NJA
中华男科学杂志
National Journal of Andrology Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi 2011，17（7）：634－638
http ：//www．androl．cn
Mini Review
·综述·
ATM /H2AX 与冷冻精子DNA 损伤修复
王
超
综述；李志凌
审校
（汕头大学医学院第一附属医院生殖中心，广东汕头515041）
【摘要】精液冷冻保存是辅助生殖领域中的一项重要技术，但冷冻本身可引起精子DNA 损伤，其中过量活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）的生成起主要作用；而DNA 损伤精子仍可以受精形成胚胎，影响生殖结局。蛋白激酶ATM （ataxia-telangiectasia mutated ）是DNA 损伤的信号感受器，可启动级联反应磷酸化多种蛋白分子调控DNA 损伤修复和细胞周期检查点。在ATM 的下游分子中，组蛋白H2AX （histone H2AX ）被磷酸化激活后参与了DNA 损伤精子受精后的修复，
与ATM 相互作用共同调控胚胎发育过程的细胞周期。ATM /H2AX 参与DNA 损伤修复以及细胞周期检查点信号转导，以及在氧化应激性DNA 损伤修复中的潜在作用，提示其可能参与了冷冻精子氧化应激性DNA 损伤的修复过程。
【关键词】ATM /H2AX ；DNA 损伤修复；细胞周期检查点；精子冷冻
中图分类号：R698+
．2
文献标志码：A 文章编号：1009-
3591（2011）07-0634-05①ATM/H 2AX and repair of sperm-DNA damage during cryopreservation
WANG Chao ，LI Zhi-ling
Center of Reproductive Medicine ，The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College ，Shantou ，Guangdong 515041，China
【Abstract 】Semen cryopreservation is an important method in assisted reproductive technology ，but meanwhile it is complicated by cryodamage to spermatozoa．Mechanisms behind the cryodamage to spermatozoa are thought to be multifactorial ，and the excessive generation of reactive oxygen species （ROS ）has been suggested as a major contributing factor．DNA-damaged sperm is also capable of fertilizing oocytes ，significantly affecting the outcome of reproduction．As a sensor of DNA damage responses ，protein kinase ATM （ataxia telangiectasia mutated ）can be initiated through rapid intermolecular autophosphorylation induced by DNA damage ，phosphoryl-ate various proteins ，and amplify the responses to DNA damage．After DNA damage ，histone H2AX is activated by ATM ，which con-tributes to the repair of sperm-DNA damage after fertilization and regulates the cell cycle during embryo development．Given the impor-tant role of the ATM /H2AX signaling pathway in the response to and repair of DNA damage induced by oxidative stress ，it may mediate the repair of sperm-DNA damage resulting from cryopreservation．
Natl J Androl ，2011，17（7）：634－638
【Key words 】ATM /H2AX ；repair of DNA damage ；cell cycle checkpoint ；sperm cryopreservation
Supported by grants from National Natural Science Foundation of China （81070542）and Natural Science Foundation of Guangdong Province （10151503102000020）
Correspondence to ：LI Zhi-ling ，email ：stlizhiling@126．com Received ：March 1，2011；accepted ：May 12，2011
·
436·①
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81070542）；广东省自然科学基金资助项目（10151503102000020）作者简介：王
超（1983-），女，山东泰安市人，硕士研究生，从事生殖医学研究。Email ：iawangchao@163．com
通讯作者：李志凌，
Email ：stlizhiling@126．com
精液冷冻保存是一项比较成熟的技术，在治疗不育症、预防遗传病和提供生殖保险等方面发挥了重要的作用。但是，冷冻过程可使精子处于氧化应激状态，导致DNA损伤。DNA损伤精子仍然具有受精能力和发育潜能，严重影响生殖健康。已有研究报道：辐射、遗传毒性化合物等其他多种因素引起的精子DNA损伤可导致早期胚胎发育异常，甚至引起子代遗传缺陷、包括表观遗传疾病，生殖功能障碍和生殖系统肿瘤的发生［1］。这是因为精子缺乏损伤修复系统，其损伤修复必须依赖卵母细胞或者早期胚胎来源的蛋白和因子。因此，研究DNA冷冻损伤精子受精后修复，对精液冷冻保护技术乃至人类生殖领域具有深远的意义。本文重点综述了ATM/ H2AX在DNA损伤修复以及细胞周期检查点中的重要作用以及他们与冷冻精子损伤修复的可能关系，旨在为冷冻精子DNA损伤防治措施提供理论依据。
1冷冻致精子DNA损伤和损伤后精子DNA修复的可能机制
精子冷冻保存的最大缺陷就是解冻后的精子质量不满意，包括a+b级精子百分率以及精子DNA 完整性的降低，这种状况在不育患者中尤为突出。目前关于冷冻导致精子DNA损伤的病因尚未完全阐明，可能涉及染色体组装缺陷、凋亡异常以及氧化应激损伤等，其中冷冻过程诱发氧化应激和过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成起主要作用［2-3］。ROS可损伤细胞的蛋白、脂质，并可导致多种形式的DNA损伤，如染色质交联、染色体缺失、碱基氧化和DNA单双链损伤［4］。而最新的研究发现冷冻可导致人类精子DNA断裂、DNA氧化以及凋亡，且DNA断裂的水平与冷冻所致的氧化应激呈正相关［3］。
实际上，精液在正常的生理过程中即可产生ROS，生理水平的ROS影响和调节配子，在精卵结合、种植以及早期胚胎发育等生殖过程中发挥着决定性的作用。当ROS的生成超过精浆的抗氧化作用时，精子就处于氧化应激状态。而冷冻刺激精液产生过量的ROS，削弱精液（浆）的抗氧化能力，从而使精子处于氧化应激状态，损伤精子的结构与功能［5］。大量研究证明在冷冻保护剂中添加抗氧化物具有冷冻保护作用，可预防精子DNA损伤。本研究也发现，ROS与人类冻融精子的质量改变有关，在冷冻保护剂中加入适量的抗坏血酸盐和过氧化氢酶后可显著降低冻融精子的ROS水平，改善精子质量［2］。Martinez-Soto研究小组的研究也证实了这一结论，他们在解冻液中加入抗氧化剂染料木黄铜，发现同对照组相比染料木黄铜对冻融精子具有抗氧化保护作用，在解冻液中添加染料木黄铜可降低冻融精子的ROS水平，提高精子活力，降低冷冻所导致的膜脂质紊乱以及DNA损伤［6］。Bucak等［7］运用单细胞凝胶电泳分析冷冻精子DNA损伤发现冷冻保护剂中添加抗氧化剂甲硫氨酸、肌醇以及肉碱均可减少精子DNA损伤，提高DNA的完整性。以上研究都证明冷冻所造成的DNA损伤可能有ROS的参与。
成熟精子失去了DNA损伤修复功能，损伤要在受精后修复。研究证明：卵母细胞和早期胚胎内具备了一些修复DNA损伤所必须的蛋白和因子，如ATM、ATR、Chk1、Chk2、H2AX、Nbs1、Rad51、Rad17、Brca1和Brca2等，对损伤的精子DNA具有修复作用［8］。如果卵母细胞期储存不足或胚胎期相关基因没有正确表达，胚胎将无法存活。
2ATM在氧化应激性DNA损伤应答反应中的作用
研究发现ATM参与了激活过量ROS和/或氧化DNA损伤所诱导的反应，激活多种信号通路，如氧化应激性DNA损伤修复通路和细胞周期检查点通路［9］，具有胚胎保护作用。因此在冷冻致氧化应激性DNA损伤精子受精后修复以及细胞周期调控中，ATM可能发挥了重要的作用。
2．1ATM可介导ROS所导致的氧化应激性DNA 损伤的修复过程ATM是一种色氨酸/丝氨酸蛋白激酶，是PIKK（phosphoinositide3-kinase-related pro-tein kinase）家族成员，该家族成员还包括ATR（ATM and Rad3-related protein）、DNA-PKcs（the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase）和SMG1（suppressor with morphological effect on genitalia1）［10］。DNA损伤可诱导ATM的自动磷酸化激活，其中，Ser-1981的自动磷酸化是公认的ATM激活的标志物。ATM对DNA损伤非常敏感，研究表明仅少量的DNA双链损伤（double-strands breaks，DSBs）就可造成大部分ATM分子在Ser-1981位点的快速磷酸化。ATM激活后催化的底物有近700种蛋白，大部分被激活的蛋白参与了DNA修复、细胞周期检查点的激活及转录过程［10-11］。但是该分子在此过程中的精细调节机制尚未完全清楚。
研究发现ATM可能作为过量ROS和/或氧化DNA损伤的感受器，在小鼠胚胎的器官发生期表达，在胚胎发育过程中发挥了重要的保护作用。
ATM缺陷的小鼠胚胎对电离辐射高度敏感，表现为胎鼠体重下降、胎尾扭结率增加以及产后致死率升高［9］。有学者推测电离辐射后ATM的胚胎保护作用是通过电离辐射所诱导的DNA DSBs引发的。但也有人认为这是因为电离辐射可生成过量的ROS，造成细胞内大分子一系列的氧化应激损伤，而不单单是DNA DSBs。因此ATM在胚胎发育过程中发挥了更为广泛的作用，可作用于多个通路来维持基因组的完整性。有研究支持该假设：ATM基因敲除后的成年小鼠表现为氧化DNA损伤的积聚，苯妥英作用于ATM缺陷小鼠可导致氧化DNA表达的增加。因此，ATM可能作为过量ROS和/或氧化DNA损伤的感受器，保护胚胎免于遭受内源性或外源性增强的氧化应激反应，在介导ROS所导致的氧化应激性DNA损伤的修复方面发挥重要的作用［12-13］。但是相关功能尚需进一步研究确定。
2．2ATM是细胞周期检查点信号通路的感受器
为了维持基因组的完整性及细胞分裂过程中完全复制的和未损伤的DNA的正确转导，有丝分裂前，真核生物细胞经历了G1/S、intra-S、G2/M细胞周期检查点［14］。多种因素如ROS以及复制叉停顿、紫外线照射、电离辐射、DNA损伤性化疗药物所诱导的DNA损伤都可以激活检查点信号［15］，检查点信号通路激活后可以短暂性的停止或放慢细胞周期过程，要么为细胞DNA损伤修复所涉及的基因转录的增强及其产物的活动提供足够的时间，要么为引发凋亡过程提供足够的时间［16］。
传统上，DNA损伤反应被分为两个主要的激酶分支：DNA DSBs激活ATM/Chk2检查点信号通路，DNA单链损伤或者大量的损伤主要激活ATR/Chk1检查点信号通路［14-15］。ATM和ATR激活后，可介导Chk2的Thr68以及Chk1的Ser317和Ser345磷酸化激活。Chk2/Chk1是细胞G2/M周期检查点信号通路的转导分子。研究证实，Chk1缺陷细胞的DNA损伤检查点机制受损，Chk1基因敲除小鼠死于早期胚胎发育阶段，并伴有细胞核的形态异常，这与Niida观察到Chk1基因敲除小鼠ES细胞由于Cdc2-CyclinB的异常活化引起有丝分裂过早发生的结果一致［17］。另外，Chk2在氧化应激性DNA损伤所致的G2/M期停滞中扮演重要作用。Zhao等［18］
使用H
2O
2
处理A549细胞证明了氧化应激性DNA
损伤中，Chk2也是ATM的底物。Chk1和Chk2激酶抑制剂UCN-01可解除镉诱导的氧化DNA损伤所致的G2/M期停滞［19］。
Chk2/Chk1的信号转导作用是通过对Cdc25磷酸酶家族的磷酸化灭活来实现的。后者的磷酸化可进一步激活Cdc2/CyclinB等效应器分子，从而控制细胞进入有丝分裂。Cdc25家族包括3个不同的亚型：Cdc25A、Cdc25B（Cdc25B1、Cdc25B2、Cdc25B3）和Cdc25C。但是对于Cdc25家族各成员在胚胎细胞有丝分裂过程中所发挥的作用尚有争议。Kiyokawa等［20］发现在小鼠的种植前胚胎中，Cdc25A没有表达，直到晚期胚泡期才有表达；Cdc25B以及Cdc25C调控了种植前胚胎的细胞周期进程。Lee等［21］却得到了相反的研究结果，他们发现Cdc25A缺陷的胚胎表现为发育迟缓并在胚胎发育的第7．5天之前发生凋亡，因此认为Cdc25A 在早期的胚胎发育中是必需的。Ferguson等［22］的研究也支持Cdc25A在胚胎发育过程中的调控作用，因为Cdc25B－/－和Cdc25C－/－小鼠表现为正常的胚胎发育和有丝分裂进程。
3γH2AX在精子DNA损伤修复中的作用及其与ATM的关系
虽然目前关于受精卵DNA损伤应答反应尚不清楚，但是很多研究证明γH2AX（histone H2AX phosphorylation，组蛋白H2AX磷酸化）可能参与了DNA损伤精子受精后的修复过程，同时作为ATM 激活的下游分子，与ATM共同调节胚胎发育的细胞周期进程。
3．1γH2AX可能参与了DNA损伤精子受精后的损伤修复过程H2AX是组蛋白H2A家族成员，C-端有一段由22个残基组成的在进化上高度保守的同源序列，其中包括一个139位为丝氨酸残基的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu，SQE）结构域，该结构域中的Ser残基是PIKK家族共同的识别位点，可能被ATM、ATR以及DNA-PKcs磷酸化。现在普遍认为H2AX Ser139位的磷酸化即γH2AX焦点的形成是与DNA DSBs一致和定量的标志物，在仅有少量DSBs存在的情况下仍然适用［23］。最近的研究发现，H2AX在ROS诱导的DNA损伤中也是必需的，H
2
O
2
所产生的氧化应激反应可诱导H2AX、ATM以及Chk2的磷酸化［18］。敲除或者抑制H2AX
的功能后，细胞将对H
2
O
2
等造成的应激损伤非常敏感［24］。γH2AX在DNA损伤后迅速生成，可作为DNA损伤修复蛋白以及检查点蛋白的募集和维持信号［25］。
虽然目前关于受精卵内DNA损伤的修复机制尚不清楚，但是一些研究表明，γH2AX在介导受精卵内DNA损伤修复通路中发挥了重要的作用。De-
rijck等［26］研究发现，紫外线照射后的精子穿卵后，从精卵融合后80min（即父系染色质再致密阶段）直到210min（此时原核已经形成），受精卵雄原核内大的γH2AX焦点逐渐减少，且焦点的形成可被渥曼青霉素所抑制。该现象与G1期体细胞损伤后快速修复的现象相似，提示损伤的精子DNA可能在合子期得到了部分修复。Barton等［27］也发现环磷酰胺致DNA损伤精子受精后，来源于精子的DNA 损伤可能在DNA复制以前的原核发育期得到了部分修复，且卵裂前父系DNA损伤的修复尚未完成，此过程中γH2AX可募集并维持修复蛋白因子于DNA损伤的位点以协助修复的进行。此外，小鼠的2-细胞期胚胎可能同样通过γH2AX介导的修复通路对电磁场引起的DNA损伤进行修复［28］。但也有研究认为DNA损伤修复机制在小鼠的1-细胞和2-细胞期胚胎中功能尚不完全［29］，DNA损伤在2-细胞期以后的种植前胚胎细胞才能通过γH2AX通路得到修复［30］。
3．2γH2AX与ATM相互作用并参与了胚胎发育过程的细胞周期调控ATM是磷酸化H2AX的主要激酶。尽管PIKK家族均可能参与了H2AX的磷酸化过程，但是ATM所具有的可被DNA损伤相关的染色质修饰所激活的能力，使其成为PIKK家族中促使H2AX磷酸化的最匹配的激酶［23］。Burma 等［31］使用DNA-PK或者ATM基因敲除的细胞证明ATM是H2AX磷酸化最主要的激酶，大约参与了95%的H2AX的磷酸化过程。同时，γH2AX对于ATM及检查点信号的聚集和维持至关重要，γH2AX 的去磷酸化标志着细胞周期的恢复［25］。研究发现H2AX-/-的小鼠胚胎干细胞依然可以生成磷酸化的ATM，γH2AX可能对于磷酸化的ATM在DNA损伤位点的维持是必需的［32］。注射γH2AX特异性的抗体或者H2AX羧基末端对应的肽可破坏ATM的聚集以及Chk1的释放，并最终显著影响检查点反应［33］。
很多体细胞以及肿瘤细胞的研究发现γH2AX 与G2/M细胞周期检查点信号通路的作用密切相关。电离辐射H2AX-/-小鼠成纤维细胞［34］和脾B细胞［35］均显示G2/M期检查点缺陷。烷化DNA损伤的H2AX缺陷细胞由于缺乏G2/M期停滞表现出广泛的凋亡［33］。虽然目前对于胚胎发育过程中的细胞周期检查点信号通路的研究不多，但也有证据显示γH2AX参与了小鼠正常胚胎发育过程中的细胞周期调控。在小鼠种植前胚胎的正常发育过程中，H2AX的磷酸化贯穿整个细胞周期，有丝分裂过程水平最高，且此过程的磷酸化水平是ATM依赖的，因此认为高水平的γH2AX参与调控了种植前胚胎的有丝分裂进程［36］。ATM-/-和H2AX-/-鼠胚胎干细胞和成纤维细胞都表现为基因组的不稳定，且ATM-/-和H2AX-/-双缺陷可导致妊娠中期胚胎多方面的发育缺陷而致死［24］。
4小结与展望
ATM作为DNA损伤反应通路的感受器分子，在DNA损伤后可激活多种信号通路，协调细胞周期检查点调控和DNA损伤修复，其逐渐浮现出的一个功能是可能作为过量ROS和/或氧化DNA损伤的感受器，保护胚胎免于遭受内源性或外源性增强的氧化应激反应，具胚胎保护作用。H2AX作为ATM 的下游分子，参与了胚胎发育过程的细胞周期调控，并也可能参与了DNA损伤精子受精后的损伤修复过程。ATM与H2AX在氧化应激性DNA损伤反应以及胚胎发育过程中的重要作用，提示可能参与了冷冻所造成的氧化应激性DNA损伤精子受精后的修复过程。笔者设想，冷冻导致的氧化应激性DNA 损伤在受精后使ATM自动磷酸化激活，进而激活他的下游分子H2AX以及修复系统和检查点系统的相关因子，γH2AX维持相关因子于损伤位点，继而细胞周期停滞，DNA损伤得以修复。
目前胚胎发育过程中损伤修复系统以及细胞周期检查点系统的研究不多，他们在信号通路中的确切作用尚不清楚，胚胎早期的修复作用已成为研究的热点。DNA冷冻损伤精子受精后能否得到修复是保证遗传物质完整性和胚胎正常发育的基础，ATM和H2AX为此方面的研究提供了一个切入点。笔者希望通过此通路探索冷冻保存导致精子DNA 损伤后的分子修复机制，为临床探寻人类精液冷冻保存方案的研究提供有力的理论基础，对冷冻所致DNA损伤精子受精后的胚胎发育过程进行深入的揭示，为建立冷冻技术的安全性评估标准提供理论依据。从而进一步优化人类精液冷冻保存技术，提高冷冻精子在辅助生殖技术中的临床治疗结局，最大可能的保存男性生育力。此假设需较多的基础与临床研究，具有广阔的理论研究与临床应用前景。
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（收稿日期：2011-03-01；接受日期：2011-05-12）
（本文编辑：黄婷婷）
精子冷冻保护剂 简介： 正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌物及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成，最终射出的混合物是一种粘稠的液体。精子分析的方法有很多，其中可通过培养进行检测。 Leagene 精子冷冻保护剂主要由甘油、葡萄糖、枸橼酸钠、抗生素等组成，经无菌处理，其基本原理是在细胞冷冻过程中随着温度不断下降，细胞外液中作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗粒状冰晶，导致细胞外水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，，用冷冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，而不损伤细胞。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)人类精液快速冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置入4℃冰箱。 6、将冷冻管置入－80℃液氮蒸气。 7、将冷冻管投入液氮中冻存。 (二)人类精液程序冷冻步骤 1、精液取出后，在37℃的水浴箱中液化。 2、精液液化后按照WHO 的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH 值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录。 3、提前将冷冻保护剂复温至室温。 4、将精液与冷冻保护剂按的比例混匀，并分装于冷冻管中，冷冻管做好标记。 5、将冷冻管置于程序冷冻仪中，开始程序冷冻。冷冻程序如下：编号 名称CZ0150Storage 精子冷冻保护剂 100ml -20℃ 使用说明书1份
保存的一般步骤 （一）精子的收集 禁欲期（通常为 3～ 5d）后，用**方法将精子收集于 10～ 20mL 无菌的聚丙烯样品收集容器中。要求禁欲期是为了更好地冷冻保存样品。通常而言，这样的精子与收集前禁欲期较短及不规则的精子相比，冷冻保存后的特性更恒定且更完善。 射出的精液是液态的，但正常情况下立即凝聚成胶状。凝聚后的精液通常在 30min内液化，此时就可测定其体积。为了使精子获得最大的冷冻存活力，应在收集精液后 1min内开始对液化精子进行冷冻保存处理。 （二）体积的丈量 体积可用较准的加样器或带针头的 5mL 注射器来丈量，有时也可根据收集精液前后采样瓶的重量之差来计算。取 0.1～ 0.2mL 精液作精液分析（活动精子的百分数及其质量、精子密度等，参见本书有关章节），此外尚需取出一些精液，同时以用来做筛选某种性传染疾病的检测、进行某些检测以筛选导致性病的微生物如奈瑟淋球菌等（详见有关章节）。 （三）甘油化 甘油作为冷冻保护剂，可以分步方式直接加入到未经处理的精液之中。每次加入后混匀，时间间隔为 1min；或间接地作为扩张液或基液的组分，经稀释后逐步加入精液。而在美国与加拿大，40% 以上的著名精子库，仍单独使用甘油作为冷冻保护剂，而越来越多的新的精子库则使用扩张剂，尤其是含甘油的两性离子缓冲系统。 甘油化的条件不一定涉及温度的特殊条件（除了室温之外）和接触时间（除了加入甘油及混匀所需时间之外）。 （四）包装和存活力观察 甘油化的精液可吸入塑料吸管（可用封口剂，加热，或用尼龙塞来密封）或放入玻璃安瓿（用火焰封口），也可放入塑料冷冻管（冷冻小瓶）后用螺口盖拧紧。每份冷冻精液的体积通常是 0.4～ 0.8mL，这可作为人工授精的一个单位。当然假如合适，人工授精也可能使用一个单位以上的精液，选择用于冷冻保存精子的容器是很重要的。这种容器应是易于标记、操纵、储存，同样也应具有很好的生物兼容性以及抗压性能。高质量的聚丙烯吸管或小瓶看来最符合这些标准，而没有易碎及被洗涤剂污染等玻璃容器所具有的缺点。 放入液氮冷冻之前，除了要对被冷冻和储备的精子进行分装以外，还需预备一份质量控制检测样品。对收集后未经处理的精液、用冷冻保护剂处理过的精液以及储存前、冻融后的精液均应观察其中的活动精子及其活动力。通过观察能追踪冷冻保存各阶段的精子生存情况，并能确保了解冷冻精子的存活能力。
精子冷冻贮存 6.1 引言 精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说。 从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学。发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)。 由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)。特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。 人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率。它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性。而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤。但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大。一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)。优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)。 影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)。如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降。冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿(Clarke et al., 2006; Feldschuh et al., 2005)。 精子冷冻可适用于很多情况（见表6.1），在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改（见章节6.2.2）。
稀少精子冷冻技术 薛松果 临床应用价值高： 男方因素约占不孕症病因的30-40％，无精症约占男方因素的10％左右。1992年Palermo等首先将卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术应用于临床，解决了男性严重少、弱、畸形精子症患者不能生育子代的难题。而ICSI技术结合显微外科取精术如附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA)、经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和睾丸精子抽取术(testicular sperm extraction，TESE)则使无精症患者养育遗传学子代成为可能。 然而，MESA、PESA和TESE等都是创伤性手术，多次反复手术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，在女方采卵当日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。 技术难度大： 但是，传统的精子冷冻采用 1.8mL的冷冻管(Cryovial)或0.25－0.5mL麦管(Straw)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程还需要对精子作2-3次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。 现状：
黑龙江大学 课程论文 题目：DNA损伤修复---重组修复 系院：生命科学学院 专业：生物工程 起止时间：2013年5月—— 2013年6月 DNA损伤修复---重组修复
摘要：DNA损伤修复(repair of DNA damage)在多种酶的作用下,生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。 DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变机制,衰老和癌变的原因 还可应用于环境致癌因子的检测。DNA损伤的修复模式有很多种 在这里主要谈有关重组修复方面的 关键词：重组修复、同源重组修复、DNA损伤 DNA damage and repair --- recombination repair LiuDongdong (The 1th class of Biotechnology , College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin, 150080) Abstract：DNA damage repair (repair of DNA damage) in the role of a variety of enzymes, the DNA molecules within living cells by the phenomenon of structural damage after recovery. DNA damage and repair studies help to understand the reasons for the gene mutation mechanisms, aging and cancer, can also be applied to the detection of the environmental carcinogen. DNA damage repair model there are many, here mainly with regard to recombination repair. Key words：recombination repair、homologous recombination repair、DNA damage 重组修复(recombination repairing)：复制含有嘧啶二聚体或其它结构损伤的DNA，但当复制到损伤的部位时，子代DNA链中与损伤部位相对应的部位出现缺口，新合成的子链比未损伤的DNA链要短一些。完整的母链与有缺口的子链重组，缺口由母链来的核苷酸片段弥补。合成重组后，母链中的缺口通过DNA 多聚酶的作用，合成核苷酸片段，然后由连接酶使新片段与旧链联结，重组修复完成。 重组修复的主要步骤有：复制：含有TT或其他结构损伤的DNA仍然可以正常的进行复制，但当复制到损伤部位时，子代DNA链中与损伤部位相对应的位置出现切口，新合成的子链比未损伤的DNA链要短。重组：完整的母链与有缺口的子链重组，缺口由母链来的核苷酸片段弥补。再合成：重组后母链中的缺口通过DNA多聚酶的作用合成核酸片段，然后由连接酶使新片段与旧链连接，至此重组修复完成。重组修复并没有从亲代DNA中去除二聚体。重组蛋白质则可能通过其蛋白质间相互作用而组成大的蛋白质复合物或重组体,并装配于DNA 受损部位以启动同源重组修复。在对DNA 损伤剂反应时,Rad51、Rad51 同系物及其他许多已知的重组蛋白质共定位于核内,这类核灶区的形成表明DNA 双链断裂修复正在进行[1]。另外,该复制叉也可回行并以一条原始链为模板而进行断裂链修复, 这将导致新合成的两条链退火和在复制叉处形成四道联接,从而完成Rad51依赖性的DNA 同源重组修复[2]。在同源重组配对及链交换过程中Rad51必须首先装配于单链DNA而形成核蛋白细丝, 在该核蛋白细丝中,DNA以高度伸展状态与蛋白
冷冻保存精子，把“根”留住 利用“精子银行”留“根” “不等了，我们离婚吧!”在男科门诊常常能够听到这种无奈的话语。结婚多年的夫妻，因为丈夫的精液质量问题(无精子、少精、弱精、畸形精子等)而最终导致劳燕分飞。“精子荒”已经成为一个严峻的社会问题。当代男人的精子和生育能力正在经受严峻的考验，许多男人不约而同地将自救措施瞄准了“精子银行”或“精子库”，希望将自己的生育种子寄存在那里，以备不时之需。所谓“精子银行”或“精子库”，就是指超低温冷冻存放精子的地方和设备。 精液冷冻是保存生育能力的一个有效办法，在接受具有生殖毒性药物和仪器治疗前先保存精子，已成为一种选择。目前认为，“精子银行”主要适合于下列几类人： 第一，对于那些还没有完成“传宗接代”任务，而又处在高危因素笼罩下的男人来说，“精子银行”可以起到储备生育能力的作用，防止因为某些损害因素，包括药物、手术、损伤等造成的生育能力的永久性丧失。例如某些即将长期接触有害睾丸健康的特殊职业(辐射和放射线等)人群，因某些疾病(恶性肿瘤)不得不使用损害
睾丸的化疗药物，不得不手术切除睾丸(睾丸肿瘤)等的 人群，可以预先冷冻精液，起到“生殖储备”的作用。 这也是使用“精子银行”的主要人群。 第二，“精子银行”可作为用于治疗男性不育症的 手段，可以多次保存少精子症者的精液，起到积少成多 的作用，最后可以“集中优势兵力”，用于人工授精， 期望一举获得成功。另外，“精子银行”也是计划生育 措施顺利实行的有力保证。 精子冷冻安全，并非人人需要 低温冷藏的精子具有较高的质量和安全性，在零下196摄氏度的低温下可以将精子良好保存达数十年之久，且这些精子仍然具有生育能力。在低温保存过程中，还 可以淘汰许多发育异常的精子。一些携带传染性病原体 的献精员，例如艾滋病病毒携带者，也可以在精子冷藏 保存过程被发现而淘汰其精液。因此，采用“精子银行”的精子是比较安全且让人放心的，获得怀孕者自然流产 机会少，出生孩子畸形者少，后代素质高。 从理论上讲，所有男人的精子都可以保存在“精子 银行”里，从而使生育能力获得万无一失的保障。以现 今的科学技术，保存精子已经是非常简单的常规手段， 费用(每年2000～3000元)也可以承受，但并不是所有的男人都需要“精子银行”的帮助。
第五章 DNA的损伤与修复习题 一、单选题 1、紫外线照射使DNA 分子损伤后碱基之间形成二聚体, 其中最常见的形式是(D) A. C-C B. C-T C. T-U D. T-T E. U-C 2、DNA损伤后切除修复的说法中错误的是（A） A．切除修复包括有重组修复及SOS修复 B．修复机制中以切除修复最为重要 C．切除修复包括糖基化酶起始作用的修复 D．切除修复中有以UVrABC 进行的修复 E．是对DNA 损伤部位进行切除, 随后进行正确 3、胸腺嘧啶二聚体阻碍DNA合成的机制是（C） A．使DNA模板链断裂 B．修复机制中以切除修复最为重要 C．切除修复包括糖基化酶起始作用的修复 D．使两股DNA链间形成负超螺旋 E．使dNTP无法进入DNA合成链 4.紫外线照射对DNA分子的损伤主要是( 4 ) A．碱基替换 B.磷酸酯键断裂 C.碱基丢失 D.形成共价连接的嘧啶二聚体 5.关于大肠杆菌DNA聚合酶I下列说法错误的是(E) A．对复制及修复过程中的空隙进行填补 B．有5’→3’核酸外切酶活性 C．有3’→5’核酸外切酶活性 D．以dNTP为底物 E．有5’→3’核酸内切酶活性 6．下列能引起移码突变的是(D) A．点突变 B．转换同型碱基 C．颠换异型碱基 D．缺失 E．插入3个或3的倍数个核苷酸 7．紫外线照射造成的DNA损伤并形成二聚体主要发生在下列哪一对碱基之间(B) A．A－T B．T－T C．T－C D．C－C E．U－C 8．与DNA修复过程缺陷有关的疾病是(B) A．卟啉症 B．着色性干皮病 C．黄疸 D．痛风症 E．苯酮酸尿症 9．根据F．Crick中心法则，遗传信息的传递方式是(C) A．蛋白质→RNA→DNA B．RNA→DNA→蛋白质 C．DNA→RNA→蛋白质 D．RNA→RNA→DNA E．DNA→DNA→蛋白质10．亚硝酸盐引起分子的突变是(D) A．形成嘧啶二聚体 B．Glu→Gln C．A→G D．C→U E．碱基甲基化11．胸腺嘧啶二聚体阻碍DNA合成的机制是(A) A．DNA的合成将停止在二聚体处并使其合成受阻 B．使DNA聚合酶失活 C．使DNA模板链断裂 D．使两股DNA链间形成负超螺旋 E．使dNTP无法进入DNA合成链 12．镰刀状红细胞贫血与β链有关的突变是(E) A．插入 B．断裂 C．缺失 D．交联 E．点突变 13．比较真核生物与原核生物的DNA复制，二者的相同之处是(B)
小鼠胚胎/精子冷冻保种申请表 需要填写的资料： 说明： 1.*表示必须填写； 2.保种方式的选择：我们采用精子冻存和胚胎冻存的方法进行保种；假如为杂合子，雄性数量≥3 只并且可以和B6交配做净化，我们推荐安乐死一只雄鼠使用精子冻存的方式保种，可以有效控制保种周期，不受雌鼠排卵多少的限制。 3.保种对提供小鼠的要求： 精子冻存 冷冻精子需要提供的小鼠信息：阳性纯合子雄鼠，2-3只，12-18W（最佳），生育能力良好，在实验前7d内进行过成功交配，而在3d内未交配过；冻存2只/品系，20个麦管。 费用：200元/麦管 冷冻的流程和所需的时间： 1)提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 2)通过申请后安排实验，精子冻存后至少1周进行复苏检测实验（1麦管）。 3)等待代孕小鼠生仔（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，（一周内反 馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 精子复苏（除复苏检测外） a、外来精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻精信息（品系，数量），送达时间。
从接收之日起，1周内安排复苏实验 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 如需其他品系雌鼠，需从外单位订购。 b、动物中心精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1. 运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮充足。 2. 由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏精子平均成功率是40%。 胚胎冻存 品系内冻存需要提供的小鼠信息：雄鼠2-3只12-18W,雌鼠至少10只，3-4W或9-12W。正常情况下可冻存200枚胚胎左右。 费用3000元/品系。 与B6冻存：雄性小鼠，2-3只12-18W，中心提供雌性B6小鼠3-4W，30只。正常情况下可冻存500-600枚胚胎左右。 费用3000元/品系+B6费用40元/只。 c．冷冻流程和所需时间 提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 通过申请后一周左右安排实验，胚胎冻存采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，玻璃化冻存。胚胎冻存后至少1周进行复苏检测实验（1个冻存管，30 -50枚胚胎/管） 复苏回收的成活2-cell，采用输卵管移植到代孕母鼠体内，19.5天生仔，1-12天剪尾通知取回检测，（一周内反馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 胚胎复苏（除复苏检测外） a、外来胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻存胚胎信息（品系，数量）送达时间。 从接收之日起，1周内安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） b．动物中心胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 通过申请后1周左右安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：移植用受体单侧移植100元/只，双侧移植180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1.运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮 充足。 2.由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作 为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏胚胎平均成功率是60%。
DNA损伤修复通路 一． DNA损伤检验点与损伤修复及基因组稳定性_英文_刘巍峰 DNA 损伤检查点通路是高度的保守的细胞过程。它的很多元素在低等真核生物与多细胞高等生物之间有功能同源性。整个通路可以大致分分为三部分，即损伤感受器、信号传感器和信号效应器。磷脂酰肌醇 -3-OH 激酶样激酶、 ATM、ATR 的激活是通路激活的第一步。激活的 ATM 和 ATR，通过一类传感器媒介，激活效应激酶 CHK1 和 CHK2。停止或减缓细胞周期进程。 在无应力条件下， ATM以不活泼的同聚二聚体存在。基因组中的 DNA 双链断裂导致高级染色质结构的一些微妙变化，使 ATM 蛋白的构象变化，这个促进ATM单体的 1981 丝氨酸的分子间的快速磷酸化，引起二聚体解离。激活的单体作用于它的许多下游底物，如 p53 ，NBS1、BRCA1和 SMC1. 因此， DSB 那样的 DNA 损伤导致 ATM 激活通过两个不同的步骤：（ 1）染色质结构损伤部位的真实变化诱导快速的分子间自磷酸化和二聚体解体；（2）活化的 ATM 单体定位损坏部位以进一步作用于下游子，在 ATM 的定位过程中， MRN（MRE11- RAD50-NBS1 ）复合物发挥重要作用。它可以以独立于 ATM 的方式快速定位于双链断裂损伤点。最近的研究结果表明 MRN 的 NBS1 亚基可以直接与 ATM 相互作用。此外， MRN复合物累积在 DSB，可通过解散 DSB末端进一步刺激 ATM 激酶活性。 相比于 ATM 活动的快速增长在细胞暴露于电离辐射后，活性ATR激酶的变化不明 显。然而，已经证明了 ATR 通路是防止复制的起源过度激活的关键，即使没有任何外界的 DNA 损伤。此外， ATR敲除小鼠是致死的，暗示了 ATR在正常细胞功能中的重要作用。 DNA 复制、 DNA 重组和 DNA 修复等过程产生的单链 DNA 很快被复制蛋白 A （RPA）占据，它可与 ATRIP 亚基结合，以募集 ATR-ATRIP 复合物到 DNA 单链区域。招募的 ATR 现在可以在其底物上发挥作用如 RAD17 和CHK1。与在 ATM 通过增加自身活性来激活检查点通路不同， ATR 的功能的合适发挥很大程度上取决于它的位置。除了 RPA之外，有效的磷酸化 ATR下游底物的需要 RAD17-RCF2-5 复合体， PCNA类似物 Rad9-Hus1-Rad1 复合物和
DNA突变与损伤修复 一、DNA突变概念 DNA突变是指个别dNMP（脱氧单磷酸核苷）残基以至片段DNA在结构、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤。 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在。在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA对生命的重要性。另一方面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，正因为如此生物才会有变异、有进化。 二、DNA突变主要形式 1、自发性损伤 2、物理因素引起的损伤 3、化学因素引起的损伤DNA的损伤修复 三、DNA损伤修复机制 DNA损伤修复(repair of DNA damage)在多种酶的作用下，生物细胞内的DNA分子受到损伤以后恢复结构的现象。 DNA损伤修复的研究有助于了解基因突变的机制，衰老和癌变的原因，还可应用于环境致癌因子的检测。 1、光复活修复机制 紫外线可造成彼此相邻的嘧啶碱基形成二聚体（嘧啶二聚体会减弱了双链之间氢键作用，引起了DNA变形。如果生物体内修复系统失灵，则细胞走向死亡），该二聚体可被一种光裂解酶打开，恢复到正常碱基状态。 2、切除修复 （1）切除修复：切除修复是在DNA内切酶，DNA外切酶，DNA连接酶等共同作用下，将DNA分子受损伤部分切除，并以完整的一条链为模板，合成切除的部分使DNA恢复到正常结构的过程。 （2）DNA糖苷酶修复及AP核酸酶修复途径：自然状态下，DNA双链上的碱基特别是鸟嘌呤可发生自然脱落（37℃，20h一个哺乳动物细胞可自发脱鸟嘌呤10000个）若经诱变损伤更多。经糖苷酶作用产生大量AP位点（即无嘌呤或无嘧啶位点），AP核酸内切酶可识别细胞内AP位点，切开AP位点附近DNA链，然