合二次回归方程、残差图等数据点分布图、二次项的等高线和响应面图。优化四个因素（超声波处理时间、超声波功率、超声波水浴温度、酶解时间）使响应值最大，最终得到最大响应值和相应四个因素的值。 利用Design-Expert软件可以与文献SAS软件比较，结果可以得到最优，通过上述步骤分析可以判断分析结果的可靠性。 2.1 数据的输入
2.2 Box-Behnken响应面试验设计与结果 2.3 选择模型
2.4 方差分析 在本例中，模型显著性检验p<0.05，表明该模型具有统计学意义。由图4知其自变量一次项A，
B，D，二次项AC,A2,B2,C2,D2显著(p<0.05)。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本例P值为0.0861>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。 图 5 由图5可知：校正决定系数R2(adj)(0.9788>0.80)和变异系数（CV）为0.51%，说明该模型只有2.12%的变异，能由该模型解释。进一步说明模型拟合优度较好,可用来对超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究进行初步分析和预测。
桑椹酒渣中花青素提取 1材料与方法 1.1材料 桑椹果酒酒渣。 1.2试剂药品 试验所用95%乙醇、浓盐酸、30%过氧化氢、Na2SO3等试剂均为分析纯。 1.3主要仪器 电子分析天平、分光光度计、旋转蒸发仪、酸度计、高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅等。 1.4方法（稀HCl+95%乙醇提取） 样品称量，用提取剂提取，过滤（减压过滤/板框过滤），所得的提取液按一定比例稀释（pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀）释后在分光光度计上测出OD值，以OD值代表桑椹红色素的含量。 1.4.1不同溶剂的吸光光谱及提取效果比较 分别以75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比1：10提取桑椹色素，提取液经3倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。 1.4.2不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂）。 1.4.3温度对提取效果的影响 以最佳结果作为桑椹提取剂，分别于60、50、40、30、20℃下提取1h。 1.4.4提取时间对提取效果的影响 每隔20分钟取样测得OD值。 1.4.5正交实验 1.4.6得率试验 称取一定量样品，经提取后。提取液经旋转蒸发仪蒸发，真空干燥，求得率。 方法一稀HCl+95%乙醇提取 1不同溶剂的吸光光谱及提取效果比较 固定浸提温度、提取时间、液料比，分别85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）为提取剂进行浸提试验，色 素提取液分别采用pH1.0氯化钾缓冲液和pH4.5醋酸钠缓冲液稀释一定倍数(吸光值在0.2~0.8之间)，将稀释液静置15min，分别测定两种样品稀释液ODλmax和700nm处的吸光值A。按公式计算桑椹花色苷含量，分析提取溶剂对花色苷提取量的影响。 注：ODλmax的确定分别以85%乙醇、95%乙醇、0.05%稀HCl+95%乙醇（1：1）、0.10%稀HCl +95%乙醇（1：1）、0.15%稀HCl +95%乙醇（1：1）作为提取剂，以物料与提取剂之比1：10提取桑椹色素，提取液经3倍稀释后用分光光度计测定各提取液吸收光谱。 2不同物料与提取剂之比对花青素提取的影响（此时用提取效果最好的提取剂）。 分别称取2.0g酒渣，按液料比5、10、15、20、25、30加入相应体积的浸提溶剂，在40℃下避光提取2h后，抽滤、离心(3000rpm，10min)。取1mL清液，用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释(吸光值在0.2～0.8之间)，分别测定两种样品稀释液在ODλmax和700nm处的吸光值A，按公式计算花色苷含量，并对液料比作图，分析液料比对色素提取量的影响。
食品科学研究中实验设计的案例分析 ——响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸 班级：学号：姓名： 摘要：本文简要介绍了响应面曲线优化法的基本原理和使用步骤，并通过软件Design-Expert 软件演示原文中响应面曲线优化法的操作步骤。验证原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》各个数据的处理过程，通过数据对比，检验原文数据处理的正确与否。 关键词：响应面优化法数据处理 Design-Expert 车前草 前言： 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法（又称回归设计）。 响应面曲线法的使用条件有：①确信或怀疑因素对指标存在非线性影响；②因素个数2-7个，一般不超过4个；③所有因素均为计量值数据；试验区域已接近最优区域； ④基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为：①确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据；②创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计；③确定试验运行顺序(Display Design)；④进行试验并收集数据；⑤分析试验数据；⑥优化因素的设置水平。 响应面优化法的优点：①考虑了试验随机误差②响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法③与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。 响应面优化法的局限性: 在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素和水平。因为响应面优化法的前提是设计的试验点应包括最佳的实验条件，如果试验点的选取不当，实验响应面优化法就不能得到很好的优化结果。 原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》采用经典的三因素三水平Box-Behnken 试验设计，以熊果酸的提取率为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，并由此预测最佳的工艺条件。本文利用软件验证原文中的数据处理过程，以检验原文数据是否处理正确。 1 确定实验因素 原文利用超声波辅助提取车前草中的熊果酸，而影响熊果酸提取率的因素有很多，如超声波的功率、提取时间、溶剂温度、溶剂种类、液固比等。原文参考文献《柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离, 纯化研究》中提取熊果酸的方法提取熊果酸，即将干燥的车前草粉碎后过筛，取20～40 目的车前粉，用石油醚在 55℃脱脂 3 次，干燥备用。精密称取一定量的车前粉，加入一定量的乙醇，称量，在一定的超声波功率下提取一定时间后，擦干外壁，再称量，用乙醇补充缺失的质量，离心。用注射器抽取一定量上清液，过μm 滤膜，进行检测。每个实验进行 3 次平行实验。取其平均值。结果以提取率(E)的来表示。
紫甘蓝中花青素的提取研究 【摘要】蓝花青素具有很强的抗氧化作用，具有清除体内自由基、过敏、保护 胃粘膜等多种功能，引起了国内外学者广泛关注。目前抗变异、抗肿瘤、抗，对花青素的研究主要集中于花青素的提取、分离纯化、热稳定性、抗氧化性及其生理功能等方面。本文主要研究了紫甘蓝花青素的提取工艺;用大孔树脂初步纯化紫甘蓝花青素;对紫甘蓝花青素纯度鉴定。采用“溶剂提取、萃取、树脂纯化、薄层色谱”相结合的方案对紫甘蓝花青素进行了分离纯化。 【关键词】紫甘蓝花青素提取分离纯化 1.1引言 花青素作为可使用色素之一，具有多种生物学作用，将广泛用于食品加工、医药保健品、化妆品行业。虽然国内外己开展了一些研究，主要集中在花青素粗品的提取方法的研究方面，而对紫甘蓝花青素的组成及分子结构鉴定、生物学活性、药理作用的研究还很少，还需要大量数据为其进一步开发和利用提供理论依据。 2.1材料与方法 2.1.1实验材料 新鲜紫甘蓝 2.1.2实验方法 溶剂提取、萃取、树脂纯化、薄层色谱 2.2主要仪器、试剂 分析天平、外分光光度计、环水式多用真空泵、心机、旋转蒸发仪、恒温水浴锅、无水乙醇、甲醇、孔树脂、浓盐酸。 2.3实验方法 2.3.1紫甘蓝色素的提取 取新鲜80G的紫甘蓝叶片于大杯中加入一定的浸提剂，吸取一定体积的浸提液于 1 Oml比色管中，用浸提剂稀释至刻度，用浸提剂做空白，测定其对520nm光的吸光度。采用溶剂提取法。称取紫甘蓝80g，用500ml的60%乙醇和1%盐酸混合液进行捣碎浸提8层纱布过滤，4℃条件下静置3h，离心测OD 值。 2.3.2紫甘蓝色素的初步纯化 大孔树脂预处理的方法:将待处理的大孔树脂装入柱中，用95%乙醇浸泡24h一用95%乙醇2}4BV冲洗一用去离子水洗至无醇味一5%氢氧化钠溶液2}4BV冲洗树脂柱一水洗至中性一10%乙酸2}4BV冲洗通过树脂柱一水洗至中性，备用。滤液用5倍的纯水稀释，大孔吸附树脂法分离，往吸附柱中先用15%乙醇除杂，再用60%乙醇洗脱收集洗脱液；用四分之一的盐酸在90℃条件
试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型作图． 建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法．对于非线性体系可作适当处理化为线性形式．设有m个因素影响指标取值，通过次量测试验，得到n组试验数据．假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第次试验中第个因素的水平值；为建立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差．应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵B如下将B阵代入原假设的回归方程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图． 模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面．下面简要讨论二因素响应面分析的大致过程． 在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过n次量测试验（试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的3倍），以最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为X坐标和y坐标，以相应的由上式计算的响应为Z坐标作出三维空间的曲面（这就是2因素响应曲面）．应当指出，上述求出的模型只是最小二乘解，不一定与实际体系相符，也即，计算值与试验值之间的差异不一定符合要求．因此，求出系数的最小二乘估计后，应进行检验．一个简单实用的方法就是以响应的计算值与试验值之间的相关系数是否接近于1或观察其相关图是否所有的点都基本接近直线进行判别．如果以表示响应试验值，为计算值，则两者的相关系数R定义为其中对于二因素以上的试验，要在三维以上的抽象空间才能表示，一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或二维空间中加以描述．等等………… 2注意事项 对于构造高阶响应面，主要有以下两个问题： 1，抽样数量将显著增加，此外，普通的实验设计也将更糟。 2，高阶响应面容易产生振动。 响应面法(response surface methodology，记为RSM)最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的。就是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面。其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数。响应面方法是一项统计学的综合试验技术，用于处理几个变量对一个体系或结构的作用问题，也就是体系或结构的输入(变量值)与输出(响应)的转换关系问题。现用两个变量来说明:结构响应Z与变量x1,x2具有未知的、不能明确表达的函数关系Z=g(x1,x2)。要得到“真实”的函数通常需要大量的模拟，而响应面法则是用有限的试验来回归拟合一个关系Z= g’(x1,x2)，并以此来代替真实曲面Z=g(x1,x2)，将功能函数表示成基本随机变量的显示函数，应用于可靠度分析中。响应面方法实际上源于一种试验设计方法，试验设计方法是用来研究设计参数对模型设计状况影响的一种取样策略，决定了构造近似模型所需样本点的个数和这些点的空间分布情况。目前广泛应用于计算机仿真试验设计的主要方法是拉丁超立方体抽样和均匀设计，这两种试验设计能应用于多种多样的模型，且对模型的变化具有稳健性。 3响应面分析
响应面优化实验 实验报告 课程名称,发酵工艺及其优化 实验名称, 响应面优化实验 专业, 生物工程 学号, 060512212 姓名, 韦达理 实验地点, 笃行楼303 实验日期,2015年5月16日 常熟理工学院 [实验目的和要求] 1. 了解响应面优化实验的原理。 2. 熟悉design expert软件的基本操作。 3. 熟悉响应面优化实验的具体流程。 4. 优化香菇多糖发酵培养基 [实验器材] Design expert软件 [实验原理和方法] 香菇多糖:是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 提取方法:从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较低。而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与子
实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此已得到广泛应用于重视。 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法(又称回归设计)。响应面曲线法的使用条件有:?确信或怀疑因素对指标存在非线性影响;?因素个数2-7个，一般不超过4个;?所有因素均为计量值数据;试验区域已接近最优区域;?基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为:?确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据;?创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计;?确定试验运行顺序(Display Design);?进行试验并收集数据;?分析试验数据;?优化因素的设置水平。响应面优化法的优点:?考虑了试验随机误差?响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法?与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。 [实验数据和结果] 实验步骤 1. 输入三因素及其水平，设计响应面实验。
响应面法试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应 曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图 形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型 作图． 建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法．对于非线性体系可作适当处理化为线性形式．设有ｍ个因素影响指标取值，通过次量测试验，得到ｎ组试验 数据（）．假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第次试验中第个因素的水平值；为建 立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差．应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵Ｂ如下将Ｂ阵代入原假设的回归方 程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图．模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面．下面简要讨论二因素响应面分析的 大致过程． 在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过ｎ次量测试验 （试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的３倍），以最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为Ｘ坐标和ｙ坐标，以相应 的由上式计算的响应为Ｚ坐标作出三维空间的曲面（这就是２因素响应曲面）． 应当指出，上述求出的模型只是最小二乘解，不一定与实际体系相符，也即，计算值与试验值之间的差异不一定符合要求．因此，求出系数的最小二乘估计后，应进 行检验．一个简单实用的方法就是以响应的计算值与试验值之间的相关系数是否接近于１或观察其相关图是否所有的点都基本接近直线进行判别．如果以表示响应试 验值，为计算值，则两者的相关系数Ｒ定义为其中 对于二因素以上的试验，要在三维以上的抽象空间才能表示，一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或二维空间中加以描述．
2008年第34卷第8期(总第248期) 111 花青素的提取、分离以及纯化方法研究进展3 孙建霞,张 燕,胡小松,吴继红,廖小军 (中国农业大学,教育部果蔬加工工程研究中心,北京,100083) 摘 要 花青素是一种存在于自然界的水溶性多酚类化合物,现已发现其具有多种功能。有关花青素的提取、分离和纯化研究报道很多,文中就近年来国内外相关方面的研究进展进行了分析。关键词 花青素,提取,分离,纯化 花青素(ant hocyanins )又称花色素,是一类广泛 存在于植物中的水溶性天然色素,多以糖苷的形式存在,也称花色苷。最早而最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红,它于1879年在意大利上市。花青素的结构母核是22苯基苯并吡喃阳离子,属于类黄酮化合物。自然界已知的花青素有22大类,食品中重要的有6类,即矢车菊色素(cyanindin ,Cy )、天竺葵色素(pelargonidin ,Pg )、飞燕草色素(delp hin 2 idin ,Dp )、芍药色素(peonidin ,Pn )、牵牛色素(pet u 2nidin ,Pt )和锦葵色素(malvidin ,Mv )[1],其结构如图1所示。它们在植物可食部分的分布比例分别为50%、12%、12%、12%、7%和7%。花青素广泛存在 于开花植物(被子植物)的花、果实、茎、叶、根器官的 细胞液中,分布于27个科,72个属的植物中[2]。其中尤以葡萄皮、阿龙尼亚苦味果、黑醋栗、草莓、树莓、越橘等含量最为丰富。 图1 食品中几种重要的花青素结构 第一作者:博士研究生(廖小军教授为通讯作者)。 3国家自然科学基金项目(30771511),国家“十一五”支撑计划(2006BAD27B03),国家863计划(2007AA100405)资助 收稿日期:2008-04-24,改回日期:2008-06-13 自然条件下游离的花青素极少见,常与一个或多 个葡萄糖(gluco se )、鼠李糖(rhamnose )、半乳糖(ga 2lactose )、木糖(xylo se )、阿拉伯糖(arabinose )等通过 糖苷键连接形成花青素,花青素中的糖苷基和羟基还可以与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花青素[1]。 目前国内外有关花青素的研究主要集中在花青 素资源分布的评价与资源库的建立、花青素的定性与定量方法学研究、花青素的生理活性与功能研究、花青素的高效提取与绿色分离技术研究、花青素的结构稳定性与分子降解机制研究、花青素的应用与产品开发研究6个方面,这些内容的深入研究有利于进一步合理利用与开发自然界中丰富的花青素资源。本文重点就近年来国内外学者对花青素提取、分离和纯化方法的最新研究进行了分析总结。
学校 食品科学研究中实验设计的案例分析 —响应面法优化超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究 摘要：选择对ACE 抑制率有显著影响的四个因素：超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4)，进行四因素三水平的响应面分析试验，经过Design-Expert优化得到最优条件为超声波处理时间28.42min、超声波功率190.04W、超声波水浴温度55.05℃、酶解时间2.24h，在此条件下燕麦ACE 抑制肽的抑制率87.36%。与参考文献SAS软件处理的结果中比较差异很小。 关键字：Design-Expert 响应面分析 1.比较分析 表一响应面试验设计 因素 水平 -1 0 1 超声波处理时间X1(min) 20 30 40 超声波功率X2(W) 132 176 220 超声波水浴温度X3(℃) 50 55 60 酶解时间X4(h) 1 2 3 2.Design-Expert响应面分析 分析试验设计包括：方差分析、拟合二次回归方程、残差图等数据点分布图、二次项的等高线和响应面图。优化四个因素（超声波处理时间、超声波功率、超声波水浴温度、酶解时间）使响应值最大，最终得到最大响应值和相应四个因素的值。 利用Design-Expert软件可以与文献SAS软件比较，结果可以得到最优，通过上述步骤分析可以判断分析结果的可靠性。
2.1 数据的输入 图 1 2.2 Box-Behnken响应面试验设计与结果 图 2 2.3 选择模型
2.4 方差分析 在本例中，模型显著性检验p<0.05，表明该模型具有统计学意义。由图4知其自变量一次项A，
*花青素的提取: 花青素的提取是目前花青素研究发展的热点问题，也是花青素生产、投入使用的关键性环节。近年来，在传统提取方法的基础之上，一些凭借新技术或经过改良后的提取方法也开始崭露头角。 1有机溶剂萃取法 这是目前国内外最广泛使用的提取方法。多数选择甲醇、乙酮、丙酮等混合溶剂对材料进行溶解过滤，通过调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。国内吴信子等用盐酸一甲醇溶液提取，然后用纸层析法(中号)和柱层析法(聚乙酰胺)进行花色苷的分离。目前，有机溶剂萃取法已成功地应用于诸如葡萄籽、石榴皮、蓝莓等绝大多数含花青素物质的提取分离。有机溶剂萃取法的关键是选择有效溶剂，要求既要对被提取的有效成分有较大溶解度，又要避免大量杂质的溶解。该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。 2水溶液提取法 有机溶剂萃取的花青素多有毒性残留且生产过程环境污染大，有鉴于此，水溶液提取应运而生。该方法一般将植物材料在常压或高压下用热水浸泡，然后用非极性大孔树脂吸附；或直接使用脱氧热水提取，再采用超滤或反渗透，浓缩得到粗提物。它是Duncan和Gilmour(1998)发明的提取花青素的方法，此方法设备要求简单，但产品纯度低。 3超临界流体萃取法 超临界流体萃取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。这种方法产品提取率高，但设备成本过高。孙传经采用超临界CO：萃取法从银杏叶、黑加仑籽及葡萄籽中提取花青素工艺进行了研究。该工艺中CO 和改性剂可循环使用，对环境无污染。 4微波提取法 该法于1986年被Ganzlert E9]等人首先用于分离各种类型化合物。国内李风英探讨了微波技术对葡萄籽中原花青素提取量和分子结构的影响。为微波在葡萄籽中有效成分浸提方面的研究奠定了基础。微波提取法是利用在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到具有较小介电常数、微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。该技术选择性好，萃取率高，速度快，操作简单，废液排放量少。 5超声波提取法 超声波在20世纪50年代后逐渐应用于化学化工生产过程之中，且主要集中在植物中药用成分、多糖以及其它功能性成分的提取等研究领域。超声波提取运用前景好、操作简单、快速高效、生产过程清洁无公害。2008年时，Corrales【12]等人开展的不同提取方法对葡萄中花青素的提取率影响的对比实验结果表明：相同条件下与热浸70~(2提取相比，超声波辅助提取花青素等酚类的效率可以提高50％以上。 6微生物发酵提取法 此方法将生物发酵技术应用于花青素的提取之中，是生物科学与化工生产之间的超强渗透与有效结合。微生物发酵法利用微生物或酶让含有花青素的细胞胞壁降解分离，使细胞胞体内花青素充分溶入到提取液中，从而增加提取的产率与速率。王振宇I1 采用微生物和纤维素酶降解大花葵细胞壁提取花青素就是可靠的研究实例。该方法的优点是操作稳定性及可靠性高，环境友好。
花青素的提取方法 花青素，是一种热敏性活性物质。属于水溶性多酚黄酮类化合物，其特殊的结构和化学成分赋予了花青素多种生物活性，这些活性物质对温度较为敏感，当所在环境温度超过一定界限后，就会失活，也就是我们俗话说的死掉。（比如我们都知道，乳酸菌、益生菌等都属于热敏性活性物质，不能加热，否则失去活性就会失去其主要作用。）花青素失活就会失去其特有的功效作用。 21世纪高新科技，冻干技术 冻干，全称真空冷冻干燥，是将湿物料或溶液在较低的温度（－10℃～－50℃）下冻结成固态，然后在真空下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。 冻干的基本原理是基于水的三态变化。水有固态、液态和气态，三种相态既可以相互转换又可以共存。当水在三相点时，水、冰、水蒸气三者可共存且相互平衡。在高真空状态下，利用升华原理，使预先冻结的物料中的水分，不经过冰的融化，直接以冰态升华为水蒸汽被除去，从而达到冷冻干燥的目的。 破壁技术，充分释放有效成分 我们知道浆果中含花青素最多的部分是皮和籽，先不说这两部分很难下咽，一般人吃不下去，就算我们强忍吞下，也难以消化吸收，相信很多人知道果皮和果籽经常可以在大便中看到，就是因为人类的肠胃很难消化吸收它们的缘故。
植物细胞动物细胞不同，植物细胞外还有一层厚厚的细胞壁，其主要成分就是纤维素，硬硬的壳把细胞紧紧的包裹在里面。人类的消化液无法破坏植物细胞，要吸收植物的所有营养成分，必须将其外壁破坏。 细胞破壁技术就是通过打破植物细胞壁，营养成分在未遭到破坏的情况下可以完全释放出来，使营养更好地被吸收和保持活性成分的技术，释放植物生化素，最大限度地融合其中的膳食纤维、维生素及其他营养元素。这是当今最先进的食品加工技术。 破壁技术可使有效物质得到充分释放，食品的营养成分和功效作用将提高至少10倍，利于人体吸收。 超微技术，最大化吸收有效成分 冻干花青素采用超微粉碎技术，将九种浆果冻干后破壁粉碎为约2000-3000目（目数越大，分子越小，越容易吸收）的超微粉剂，大约为5μm（微米）的直径。（注：一般人体的毛孔直径为20μ）如此微小分子的花青素粉剂，可以直接被人体肠道所吸收而快速作用于人体，做到最大化吸收有效成分，最大化发挥花青素功能作用。 生活中我们吃的食物，尤其是蔬菜时，都是经过加热（蒸煮煎炒炖）为熟食，食物中的花青素早已失去活性，成为无效物质了，这就是为什么我们日常也经常食用富含花青素的水果蔬菜，却没感受到花青素的强大功效的原因。而冻干花青素采用国际先进的冻干技术，可保持花青素活性，发挥其应有的功效。
花青素提取工艺试验 实验仪器材料： 仪器：打浆机、干燥箱、粉碎机、超声波震荡器、培养箱、低温超速离心机、旋转蒸发仪、真空干燥箱、水浴锅、pH试纸 试剂：80%乙醇、山芋粉、蔗糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、滤纸、石油醚、0.1%稀盐酸 材料：枸杞、黑曲霉 1.1称取枸杞加入去PH=2离子水中（按比例为1：120g/L），在60℃水浴中浸泡4h，分离样液和样品，（重复2次），样液待用1.2【脱脂处理】将1.1中的样品和样液与石油醚（30-60℃）按1:10g/L混合，浸泡1h后，于旋转蒸发仪中50℃加热回流2h，所得样品溶液，放在打浆机打碎 1.3加入微生物培养液中【固液1:5】(培养液配比: 山芋粉3. 7 5%、蔗糖1 5% 、硝酸铵0. 2%、磷酸二氢钾0. 1%和硫酸镁0. 025% ) , 120 ℃条件下灭菌20min,在超净工作台内接种。黑曲霉与培养液比例为1∶1 000。接种后放入培养箱中培养。温度30℃，pH4.5，培养时间72h 1.4培养后，在培养液中加入40倍pH3.0的80%乙醇，在超声波水浴中50℃提取3h（过滤后重复1-2次） 1.5粗过滤后，低温离心40℃，4000r/min，10min，去沉淀，取离心液 1.6 50℃旋转蒸发仪真空浓缩，减压浓缩0.076Mpa
1.7 放入真空干燥箱干燥，得粗品 1.8上述浓缩液再次离心，加入0.1mol/LHcl溶液调pH=4-4.5，离心分离，再次浓缩烘干 精提1 2.1上述粗品，加入温水中溶解 2.2常温下，在微滤机下0.12MPa，进行微滤收集液体 2.3所得滤液再次放入超滤机中过滤，0.1MPa，膜流速1500L/h 2.4取0.5g活化湿AB- 8 树脂和20ml液体常温吸附24h，离心2.5滤液加入60%乙醇洗脱，1-3h左右，后60℃，减压真空88kpa 下蒸馏回收乙醇 2.6所得液体加入一定量石油醚精致萃取，35℃减压浓缩回收，2.7真空干燥称重 方案二 1.1称取样品和样液与石油醚（30-60℃）按1:10ml混合，浸泡1h后，于旋转蒸发仪中50℃加热回流2h，所得样品溶液，干燥滤渣用于色素提取 1.2以料液比为1：40的PH=3的80%乙醇在50℃下浸泡3后，在超声波为40kHZ下，100W,20min，过滤去沉淀，重复1-2次1.3粗过滤后，低温离心40℃，4000r/min，10min，去沉淀，取离心液 1.4 50℃旋转蒸发仪真空浓缩，减压浓缩0.076Mpa 1.5 放入真空干燥箱干燥，得粗品
响应面 所谓的响应面是指响应变量η与一组输入变量（ζ1,ζ2,ζ3...ζk）之间的函数关系式：η=f(ζ1,ζ2,ζ3...ζk)。依据响应面法建立的双螺杆挤压机的统计模型可用于挤压过程的控制和挤压结果的预测。 试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型作图．建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法．对于非线性体系可作适当处理化为线性形式．设有ｍ个因素影响指标取值，通过次量测试验，得到ｎ组试验数据．假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第次试验中第个因素的水平值；为建立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差．应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵Ｂ如下将Ｂ阵代入原假设的回归方程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图． 模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面．下面简要讨论二因素响应面分析的大致过程．在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过ｎ次量测试验（试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的３倍），以最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为Ｘ坐标和ｙ坐标，以相应的由上式计算的响应为Ｚ坐标作出三维空间的曲面（这就是２因素响应曲面）． 应当指出，上述求出的模型只是最小二乘解，不一定与实际体系相符，也即，计算值与试验值之间的差异不一定符合要求．因此，求出系数的最小二乘估计后，应进行检验．一个简单实用的方法就是以响应的计算值与试验值之间的相关系数是否接近于１或观察其相关图是否所有的点都基本接近直线进行判别．如果以表示响应试验值，为计算值，则两者的相关系数Ｒ定义为其中对于二因素以上的试验，要在三维以上的抽象空间才能表示，一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或二维空间中加以描述． 什么叫响应面法? 试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应 曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图 形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件．