ChIA-PET样品的制备和方法描述
细胞培养和染色质免疫沉淀
通常可以用以下五种细胞系作为RNA聚合酶ⅡChIA-PET分析的研究： MCF7 (ATCC# HTB-22), HCT116 (ATCC# CCL-247), HeLa (ATCC# CCL-2.2), K562 (ATCC# CCL-243) and NB4 (provided by Dr. Sherman Weissman, Yale University)。细胞采用常规培养，在对数生长期时进行收集。用1%甲醛室温旋转处理10mins后，加入0.2M甘氨酸中和，然后加入细胞裂解液和细胞核裂解液，获得交联的染色质。接着，将染色质用 Branson digital sonifier S450D超声仪进行超声处理，使之成为平均长度为300bp的片段，超声后的染色质用蛋白G磁珠孵育过夜，进行预纯化，以除去非特异性结合的DNA，与此同时，用RNA聚合酶Ⅱ的单克隆抗体8WG16（Covance，MMS-126R）孵育蛋白G磁珠过夜，使抗体结合在磁珠表面。次日，将预纯化后的染色质用抗体包被后的磁珠沉淀过夜，使磁珠与我们所需的目标染色质想结合。再用洗涤液将包被后的磁珠清洗几次，以除去非特异性的结合。最后，用洗脱液将结合到的ChIP-DNA从珠子上洗脱下来，用 Picogreen fluorimetry测定浓度，用q-PCR对DNA进行相对定量。
ChIA-PET文库的建立
免疫沉淀的染色质碎片接着用于ChIA-PET文库的建立方法我们已经在之前的研究中叙述过。简单来说，将带有抗体磁珠的染色质DNA碎片分为两等分，分别用不同DNA半连接子（A/B）连接，两个连接子除了中间的两个核苷酸不一样之外（连接子A是CG；连接子B是AT），其他部分的核苷酸序列完全相同，链接子可以超过DNA碎片的末端。在连接子进行连接后去除多余的序列，将两部分混合，两等分又会重新结合到一起发生邻近式连接，在这里不同染色质复合物的DNA碎片可以具有一样的连接子（A或是B）。在邻近连接时，如果同一个染色质复合物内的DNA碎片被相同的连接子一起连接，那么则会产生同源二聚体形式的连接产物（AA或者BB）。然而，如果连接反应发生在不同染色质复合物的DNA碎片之间，那么这样非特异性连接的产物将有50%的几率形成异源二聚体的形式（AB或者BA）。因此，这些异源二聚体的连接子可以作为非特异性连接的标志，可以用来评估每一次建立ChIA-PET文库发生非特异性连接概率的大小，并且这些非特异性连接的数据还可以用来作为后续的分析使用。在邻近连
接之后，获得的连接产物可以用来提取配对的末端标签（PET），这些末端标签的模板将被用来作Illumina GAll测序分析。
ChIA-PET文库的数据处理
ChIA-PET序列读数有专门的ChIA-PET工具进行处理，这是一个进过修饰后的专门为ChIA-PET数据所涉及的软件包。简单来说，非多余（non-redundant）的PET序列读数最先进行连接子条形码（barcode）组成的分析，定义为来源于非特异连接的产物——异源二聚体AB连接子（条形码为CG/AT），或者为来源于特异的连接产物——同源二聚体AA或者BB连接子（条形码为CG/CG或者AT/AT）。连接子的组成可以用作下游的噪音分析。接着，将连接子序列进行整理后，在人类基因组上（hg19）绘制出PET标签序列。为了进一步除去多余的PET序列，在基因组标记之后，PETs在基因组从头部到尾部的标签包含2bp的位置与不断减
关的序列和检测基因组之间的单核苷酸多态性（SNPs），测序误差有可能会发生，并且导致标签序列出现1或2bp的误差。
PET分类
PET测序的绘图与基因组相结合可能揭示出邻近连接产物的本质，无论是同一个DNA碎片两端之间产生的自连接产物还是两个DNA碎片之间的间连接产物，他们都被同一个染色质复合物通过蛋白的相互作用进行捕捉。因为染色质碎片的大小是已知的，范围在100bp到几个kb，绘图的起点以及PET序列两个标签之间的长度可以显示出这个PET是来源于自连接还是间连接。间连接的PETs可以分为两类：染色体内的PET——两个PET的标签定位于同一个染色体，染色体间的——两个PET的标签定位于不同的染色体。方便起见，我们将来源于自连接的PETs称为“自连接PETs”，定位在同一个染色体的间连接的PETs称为“染色体内PETs”，定位在不同染色体的间连接的PETs称为“染色体间PETs”。
RNA聚合酶Ⅱ的峰值检出（peak calling）
基因组中自连接PET序列的覆盖率（coverage）反应了RNA聚合酶Ⅱ染色质免疫共沉淀的特定位点的丰富程度，与ChIP-Seq反应蛋白在染色质的定位类似。我们采用与ChIP-Seq峰值检出程序MACS相同的方法来获取ChIA-PET数据的峰值检出。序列覆盖局部的顶点称为潜在峰值（potential peak）。潜在峰值的意义
在于评估Poisson分布的P值。这个P值与多假设检验采用B-H方法所得的错误发现率（FDR）一致。我们所得的最终峰值（final peak）的标准是：1，最小序列的覆盖率是5；2，FDR<0.05.
PET集（clusters）的相互作用
间连接PETs潜在反应了远程染色质的相互作用。然而，不可避免的是不同的来源都会存在技术上的噪音。为了进一步从非特异的相互作用信号中区分出这些真正的相互作用信号，我们推断，对于真正的、多重的相互作用PETs有可能会从同一个相互作用的区域产生。为了定义这样的染色质相互作用，绘制间连接的PETs定位图将会延长到1.5kb下游，并且这些PETs在两端覆盖形成了相互作用的PET集。这些称为一个PET集的PET反映了相关的两个位点之间的相互作用频率。这种相互作用之间统计学的显著性由超几何分布的P值来进行评估。超几何模型将与P值计算相关的锚区域（anchor regions）的标签数一并考虑，这样可以中和由于富含区域之间的随机连接而导致间连接PETs的潜在噪音升高的效应。P值与多假设检验用B-H方法所得的错误发现率（FDR）一致，FDR<0.05。
总结ChIA-PET数据处理的主要特征：
我们的ChIA-PET数据处理主要按照ChIA-PET工具的步骤。有以下几点改变：1、改变了连接子的序列和连接子的筛选（filtering）过程
连接子序列是 GTTGGATAAGATATCGCGG和GTTGGAATGTATATCGCGG。新的连接子筛选程序见
https://www.doczj.com/doc/9113396097.html,.sg/downloads/chia-pet-tools
2、改变了PET集
之前，间连接PETs富含区域最先在ChIA-PET工具中出现，现在PET集检测了PETs的重叠
3、后筛选
PET集将由以下标准筛选出：
●PET计数<=2；
●FDR>=0.05;或
●范围<8Kb
剩下的PET集将保存在EXCEL表格中，留作后续分析。
（ChIA-PET Protocols — ChIA-PET https://www.doczj.com/doc/9113396097.html,.sg/protocols）
DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 （<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
高通量测序错误总结 一、生信分析部分 1）Q20/Q30 碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。Q30代表碱基的正确判别率是99.9%，错误率为0.1%。同时我们也可以理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。Q20代表该位点碱基的正确判别率是99%，错误率为1%。对于整个数据来说，我们可以认为100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q值在30以上。中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q值在20-30之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的RNA-seq分析，一般要求碱基质量在Q在Q20以上就可以了。但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30以上。 一般来说，测序质量分数的分布有两个特点： 1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。 2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。 在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要做剪切（trimming），根据生信分析的目的不同，要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。 2）序列的平均质量 这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30，可以判断序列质量较好。如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显着数量的低质量序列。但如果曲线如右边的图所示，在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。 3）GC含量分布 这个是GC含量分布报告图。GC含量分布检查是检测每一条序列的GC含量。将样品序列的GC 含量和理论的GC含量分布图进行比较，用来检测样品数据是否有污染等问题。理论上，GC含量大致是正态分布，正态分布曲线的峰值对应基因组的GC含量。如果样品的GC含量分布图不是正态分布，如右图出现两个或者多个峰值，表明测序数据里可能有其他来源的DNA序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。这种情况下，需要进一步确认这些污染序列的来源，然后将污染清除。 4）序列碱基含量
DNA测序结果分析比对（实例） 关键词：dna测序结果2013-08-22 11:59来源：互联网点击次数：14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例： CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称：Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图： .ab1文件打开后如下图： 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱
基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：
说明： 第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑：大汉昆仑王)
20个测序常见的问题 1．为什么需要新鲜的菌液？ 首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？ 如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ （1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果； (2）必须进行胶回收纯化； (3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？ PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。 7．PCR产物直接测序的好处？ （1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况； （2) 省去克隆的实验费用和时间； （3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障； （4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？ 对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？ 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加E，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。 质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。
ChIP-Seq分析常见问题集锦 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。 Roche GS FLX Titanium、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID4这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。 ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。 ChIP-Seq有什么样品要求？ 答：（1）请提供浓度≥10ng/ul、总量≥200ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。 （2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。附阳性和阴性对照。（3）样品请置于1.5ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm 封口。在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。 ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？ 答：第一，ChIP-Seq能实现真正的全基因组分析。目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq媲美的分辨率；第三是所需样本数量。ChIP-chip需要多达4~5μg的起始样本，在杂交之前需要进行LM-PCR，但可能导致背景增高，竞争性扩增等导致假阳性。而ChIP-Seq仅需要纳克级起始材料，如SOLiD起始材料可低至20ng。两者技术特点如下： 研究方法CHIP-on-chip CHIP-Seq 分辨率30~100bp1bp 覆盖范围受芯片容量限制，只能选择性地扫 描特定区域，无法覆盖全基因组只要测定的序列（Reads）能够定位到基因组上，就能获得全部基因组信息 缺陷探针和非特异性区域杂交测序数据会有一些GC含量偏向 性价比只能研究在基因组上广泛存在的目 的位点（Broading bingding）可以扫描全基因组；可以研究在基因组上存在的稀有目的位点（Sharp bingding） 需要的DNA 量 高低（10~50bp）动态量程弱信号会被遗弃；强信号会饱和没有局限 选择数据产 出量 不可以可以
高通量基因组测序中，什么是测序深度和覆盖度？ 1G=1024M 测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。(测序深度=总数据量20M/基因组大小2M=10X) 覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 1、全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因 序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)，插入缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV， 技术路线 提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段(0.2~5Kb)，加上接头, 进行cluster制备(Solexa)或E-PCR (SOLiD)，最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对插入片段进行重测序。图1-1，以SOLiD为例，说明整个实验方案。
也称目标外显子组捕获，是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel 等具有较大的优势。 外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB。
测序结果的判读 测序结果为.abi格式，可用软件chrosmas打开，一种颜色的峰代表一个碱基，峰的高低表信号的强弱。一个正常的N表示机器没法判读是哪种碱基，原因是：杂峰的信号高于机器默认的值，机器会认为该处有两个峰，因此不能判断确定是哪个峰，需要人工判读。以下三种情况会出现N：有杂合子，有杂峰，反应已结束。
原因：测序产物纯化不够 注意：染料峰位于序列的前100 碱基以内;酒精峰位于序列的220 ~ 320 碱基之间
产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒 原因：测序反应失败。 解决办法：改进条件，重做反应。注意两个关键因素：引物与模板之间的比例：3.2 pmol: 200 ng。模板DNA 的纯度和用量：1.6 ~ 2.0
原因：残余的Dye 太多，纯化不够。有测序反应，但效率低下信号太弱 解决办法：纯化充分。避开引物峰，确定新的分析起点 1、PCR产物测序时出现重叠峰 问题图1(模板中有碱基缺失，往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码) 解决方法：将PCR产物克隆到质粒(如T载体)中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE 纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。 问题图2(PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一)
解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序，便可解决。 问题图3(测序引物有碱基缺失) 测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'端缺失)，和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。 解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化 2、克隆测序时出现峰形重叠
附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列：所有含样品barcode（标签序列）的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注：合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为： 2.优质序列统计 优质序列：有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为：
3.各样本序列数目统计： 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为： 4.OTU生成： 根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。 5.稀释曲线（rarefaction 分析） 根据第4条中获得的OTU数据，做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例：
6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数，包括： ?丰度指数：ace\chao ?多样性指数：shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例： 注：默认分析以上所列指数，如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为：0.03。 例图：
8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式（其它格式请注明）。 例图： 9.Specaccum物种累积曲线（大于10个样品） 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此，通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分，在抽样量充分的前提下，运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。
D N A测序结果中常见 的几个问题 公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别 这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。 2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂 由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。 3 、测序结果怎么找不到我的引物序列 如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。 4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点 可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。 5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事
首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。 6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果 序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。 7 、测序结果为什么与标准序列有差别 原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。当然尽管我们有时做了最大努力，但还是保证不了和文献序列完全一致，但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。 8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别 PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先，PCR 扩增过程中可能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非100%。 9 、有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！ 如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体
测序常见问题及解决策略 一、PCR常见问题 1.假阴性，不出现扩增条带 PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。 2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。 3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩 增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 2.假阳性 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有： 1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短 或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组
或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3.出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。 4.出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。 二、一代测序结果常见问题及分析 原始数据图片为：
测序过程常见问题分析与解答 1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？ 答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。 2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？ 答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。 3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？ 答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。 4、与测序引物有关的问题
北京大学生科院/CLS生物信息平台 RNA-Seq测序数据分析服务流程 （试运行） 2015.3 平台联系人：李程（lch3000@https://www.doczj.com/doc/9113396097.html,） 文档撰写：张超
Table of Contents 1. 测序质量评估 (3) 1.1 测序数据过滤 (3) 1.2 质量值分布 (3) 1.3 GC含量分布 (4) 2. 参考序列比对 (4) 3. 基因表达水平 (6) 3.1 基因表达水平定量 (6) 3.2 基因表达水平分步 (6) 3.3 生物学重复相关性分析 (6) 3.4 样本间层次聚类及PCA分析 (7) 4. 差异基因分析 (7) 4.1 基因表达标准化 (7) 4.2 差异基因列表 (8) 4.3 差异基因可视化 (8) 4.4 差异基因聚类 (9) 5. 差异表达基因功能分析 (10) 5.1 GO富集分析 (10) 5.2 信号通路富集分析 (10) 5.3 癌基因功能注释 (11) 6.基因结构差异分析 (11) 6.1 可变剪切分析 (11) 7. SNP分析 (12) 7.1 SNP检测 (12) 7.2 SNP 筛选 (12) 7.3 GO/KEGG富集 (12)
1. 测序质量评估 通过测序的数据进行进行质控，保证数据质量适合下游分析。这里我们使用fastqc和RNA-SeQC来对数据进行质量评定。 1.1 测序数据过滤 测序得到的原始下机数据往往有许多问题，不能直接使用，通常会经过以下过滤，尽量保证测序数据的质量。 a.去除带测序接头的测序序列（reads）； b.去除低质量的reads 1.2 质量值分布 按照现有的测序技术（illumina平台）单碱基的错误率应控制在1%以下,即质量值在20以上。 横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基质量值 质量值与错误率的关系：Q =-10log10(e)；其中Q phred为测序碱基质量值，e为测 phred 序错误率。
1基因数据库的建立 1.1建立病原体数据库 肺炎的发生是有很多原因所致。病因可分为以下几类：①细菌性肺炎，可分为肺炎链球菌肺炎、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性莲球菌、肺炎克雷白杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌肺炎等。②非典型病原体所致肺炎，如军团菌、支原体和衣原体等。③病毒性肺炎，如冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。④真菌性肺炎，如白色念珠菌、曲霉、放线菌等。⑤其他病原体所致肺炎，如立克次体（如Q热立克次体）、弓形虫（如鼠弓形虫）、原虫（如卡氏肺囊虫）、寄生虫（如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）等。⑥理化因系所致的肺炎如放射性损伤引起的放射性肺炎，胃酸吸入引起的化学性肺炎，对吸入或内源性脂类物质产生炎症反应的类脂性肺炎等。 凡是能引起肝脏损害、出现肝功能异常的肝脏炎症性疾病，称之为肝炎。它是一类严重危害人体健康的疾病。我们常说的肝炎，主要是指病毒性肝炎。据近几年科学研究，因其致病病原体的不同而有甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、己型肝炎、庚型肝炎等。另外，因大量、长期饮酒引起的肝炎，叫做酒精性肝炎；对肝脏有损害的药物引起的叫做药物性肝炎；还有由于机体免疫功能紊乱引起的叫做自身免疫反应性肝炎。 本项目不考虑由理化原因引起的肺炎和肝炎疾病，因此，只需建立目前已知的所有肺炎和肝炎致病基因的数据库。 1.2建立人体常见的微生物基因组数据库 人体有四个大的细菌储存库，即皮肤、口腔、结肠、泌尿生殖道。种类繁多，多与人类能和平共处，少数是条件致病菌。论个难以数计，论重量，据估计每个活的个体可达3-4公斤。 人类体表和肠道是无数微生物的居所。Elizabeth Costello及其同僚对多达27个身体部位的微生物进行了调查，其中包括肠道、口腔、耳朵、鼻子以及多达18个区域的皮肤表面。研究人员还发现，某些皮肤部位，如食指或膝盖的背侧常常比肠道或口腔能容留更为多元的微生物。他们的数据所强调的事实是，我们身体的个体化的微生物随着时间的推移仍然保持着相对的稳定，而且它们展现了在我们身体各个位置生长的可预测的模式。 人体微生物基因组计划又称第二人类基因组计划，已由美国国立卫生研究院资助，于2007年开始启动。研究人体微生物对于疾病的预防和治疗有重大意义。 1.3人体全基因组数据库 人类基因组计划于20世纪80年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体23对染色体由3×109
测序常见问题分析实例 峰型整齐，在某一点前后突然变乱 信号迅速衰减 信号极弱或无信号 整条序列信号杂乱 峰型整齐，在某一点前后突然变乱： 图1 PolyT特殊结构 上图是我们的一个质粒测序样品，用T7通用引物进行测序，从图中可以看出，在约285bp 的polyT结构后，序列明显变乱。主要原因是在polyT结构后，测序酶容易在模板上滑动，导致polyT结构后的峰型变得杂乱。此类样品通过对其反向互补序列进行测序，一般可以得到好的结果。 图2 移码突变双模板的存在 上图是我们的一个质粒测序样品，用M13+通用引物进行测序，从图中可以看出，该序列在290bp后序列明显有两套峰存在。造成该现象的原因可能有如下几条： 序列发生缺失突变
插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在 PCR产物用T载体进行克隆时，PCR片段可以以两个方向克隆进T载体 所挑克隆不纯 两个大小相近的PCR产物同时存在，无法纯化分开 解决的办法： 对于质粒模板，重新挑选克隆，或从另一段进行测序 对于PCR模板，用另一端引物进行测序，或克隆后进行测序 图3 等位基因双模板的存在 上图是针对一个质粒进行的测序结果，从图中可以明显看出，在序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，但是没有发生移码突变。该情况与图2所举的例子有所不同，该情况下从反向进行测序仍然不可能得到好的测序结果。该种情况下只能采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序。 信号迅速衰减返回 图4 CTT重复结构 如上图，在大约260碱基后出现了一个严重的CTT重复结构，导致信号迅速衰减，很难得到跨过该区后的信息。该种情况下，只能从另一端进行测序，一般来说，AAG重复结构不会太影响测序。也可以对片段进行亚克隆，使每个片段大小不大于200bp，然后再进行测序。不过，该方法要麻烦很多。
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间
问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 +浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR
2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多
对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
二代测序数据分析软件包大全 Integrated solutions * CLCbio Genomics Workbench - de novo and reference assembly of Sanger, Roche FLX, Illumina, Helicos, and SOLiD data. Commercial next-gen-seq software that extends the CLCbio Main Workbench software. Includes SNP detection, CHiP-seq, browser and other features. Commercial. Windows, Mac OS X and Linux. * Galaxy - Galaxy = interactive and reproducible genomics. A job webportal. * Genomatix - Integrated Solutions for Next Generation Sequencing data analysis. * JMP Genomics - Next gen visualization and statistics tool from SAS. They are working with NCGR to refine this tool and produce others. * NextGENe - de novo and reference assembly of Illumina, SOLiD and Roche FLX data. Uses a novel Condensation Assembly Tool approach where reads are joined via "anchors" into mini-contigs before assembly. Includes SNP detection, CHiP-seq, browser and other features. Commercial. Win or MacOS. * SeqMan Genome Analyser - Software for Next Generation sequence assembly of Illumina, Roche FLX and Sanger data integrating with Lasergene Sequence Analysis software for additional analysis and visualization capabilities. Can use a hybrid templated/de novo approach. Commercial. Win or Mac OS X. * SHORE - SHORE, for Short Read, is a mapping and analysis pipeline for short DNA sequences produced on a Illumina Genome Analyzer. A suite created by the 1001 Genomes project. Source for POSIX. * SlimSearch - Fledgling commercial product. Align/Assemble to a reference * BFAST - Blat-like Fast Accurate Search Tool. Written by Nils Homer, Stanley Nelson and Barry Merriman at UCLA.