李东霞 等/生物法合成戊二胺研究进展
Chinese Journal of Biotechnology
https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,/cjbcn February 25, 2014, 30(2): 161?174 DOI: 10.13345/j.cjb.130256 ?2014 Chin J Biotech, All rights reserved
Received : May 18, 2013; Accepted : August 20, 2013
Supported by : National Natural Science Foundation of China (No. 21176190), Key Technology Research and Development Program of Tianjin, China (No. 11ZCKFSY00900), Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (No. 11JCYBJC09600), Changjiang Scholars and Innovative Research Team (No. IRT1166).
Corresponding author : Ming Li. Tel: +86-22-60601958; Fax: +86-22-60602298; E-mail: liming09@https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,
国家自然科学基金(No. 21176910), 天津市科技支撑计划 (No. 11ZCKFSY00900), 天津市应用基础及前沿技术研究计划(No. 11JCYBJC 09600), 长江学者与创新团队项目(No. IRT1166) 资助。
生物工程学报
生物法合成戊二胺研究进展
李东霞，黎明，王洪鑫，王舒雅，路福平
天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 国家工业酶工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457
李东霞, 黎明, 王洪鑫, 等. 生物法合成戊二胺研究进展. 生物工程学报, 2014, 30(2): 161?174.
Li DX, Li M, Wang HX, et al. Progress in biosythesis of diaminopentane. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 161?174.
摘 要: 随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。世界上每年消耗大量石化资源来源的聚
酰胺，戊二胺作为聚酰胺的重要组成单体，生物法合成戊二胺具有经济学和生态学双重意义。目前, 生物法合成戊二胺的工程菌主要有谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌，文中从微生物中戊二胺的代谢、戊二胺合成途径的关键酶和转运蛋白、戊二胺生产最佳代谢途径和戊二胺产量的预测、代谢工程研究进展等方面综述了生物法合成戊二胺的最新研究现状和进展，并对其前景进行了展望。
关键词: 戊二胺，谷氨酸棒状杆菌，大肠杆菌，赖氨酸脱羧酶，尸胺转运蛋白
综 述
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2014 Vol.30 No.2
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Progress in biosythesis of diaminopentane
Dongxia Li, Ming Li, Hongxin Wang, Shuya Wang, and Fuping Lu
Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology , Ministry of Education , National Engineering Laboratory for Industrial
Enzymes , Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology , College of Biotechnology , Tianjin University of Science and Technology , Tianjin 300457, China
Abstract: Air pollution and global warming are increasingly deteriorating. Large amounts of polyamides derived from fossil fuel sources are consumed around the world. Cadaverine is an important building monomer block of bio-based polyamides, thus biotechnological processes for these polymers possess enormous ecological and economical potential. Currently, the engineered strains for biological production of cadaverine are Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli . We review here the latest research progress of biosynthesis of cadaverine including metabolism of cadaverine in microorganisms, key enzymes and transport proteins in cadaverine synthesis pathway, optimum pathways and cadaverine yields.
Keywords: cadaverine, Corynebacterium glutamicum , Escherichia coli , lysine decarboxylase (LDC), cadaverine-lysine antiporter (CadB)
戊二胺(Diaminopentane)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺或尸毒素，是生物胺类 (包括腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等) 中的一种[1]。1885年，德国柏林的医师Ludwig Brieger 在腐败的尸体中首次发现该胺类，并以此得名尸胺[2]。在细胞内，戊二胺是赖氨酸合成途径的延伸反应产物，是赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)催化赖氨酸脱羧产生的 (图1)。戊二胺具有许多重要的生理功能，如戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”和一些严格厌氧的革兰氏阴性菌肽聚糖的主要组成成
分[3-5]；戊二胺在关闭孔蛋白通道和保护大肠杆菌免受氧的毒害方面也起着重要的作用[6-8]；内源性戊二胺的分泌以及胞内高浓度戊二胺积累可导致外膜渗透性降低，抑制某些抗生素如头孢霉素类抗生素的作用[9-11]。
戊二胺在农业、医学和工业上具有广泛的应用。在农业上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促进果实发育，提高果实的产量[12-13]；在医学上，它也可作为一种有效治疗痢疾的药物[14]；在工业上，戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙[15]。
图1 赖氨酸脱羧反应
Fig. 1 Reaction of lysine decarboxylate.
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每年全球约生产600万t 聚酰胺，其中尼龙6.6 (即聚酰胺6.6, Polyamide 6.6, PA 6.6) 是聚酰胺类产品中开发最早、产量最大、应用最广的产品之一，被广泛应用于航空航天、汽车部件、机械零部件、电子电器和包装材料领域中，在胶粘剂及化妆品领域也得到了广泛应用[16]。尼龙 6.6是由己二酸和己二胺按摩尔比1：1聚合的产物。目前，己二酸可利用生物催化技术合成，但己二胺的合成仍然依赖于石油化工产品[17]。随着国际油价的飙升和石油资源的枯竭以及石油资源的大量消耗导致大气CO 2含量的迅速升高和环境污染，人们试图寻找一种能利用生物方法生产己二胺的替代物，从而用一种可再生资源替代石油来生产尼龙[18]。戊二胺是赖氨酸脱羧的产物，与己二胺互为同系物，可代替己二胺用来合成新型尼龙 (图2)。在工业上，戊二胺可以分别与己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合形成新型材料聚酰胺5.6(Polyamide 5.6，PA 5.6)、聚酰胺5.4[19-21]和聚酰胺5.10[22]。PA 5.6具有重要的工业用途，与PA 6.6一样具有良好的机械强度、较高的熔点和耐各种有机溶剂的特性，可以替代PA 6.6使用[23]。聚酰胺5.10材料性能极佳，具有高熔点(215 ℃)、低吸水率(1.8%)、低密度(1.07 g/cm 3)等优点。由于己二酸、琥珀酸已经可以通过微生物合成，癸二酸也可以从蓖麻油来制取。因此，戊二胺的生物合成成为合成新型材料聚酰胺的一个关键问题，下文将阐述生物法合成戊二胺的最新研究进展。
1 微生物中戊二胺的代谢
微生物中戊二胺的代谢包括戊二胺的合成、降解、吸收和分泌。微生物中存在两种完全不同的赖氨酸合成途径：一种是始于α-酮戊二酸和乙酰-CoA 的α-氨基己二酸途径 (AAA)，另一种是始于天冬氨酸的二氨基庚二酸途径 (DAP)。第一种途径主要存在于高等真菌和古生菌中，某些细菌如嗜热栖热菌属中也存在该途径；第二种途径主要存在于细菌和植物中，而且这两个途径没有直接的进化关系[24]。
1.1 大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中戊二胺的代谢途径
戊二胺是通过赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成的。大肠杆菌能够直接合成戊二胺，谷氨酸棒状杆菌虽然不能直接合成戊二胺，但它能高效合成戊二胺的前体，即赖氨酸脱羧酶的底物赖氨酸，并且二者合成赖氨酸的途径类似 (图3)[25]。如果在谷氨酸棒状杆菌中表达赖氨酸脱羧酶，谷氨酸棒杆菌也能像大肠杆菌一样直接合成戊二 胺[26]。大肠杆菌中赖氨酸的合成途径从TCA 循环的中间代谢物草酰乙酸(Oxaloacetate)开始，需要连续十步的酶反应。前3步生成代谢的节点中间物天冬氨酸半醛(Aspartic acid semialdehyde)，由它进一步合成L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸。L-赖氨酸经赖氨酸脱羧酶的催化脱羧生成戊二胺。在大肠杆菌中，存在3种天冬氨
图2 PA 5.6反应方程式
Fig. 2 Chemical structure and production of polyamide 5.6 using cadaverine and adipic acid from renewable resources.
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图3 大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中尸胺的代谢途径 (左图为大肠杆菌中，右图为谷氨酸棒状杆菌中。粗体箭头表示基因过表达活性增强，箭头上带有X 表示该基因被删除，虚线表示该途径被弱化)
Fig. 3 Metabolic pathway of cadaverine in E. coli and C. glutamicum . The left is in E. coli and the right is in C. glutamicum. Thick arrows indicate increased activity by overexpression, arrows with blue X’s indicate genes that are knocked out, dashed line indicates attenuation.
酸激酶(EC 2.7.2.4)：LysC 、ThrA 和MetL ，它们是
催化天冬氨酸磷酸化成天冬氨酰磷酸的同工酶。
其中天冬氨酸激酶(ThrA)Ⅰ[27]、天冬氨酸激酶Ⅱ(MetL)[28]是双功能酶，它们同时也具有高丝氨酸脱氢酶活性，能催化分支中间产物天冬氨酸半醛生成高丝氨酸，从而使碳流流向合成苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的分支途径。天冬氨酸激酶Ⅲ (LysC) 是赖氨酸合成途径中的特异关键酶[29]。而在谷氨酸棒状杆菌中，只有一种天冬氨酸激酶 (LysC)。此外，谷氨酸棒状杆菌中既可以通过二氨基庚二酸脱氢酶 (Ddh, EC 1.4.1.16) 直接催化四氢二吡啶二羧酸转化为二氨基庚二酸，也可以通
过DapDCEF 四步催化完成转化，而在大肠杆菌中该过程要经历DapDCEF 四步催化才能完成。大肠杆菌中赖氨酸合成的各个步骤都受赖氨酸调控，既包括对天冬氨酸激酶Ⅲ基因 (lysC )、天冬氨酸半醛脱氢酶基因 (asd )、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB )、四氢二吡啶琥珀酸酶基因 (dapD ) 和二氨基庚二酸脱羧酶基因 (lysA ) 的转录阻遏，又包含对天冬氨酸激酶Ⅲ (LysC) 和二氢甲基吡啶酸合成酶 (DapA) 催化的反馈抑制作用[30]。
除了戊二胺合成途径，戊二胺的代谢还受其降解和转运的调控[31]。尸胺-赖氨酸反向转运蛋白CadB 既可以依靠离子动力势摄取戊二胺，又可以
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分泌戊二胺。大肠杆菌中戊二胺的利用和降解途径，除了编码腐胺/尸胺氨基转移酶的SpeE 催化戊二胺为氨丙基戊二胺之外，精胺乙酰转移酶SpeG 催化戊二胺为N-乙酰戊二胺，戊二胺转氨酶YgjG 催化戊二胺为氨基戊醛，腺嘌呤脱氨酶PuuA 催化戊二胺的谷氨酰基化[32]。在假单胞菌中，戊二胺通过氨基转换作用代谢为α-哌啶，进一步氧化为δ-氨基戊酸 (AMV)[25]。在谷氨酸棒状杆菌中，戊二胺也可以和乙酰-CoA 作用生成乙酰戊二胺。在一些物种中，戊二胺也是氨基丙酸化和乙酰化的底物
[33]
。
1.2 大肠杆菌中戊二胺诱导合成的调控机制
大肠杆菌中有两种赖氨酸脱羧酶：诱导型酶CadA [34-35]和组成型酶LdcC [36-37]，它们都需要磷酸吡哆醛作为辅助因子。Fritz 等建立了大肠杆菌中戊二胺诱导合成的戊二胺操纵子调控机制 (图4)[38]。
戊二胺操纵子包括诱导型启动子P cad 、赖氨酸脱羧酶基因cadA 和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因cadB ，戊二胺操纵子上游是其调节基因cadC [34]。戊二胺的合成受pH 值和赖氨酸浓度调节。在低pH 值、高赖氨酸浓度条件下，cadC 基因被激活，其产物作用于P cad ，启动cadA 、cadB 基因表达合成赖氨酸脱羧酶CadA 和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白CadB [31]。CadA 利用细胞内的质子和赖氨酸合成戊二胺和CO 2，同时将合成的戊二胺转运至细胞外。cadC 基因上游有编码赖氨酸渗透酶的基因lysP ，赖氨酸渗透酶基因lysP 并不是戊二胺操纵子的组成成分，但它编码的蛋白LysP 能抑制CadC 的活性。高浓度的赖氨酸可以抑制LysP 蛋白对CadC 活性的抑制作用[37]。高浓度戊二胺对cadC 基因表达具有抑制作用，还可导致细胞膜孔蛋白的关闭[9]，影响细菌的正常生长。
图4 大肠杆菌中Cad 系统的调控模型[38]
Fig. 4 Regulation Model of the Cad System in E. coli (simplified)[38].
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2 戊二胺合成途径的关键酶和转运蛋白
2.1 赖氨酸脱羧酶
赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成戊二胺，是戊二胺合成途径中最关键的酶。赖氨酸脱羧酶存在于大肠杆菌Escherichia coli 、蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei 、耐碱芽胞杆菌Bacillus halodurans 、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus 、尸杆菌Bacterium cadaveris 、伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamensia 、青紫色素杆菌Chromobacterium violaceum 、霍乱弧菌Vibrio cholerae 、毛链霉菌Streptomyces polosus 等[36,39-43]
大多数微生物中。赖
氨酸脱羧酶也存在于高等植物中，例如黄瓜、家
山黧豆等
[43]
。目前，已经分别从大肠杆菌、蜂房
哈夫尼菌、反刍动物月形单胞菌Selenomonas ruminantium 、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 和鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri 等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因
[44]
。其中对来自
于大肠杆菌中的两种脱羧酶的特性研究较为清楚。
大肠杆菌中有两种赖氨酸脱羧酶：诱导型酶CadA
[34-35]
和组成型酶LdcC
[36-37]
，它们都需要磷酸
吡哆醛作为辅助因子。CadA 的最适pH 是5.5，在pH 8.0时完全失活；LdcC 的最适pH 是7.6，在广泛的pH 范围内均有活性
[36-37]
。在它们各自的最适
pH 条件下，LdcC 的酶活性高于CadA ，尽管LdcC 和CadA 的最适温度都是52 ℃，但是，CadA 在高温下比较稳定，在70 ℃时仍能保持稳定，而LdcC 从37 ℃开始，随着温度升高而逐步失活[37]。厌氧环境下cadA 在赖氨酸存在的情况下通过低pH (5.5) 诱导，表达达到最高水平，尸胺的分泌中和了胞外培养基的pH [34-35]。
多数文献认为，ldcC 是组成型表达，且在菌体中其表达水平很低[36]；但也有文献认为，ldcC 不是组成型表达，而是被某种因子抑制，正常条件下转录很弱，mRNA 不稳定[37]。蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc
为组成型表达，虽然文献中没有直接来自于蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶的最适温度和最适pH 值，但是，固定化法产该酶的细胞制备1, 5-戊二胺时使用的温度为37 ℃, pH 为5.0[45]。不同来源的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列一致性比较高，大肠杆菌的ldcC 与cadA 以及来自于蜂房哈夫尼菌和鼠伤寒沙门氏菌的ldc 基因编码的氨基酸序列相比，相似性分别为69.4%、68.6%和68.9%。大肠杆菌的CadA 和蜂房哈夫尼菌的Ldc 氨基酸序列相似性为80%，然而只有41%序列具有相同的密码子。而且它们都表现出特定的底物专一性，只能对赖氨酸进行脱羧反应[44]。
来自于反刍动物月形单胞菌的ldc 基因的ORF 长1 182 bp ，编码393个氨基酸，形成的赖氨酸脱羧酶由两个相同的单体构成[46]。该基因编码的赖氨酸脱羧酶能够同时催化赖氨酸和鸟氨酸脱羧，而且对这两个底物具有相似的K m 和V max 值。但是在该酶的催化结构域里，催化赖氨酸脱羧和催化鸟氨酸脱羧的比率是0.83。该酶和其他已经报道的细菌来源的赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶几乎没有氨基酸序列的相似性，但与真核生物的鸟氨酸脱羧酶的氨基酸序列大约有60%的相似性[4]。
目前已经克隆的赖氨酸脱羧酶序列很多，尽管缺乏与它们的酶学性质有关的报道，但从构建的系统进化树来看，赖氨酸脱羧酶分属于两个大的类群，其中来源于蜂房哈夫尼菌和大肠杆菌K12的赖氨酸脱羧酶属于一个大的类群，其余来源的赖氨酸脱羧酶来源于另一个大的类群 (图5)。
2.2 赖氨酸-尸胺反向转运蛋白
赖氨酸-尸胺反向转运蛋白CadB (Cadaverine- lysine antiporter)是一种转运戊二胺和赖氨酸的跨膜蛋白，与PotE(腐胺-鸟氨酸反向转运蛋白)[47-50]和AdiC(胍丁胺-精氨酸反向转运蛋白)[51-52]一样，
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图5 赖氨酸脱羧酶系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of lysine decarboxylase.
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都属于APC 超家族转运蛋白 (Amino acid/polyamine/ organocation superfamily of transporters)[53]，对菌体生长具有重要影响。cadB 基因长1 335 bp ，与cadA 组成cad 操纵子，编码444个氨基酸[34]。大肠杆菌中戊二胺的浓度不只是通过生物合成来维持，也可以通过摄取、分泌、降解进行调节[31]。由于赖氨酸脱羧酶是胞内酶，合成的戊二胺若在细胞内积累，对细胞具有毒性[54]。Soksawatmaekhin 等[31]对CadB 的功能进行了详细研究，表明CadB 在细胞中同时具有分泌和吸收功能，既可以经过质子动力摄取戊二胺，也可以进行赖氨酸-戊二胺的逆向转运，从而分泌戊二胺。尸胺吸收和分泌的K m 值分别为20.8、303 μmol/L 。在中性pH 值下，如果细胞内多胺不足，细胞可以通过CadB 少量摄入戊二胺；在酸性pH 值下，CadA 催化赖氨酸形成戊二胺，CadB 将合成的戊二胺转运到细胞外，维持细胞内外戊二胺的平衡。CadB 和CadA 对于细胞在酸性pH 值下的生长和对酸性的耐受方面具有重要作用。
Soksawatmaekhin 等[54]还进一步鉴定出CadB 上与戊二胺吸收和分泌相关的氨基酸残基：Tyr 73、Tyr 89、Tyr 90、Glu 204、Tyr 235、Asp 303和Tyr 423强烈影响戊二胺的吸收和分泌；Trp 43、Tyr 57、Tyr 107、Tyr 366和Tyr 368主要影响戊二胺的吸收；Arg 299主要影响戊二胺的分泌，说明Arg 299涉及赖氨酸羧基的识别；Cys 370的巯基不仅对戊二胺的氨基识别是必需的，可能还涉及H +的识别。而且，同时涉及戊二胺吸收和分泌、或者仅涉及戊二胺分泌的氨基酸残基都位于细胞膜的细胞质一侧，而仅涉及尸胺吸收的氨基酸残基位于细胞膜的周质空间一侧。Tomitori 等[55]还利用已知的AdiC 晶体模型模拟了CadB 与PotE 的结构，三者结构极其相似，只是与底物结合位点的宽度因底物大小而不同。这些研究为CadB 的功能改造奠定了基础。
谷氨酸棒状杆菌不能合成戊二胺，因此不存在专一的戊二胺转运蛋白，转运赖氨酸的转运蛋白LysE 也不能转运戊二胺。Kind 等[56]研究表明，当在谷氨酸棒杆菌中合成戊二胺时，有35种候选基因的表达量上升，其中编码一种渗透酶的cg2893基因的表达量增加了2.6倍。当该基因被删除时，戊二胺的分泌降低了90%，而过表达该基因时，戊二胺的产量可提高20%。因此，渗透酶Cg2893可能具有转运戊二胺的功能。cg2893基因长1 485 bp ，编码494个氨基酸，其核苷酸序列和cadB 的相似性为69.42%，其氨基酸序列与CadB 的相似性为67%。该基因的发现为在谷氨酸棒杆菌中研究戊二胺的合成和转运提供了理论 依据。
3 戊二胺生产最佳代谢途径和产量的预测
计量网络模型可以通过模拟预测谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌生产戊二胺的潜力，该模型以两种微生物的基因组序列为基础进行评估[57]。使用基础通量模型分析可以推导出生产戊二胺的最大理论产量、最佳途径、最有前途的目的基因[58]。谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌利用不同的代谢途径优化戊二胺的生产[57]。谷氨酸棒杆菌大量利用戊糖磷酸途径，而此途径在大肠杆菌中几乎未参与戊二胺的合成。合成赖氨酸时，谷氨酸棒杆菌利用特异性的脱氢酶分支途径，而流向三羧酸循环的通量为零，相反，大肠杆菌中只使用需要大量通量流向三羧酸循环的琥珀酰途径。预测的谷氨酸棒状杆菌生产戊二胺最高产量是0.43 g/g (0.75 mol/mol)，大肠杆菌则是0.49 g/g (0.84 mol/mol)。这些数值远远超过了目前所达到的生产水平，说明我们仍有很大的优化空间去生产戊二胺。大肠杆菌中，转氢酶 (EC 1.6.1.1-2) 催化NAD +和NADPH 与NADH 和NADP +之间相互转化的线粒
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体酶，在网络模型上删除转氢酶时预测产量降低至0.40 g/g 。反之，在网络模型中添加转氢酶时，预测的谷氨酸棒杆菌最高产量则增加为0.49 g/g 。因此，转氢酶在两种微生物戊二胺合成途径中扮演重要的角色。
4 戊二胺代谢工程研究进展
大肠杆菌的遗传背景清楚，戊二胺的合成机制明确，是研究戊二胺合成的理想宿主之一。研究者或者利用大肠杆菌的静息细胞合成戊二胺，或者根据大肠杆菌中戊二胺的代谢途径，对大肠杆菌进行代谢工程改造，利用糖类发酵直接合成戊二胺。Nishi 等利用强启动子P lac 构建过表达cadA 的大肠杆菌工程菌，工程菌发酵后投入底物赖氨酸，戊二胺产量达到69 g/L 发酵液[59]。为了直接利用糖类合成戊二胺，Qian 等[32]利用大肠杆菌K12 W3110作为宿主，对戊二胺代谢途径进行了改造：1) 删除编码降解戊二胺的speE 、speG 、ygjG 、puuA 和puuP 基因，使戊二胺降解和利用途径失活；2) 利用强启动子P lac 过表达cadA ；3) 通过强启动子P trc 替换原启动子过表达lysC 、dapA 、dapB 和lysA 来增加底物赖氨酸的合成；4) 把ddh 整合到染色体的iclR (异柠檬酸裂合酶)调节基因位点增加草酰乙酸的供给。结果表明：对赖氨酸合成途径的修饰以及野生型lysC 的过表达没有使戊二胺产量提高，而草酰乙酸的供给是个潜在的瓶颈。最终，大肠杆菌工程菌XQ56合成戊二胺的产量为 0.13 g/g 葡萄糖。
谷氨酸棒状杆菌是生产赖氨酸的高产菌株，赖氨酸是合成戊二胺的前体物质。因此，研究者也选择谷氨酸棒状杆菌作为宿主菌株进行代谢工程改造，从而利用糖类发酵来合成戊二胺。Mimitsuka 等[26]首次利用谷氨酸棒杆菌工程菌发酵葡萄糖来生产戊二胺，将cadA 插入谷氨酸棒杆
菌的高丝氨酸脱氢酶基因(hom )位点，cadA 在卡那霉素抗性基因启动子调控下表达，发酵液上清中积累了2.6 g/L 戊二胺；研究还表明，由于谷氨酸棒杆菌缺乏戊二胺转运蛋白，导致戊二胺在细胞内积累，抑制了赖氨酸脱羧酶的活性和戊二胺的合成。Tateno 等[60]将淀粉酶基因amyA 和cadA 同时克隆到谷氨酸棒状杆菌中共表达，构建成可直接利用可溶性淀粉生产戊二胺的谷氨酸棒状杆菌工程菌，尸胺产量达到23.4 mmol/L 。本实验室利用蜂房哈夫尼菌中赖氨酸脱羧酶基因ldc ，以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19为载体，构建工程菌株C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc 。工程菌C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc 合成的戊二胺产量为0. 96 g/L [61]。
构建戊二胺高产菌株需要对代谢途径的不同节点进行改造或修饰，包括中心碳代谢中前体和辅因子优化、产物的转运以及与戊二胺合成代谢流无关的分支代谢途径的解除或弱化[62]。Kind 等[63]对谷氨酸棒状杆菌中戊二胺代谢途径进行了改造：1) 在天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶引入点突变 lysC311和pycA458，解除了该酶受到的反馈调节；2) 过表达回补酶 (Anaplerotic enzyme) 丙酮酸羧化酶基因(pyc )，删除催化草酰乙酸消耗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepck )，保证重要前体草酰乙酸的供给；3) 过表达天冬氨酸激酶基因(aspC )、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapA )、二氨基庚酸脱氢酶基因(ddh )和二氨基庚酸羧化酶基因(lysA )，保证生物合成流流向赖氨酸；4) 高丝氨酸脱氢酶在59位点(hom 59)渗漏突变，实现对分支丝氨酸途径的弱化。5) 利用强启动子P tuf 调控和密码子优化过表达ldcC ，最终戊二胺产量达到 200 mmol(0.11 g/g 葡萄糖)，该菌株命名为DAP-3c 。若加入赖氨酸脱羧酶的辅酶磷酸吡哆醛，戊二胺产量达到300 mmol(0.17 g/g 葡萄糖)。此外，
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该过程中检测到副产物N-乙酰戊二胺，约占总产物的25%。N-乙酰尸胺是以乙酰-CoA 作为乙酰基供体，经NCgl1469催化戊二胺合成的产物 [63]。敲除该基因戊二胺产量增加了11%，葡萄糖向戊二胺的摩尔转换率达到30%。然而，副产物的代谢流没有全部流向戊二胺，这可能是受到戊二胺转运的限制造成的。通过全局转录分析 (Global transcription profiling)，从35种候选基因中鉴定出cg2893编码的渗透酶可能具有转运戊二胺的功能[64]。敲除该基因戊二胺的分泌降低了90%，而过表达该基因时，戊二胺的产量可提高20%，副产物减少75%。说明增强戊二胺的分泌可以降低戊二胺对赖氨酸脱羧酶的竞争抑制作用，从而提高戊二胺的产量。本实验将cadB 克隆至谷氨酸棒杆菌中，与蜂房哈夫尼菌的ldc 基因共表达，在谷氨酸棒杆菌合成戊二胺的同时，帮助戊二胺转运至细胞外，解除戊二胺的反馈抑制作用。工程菌合成戊二胺的分泌率较C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc 提高了27%[65]，戊二胺的产量也提高了30%。说明CadB 可以在谷氨酸棒状杆菌中表达，且可以将戊二胺转运至胞外，进而提高戊二胺的产量。
Volkert 等通过对代谢途径进行改造，构建了能利用葡萄糖发酵生产戊二胺谷氨酸棒状杆菌工程菌DAP ，戊二胺产量达到72 g/L ，并从发酵液中分离纯化戊二胺，纯度达到99%以上[66]。
Buschke 等利用谷氨酸棒状杆菌共表达木糖异构酶基因xylA 和木酮糖激酶基因xylB 并在HCE (High constitutive expression) 启动子调控下过表达cadA ，工程菌利用木糖发酵合成戊二胺，戊二胺产量为13.9 mmol/L 发酵液，转化率为每mol 木糖转化(164.5±6.9) mmol 戊二胺，对应每mol 碳转化(32.9±1.4) mmol 戊二胺[67]。碳源转化为戊二胺的转化率比较低，可能是碳源转化成二氧化碳损失过多，以及木糖的转运机制还不太清楚。为了提高
木糖的转化效率和提高戊二胺产量，Buschke 等将木糖合成途径中的tkt 操纵子过表达并删除戊二胺分解代谢中的lysE 和act 基因，构建高产戊二胺的谷氨酸棒状杆菌工程菌 C. glutamicum DAP-Xyl1 icd GTG P eftu fbp P sod tkt ?act ?lysE ，戊二胺产量达到103 g/L [33]。
5 戊二胺研究前景展望
市场上的完全生物基尼龙产品包括聚酰胺11、聚酰胺1010和聚酰胺46。其中聚酰胺11和聚酰胺1010来源于蓖麻油[68]，聚酰胺46由糖类发酵得到的产物腐胺和己二酸聚隶属于荷兰DSM 公司旗下Stanyl 品牌[25]。市场上的部分生物基尼龙产品包括聚酰胺610、聚酰胺1012、聚酰胺410和聚酰胺10T ，其他的生物基尼龙还处于研发阶段[68]。2012年，日本味之素公司和东丽实业公司宣布合作开发生物基尼龙原料1,5-戊二胺。由于谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的遗传背景清楚、生长周期短，为戊二胺的合成研究及工业生产提供了有利依据。然而，无论是大肠杆菌还是谷氨酸棒状杆菌，虽然中心代谢途径的改造在一定程度上提高了戊二胺的产量，但戊二胺的合成量远达不到实际生产要求，还需要大量的基础研究。赖氨酸脱羧酶是胞内酶，戊二胺滞留在胞内造成对赖氨酸脱羧酶的反馈抑制。已知的戊二胺转运蛋白只有大肠杆菌中的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白CadB ，能够在谷氨酸棒状杆菌中表达，但转化效率还有待提高。而谷氨酸棒状杆菌中cg2893编码的渗透酶也可能具有转运戊二胺的功能，但是谷氨酸棒状杆菌中不止这一种潜在的戊二胺转运蛋白，还可能存在未知的转运蛋白。如果能找到所有的戊二胺转运蛋白，比较其利弊，筛选出表达量最高的蛋白，这对戊二胺的生产具有重大意义。然而，戊二胺的转运量增加了，胞外的戊二胺量会明显增加，
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这会对细菌的生长造成影响。大肠杆菌在 0.2 mol/L 戊二胺存在时生长率下降35%，在 0.5 mol/L 戊二胺存在时仍有菌体生存，但戊二胺浓度在0.3–0.5 mol/L 时部分细胞已裂解。大肠杆菌对戊二胺的耐受性低于其对腐胺的耐受性
[69]
。
谷氨酸棒状杆菌在1 mol/L 戊二胺浓度时仍能对数生长，生长率下降约67%[27]。因此，明确戊二胺抑制细菌生长的机制，提高谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌对戊二胺的耐受性是亟需解决的问题。
REFERENCES
[1] Tabor CW, Tabor H. Polyamines in microorganisms.
Microbiol Rev, 1985, 49: 81–99.
[2] Brieger L. Weitere Untersuchungen über Ptomaine A.
Berlin: Hirschwald, 1885.
[3] Francisco J, Flores J, Rincn JF. Characterization of the
iron regulated desA promoter of Streptomyces pilosusasa system for controlled gene express ion in actinomycetes. Microb Cell Fact, 2003, 71: 339–349.
[4] Hirao T, Sato M, Shirahata A. Covalent link age of
polyamines to peptidoglycan in Anaerovibrio lipolytica . Bacteriol, 2000, 182(4): 1154–1157.
[5] Kamio Y, Nakamura K. Putrescine and cadaverine are
constituents of peptidoglycan in Veillonella alcalescens and Veillonella parvula . Bacteriol, 1987, 169(6): 2881–2884.
[6] Delavega AL, DelcourAH. Cadaverine induces
closing of E. coli porins. EMBO, 1995, 14(23): 6058–6065.
[7] Igarashi K, Kashiwagi K. Modulation of cellular
function by polyamines. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(1): 39–51.
[8] Chattopadhyay MK, Tabor CW, Tabor H. Polyamines
protect Escherichia coli cells from the toxic effect of oxygen. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(5): 2261–2265.
[9] Samartzidou H, Delour AH. Excretion of endogenous
cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer
membrane permeability. J Bacteriol, 1999, 18(3): 791–798.
[10] Tkachenko AG, Shumkov AV, Akhova AV. Adaptive
functions of Escherichia coli polyamines in response to sublethal concentrations of antibiotics. Microbiol, 2009, 78(1): 25–32.
[11] Manuel J, Zhanel GG, Kievit T. Cadaverine
suppresses persistence to carboxypenicillins in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(12): 5173–5179.
[12] Chen XH, Yu J, Li LL. Advances in study on
polyamines during flowering and fruit setting and development in higher plants. Chin Bull Bot, 2003, 20(1): 36–42 (in Chinese).
陈学好, 于杰, 李伶利. 高等植物开花结实的多胺研究进展. 植物学通报, 2003, 20(1): 36–42.
[13] Wang XY, Zou Q. Advances in study on polyamines
during flowering and fruit setting and development in higher plants. Chin Bull Bot, 2002, 19(1): 11–20 (in Chinese).
王晓云, 邹琦. 多胺与植物衰老关系研究进展. 植物学通报, 2002, 19(1) : 11–20.
[14] Casalino M, Latella MC, Prosseda G, et al. Molecular
evolution of the lysine decarboxylase defective phenotype in Shigellasonnei . Int J Med Microbiol, 2005, 294: 503–512.
[15] Kiyohiko N, Shuichi E, Yukiko M. Enzymatic method
for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon: Japan, 147688. 2003-05-26.
[16] Deng RS, Wei YF, Chen BN. Polyamide Resin and Its
Application. Beijing: Chemical Industry Press, 2002: 124–130 (in Chinese).
邓如生, 魏运房, 陈步宁. 聚酰胺树脂及其应用. 北京: 化学工业出版社, 2002: 124–130.
[17] Lin SS, Weng HS. Liquid-phase oxidation of
cyclohexane over CoAPO-5: synergism effect of coreactant and solvent effect. Appl Catal A-Gen, 1994, 118(1): 21–31.
[18] Sanders J, Scott E, Weusthuis R, et al. Bio-refinery as
the bio-inspired process to bulk chemicals. Macromol Biosci, 2007, 7(2): 105–117.
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2014 Vol.30 No.2
https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,/cjbcn
[19] Okino S, Noburyu R, Suda M, et al. An efficient
succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain. Appl Microbiol Biot, 2008, 81(3): 459–464.
[20] Oh IJ, Kim DH, Oh EK, et al. Optimization and
scale-up of succinic acid production by Mannheimia succiniciproducens LPK7. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(2): 167–171.
[21] Stellmacher R, Hangebrauk J, Wittmann C, et al.
Fermentative manufacture of succinic acid with Basfia succiniciproducens DD1 in serum flasks. Chem Lett, 2010, 82(8): 1223–1229.
[22] Ogunniyi DS. Castor oil: a vital industrial raw material.
Bioresource Technol, 2006, 97(9): 1086–1091.
[23] Jiang LL, Wu XY, Liu Y, et al. Fermentation and
properties of lysine decarboxylase. Fine Chem, 2006, 23(11): 1060–1067 (in Chinese).
蒋丽丽, 吴晓燕, 刘毅, 等. 赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质. 精细化工, 2006, 23(11): 1060–1067.
[24] Velasco AM, Leguina JI, Lazcano A. Molecular
evolution of the lysine biosynthetic pathways. Mol Evol , 2002, 55: 445–459.
[25] Schneider J, Wendisch VF. Biotechnological
production of polyamines by Bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91: 17–30.
[26] Mimitsuka T, Sawai H, Hatsu M, et al. Metabolic
engineering of Corynebacterium glutamicum for cadaverine fermentation. Biosci Biotechnol Biochem. 2007, 71(9): 2130–2135.
[27] Katinka M, Cossart P, Sibilli L, et al. Nucleotide
sequence of the thrA gene of Escherichia coli . Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(10): 5730–5733.
[28] Zakin MM, Duchange N, Ferrara P, et al. Nucleotide
sequence of the metL gene of Escherichia coli . Its product, the bifunctional aspartokinase ii-homoserine dehydrogenase II, and the bifunctional product of the thrA gene, aspartokinase I-homoserine dehydrogenase I, derive from a common ancestor. J Biol Chem, 1983, 258(5): 3028–3031.
[29] Cassan M, Parsot C, Cohen GN, et al. Nucleotide
sequence of lysC gene encoding the lysine-sensitive aspartokinase III of Escherichia coli K12. Evolutionary pathway leading to three isofunctional enzymes. J Biol Chem, 1986, 261(3): 1052–1057.
[30] Park JH, Lee KH, Kim TY, et al. Metabolic
engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(19): 7797–7802.
[31] Soksawatmaekhin W, Kuraishi A, Sakata K, et al.
Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli . Mol Microbiol, 2004, 51 (5): 1401–1412.
[32] Qian Z, Xia X, Lee SY. Metabolic engineering of
Escherichia coli for the production of cadaverine: a five carbon diamine. Biotechnol Bioeng, 2011, 108: 93–103.
[33] Buschke N, Becker J, Sch?fer R, et al. Systems
metabolic engineering of xylose-utilizing Corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane. Biotechnol J, 2013, 8: 557–570.
[34] Meng SY, Bennett GN. Nucleotide sequence of the
Escherichia coli cad operon: a system for neutralization of low extracellular pH. J Bacteriol, 1992, 174(8): 2659–2669.
[35] Watson N, Dunyak DS, Rosey EL, et al. Identification
of elements involved in transcriptional regulation of the Escherichia coli cad operon by external pH. J Bacteriol, 1992, 174(2): 530–540.
[36] Yamamoto Y, Miwa Y, Miyoshi K, et al. The
Escherichia coli ldcC gene encodes another lysine decarboxylase, probably a constitutive enzyme. Genes Genet Syst, 1997, 72 (3): 167–172.
[37] Lemonnier M, Lane D. Expression of the second
lysine decarboxylase gene of Escherichia coli . Microbiol, 1998, 144(3): 751–760.
[38] Fritz G, Koller C, Burdack K, et al. Induction kinetics
of a conditional pH stress response system in Escherichia coli . J Mol Biol, 2009, 393(2): 272–286.
[39] Neely MN, Olson ER. Kinetics of expression of the
Escherichia coli cad operon as a function of pH and
李东霞 等/生物法合成戊二胺研究进展
cjb@https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,
lysine. J Bacteriol, 1996, 178(18): 5522–5528. [40] Sabo DL, Boeker EA, Byers B. Purification and
physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochem, 1974, 13(4): 662–670.
[41] Stefan V, Harald H, Andreas K, et al. Process for
production of cadaverine by fermentation: German, 2008100053323. 2008-02-01.
[42] Fecker LF, Beier H, Berlin J. Cloning and
characterization a lysine decarboxylase gene form Hafnia alvei ．Mol Gen Genet, 1986, 203: 177–184.
[43] Lu MH, Li XM, Chen JF, et al. Study on chilling
tolerance of cucumber during germination and expression of lysine decarboxylase gene. Sci Agri Sin, 2005, 38(12): 2492–2495 (in Chinese).
逯明辉, 李晓明, 陈劲枫, 等．黄瓜发芽期耐冷性与赖氨酸脱羧酶基因表达. 中国农业科学, 2005, 38(12): 2492–2495.
[44] Sakazaki R. The genus Hafnia //Starr MP, Stolp H,
Trfiper HG, et al eds. The Prokaryotes. New York: Springer, Berlin Heidelberg, 1981: 1181–1186.
[45] Jiang LL, Liu JZ, Shen YL, et al. Producing
cadaverine by cell immobilization of lysine decarboxylase. Fine Chem, 2007, 24(11): 1080–1084 (in Chinese).
蒋丽丽, 刘均忠, 沈俞, 等. 用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1,5-戊二胺. 精细化工, 2007, 24(11): 1080–1084.
[46] Takatsuka Y, Yamaguchi Y, Ono M, et al. Gene
cloning and molecular characterization of lysine decarboxylase from Selenomonas ruminantium delineate its evolutionary relationship to ornithine decarboxylases from eukaryotes. J Bacteriol, 2000, 6732–6741.
[47] Kashiwagi K, Miyamoto S, Suzuki F, et al. Excretion
of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli . Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 4529–4533.
[48] Kashiwagi K, Shibuya S, Tomitori H, et al. Excretion
and uptake of putrescine by the PotE protein in Escherichia coli . Biol Chem, 1997, 272: 6318–6323.
[49] Kashiwagi K, Kuraishi A, Tomitori H, et al.
Identi ?cation of the putrescine recognition site on polyamine transport protein PotE. Biol Chem, 2000, 275: 36007–36012.
[50] Qian ZG, Xia XX, Lee SY, et al. Metabolic
engineering of Escherichia coli for the production of putrescine: a four carbon diamine. Biotechnol Bioeng, 2009, 104(4): 651–662.
[51] Gong S, Richard H, Foster JW. YjdE (AdiC) is the
arginine: agmatine antiporter essential for arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli . Bacteriol, 2003, 185: 4402–4409.
[52] Iyer R, Williams C, Miller C. Arginine-agmatine
antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli . Bacteriol, 2003, 185: 6556–6561.
[53] Jack DL, Paulsen IT, Saier MH. The amino
acid/polyamine/organocation (APC) superfamily of transporters speci ?c for amino acids, polyamines and organocations. Microbiol, 2000, 146: 1797–1814.
[54] Soksawatmaekhin W, Uemura T, Fukiwake N, et al.
Identification of the cadaverine recognition site on the cadaverine-lysine antiporter cadB. J Biol Chem, 2006. 281(39): 29213–29220.
[55] Tomitori H, Kashiwagi K, Igarash K. Structure and
function of polyamine-amino acid antiporters CadB and PotE in Escherichia coli . Amino Acids, 2012, 42: 733–740.
[56] Kind S, Kreye S, Wittmann C. Metabolic engineering
of cellular transport for overproduction of the platform chemical 1,5-diaminopentane in Corynebacterium glutamicum . Metab Eng, 2011, 13: 617–627.
[57] Kind S, Wittman C. Bio-based production of the
platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91: 1287–1296.
[58] Melzer G, Esfandabadi ME, Franco LE, et al. Flux
design: in silico design of cell factories based on correlation of pathway fluxes to desired properties. BMC Syst Biol, 2009, 3: 120.
[59] Nishi K, Endo S, Mori Y, et al. Method for producing
cadaverine dicarboxylate: US 7189543 B2. 2007-3-13.
[60] Tateno T, Okada Y, Tsuchidate T, et al. Direct
production of cadaverine from soluble starch using
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2014 Vol.30 No.2
https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,/cjbcn
Corynebacterium glutamicum coexpressing alpha-amylase and lysine decarboxylase. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82: 115–121.
[61] Niu T, Li M, Zhang JH, et al. Construction of
recombinant Corynebacterium glutamicum producing 1,5-pentanediamine by one step method. China Biotechnol, 2010, 30(8): 93–99 (in Chinese). 牛涛, 黎明, 张俊环, 等. 一步法生产1,5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建. 中国生物工程杂志, 2010, 30(8): 93–99．
[62] Park JH, Lee SY. Towards systems metabolic
engineering of microorganisms for amino acid production. Curr Opin Biotechnol, 2008, 19: 454–460.
[63] Kind S, Jeong WK, Schr?der H, et al. Systems-wide
metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane. Metab Eng, 2010, 12(4): 341–351.
[64] Kind S, Jeong WK, Schr?der H, et al. Identification
and elimination of the competing N-acetyldiaminopentane pathway for improved production of diaminopentane by Corynebacterium glutamicum . Appl Environ Microbiol, 2010b, 76(15): 5175–5180.
[65] Huang YY, Li M, Liu M, et al. Construction and transformation of Corynebacterium glutamicum expression vector of cadaverine-lysine antiporter cadB gene. Biotechnol Bull, 2012(8): 94–100 (in Chinese). 黄云雁, 黎明, 刘萌, 等. 赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB 基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化. 生物技术通报, 2012(8): 94–100.
[66] Volkert M, Zelder O, Ernst B, et al. Method for
fermentively producing 1,5-diaminopentane: US, 20100292429, 2010-11-18.
[67] Buschke N ，Schroder H ，Wittmann C. Metabolic
engineering of Corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane from hemicelluloses. Biotechnol J, 2011, 6: 306–317.
[68] Ji D, Fang Z, Ouyang PK, et al. Progress in bio-based
polyamides. Chin J Biopro Eng, 2011, 6: 306–317 (in Chinese).
季栋, 方正, 欧阳平凯, 等. 生物基聚酰胺研究进展. 生物加工过程, 2013, 11(2): 73–80.
[69] Limsuwun K, Jones PG. Spermidine acetyltransferase
is required to prevent spermidine toxicity at low temperatures in Escherichia coli . Bacteriol, 2000, 182(19): 5373–5380.
(本文责编 郝丽芳)
合成生物学研究进展及其风险 关正君魏伟徐靖 1合成生物学研究概况 合成生物学(synthetic biology)是在现代生物学和系统科学基础上发展起来的、融入工程学思想的多学科交叉研究领域。其包括了与人类自身和社会发展相关的研究方向和内容，为解答生命科学难题和人类可持续发展所面临的重大挑战提供了新的思路、策略和手段。2004年，合成生物学被美国麻省理工学院出版的Technology Review评为“将改变世界的十大新技术之一”。2010年12月，Nature杂志盘点出2010年12件重大科学事件，Science杂志评出的科学十大突破，合成生物学分别排名第4位和第2位。为此，世界各国纷纷制定合成生物学发展战略及规划，开展合成生物学研究，以抢占合成生物学研究和发展先机，促进了合成生物学基础研究和应用研究的快速发展。同时合成生物学的巨大应用潜力，还吸引了众多公司及企业参与到该领域的研究开发，推动着合成生物学产业化的进程。 合成生物学作为后基因组时代生命科学研究的新兴领域，其研究既是生命科学和生物技术在分子生物学和基因工程水平上的自然延伸，又是在系统生物学和基因组综合工程技术层次上的整合性发展。与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造不同，合成生物学旨在将工程学的思想用于生物学研究中，以设计自然界中原本不存在的生物或对现有生物进行改造，使其能够处理信息、加工化合物、制造材料、生产能源、提供食物、处理污染等，从而增进人类的健康，改善生存的环境，以应对人类社会发展所面临的严峻挑战。 作为一个新的基础科学研究领域，合成生物学综合生物化学、生物物理和生物信息技术与知识，涵盖利用基因和基因组的基本要素及其组合，设计、改造、重建或制造生物分子、生物体部、生物反应系统、代谢途径与过程，乃至整个生物活动的细胞和生物个体。合成生物学使人们可以利用与物理学方法类似的模块构建和组装形成新的生命有机体，从而人工设计新的高效生命系统。中科院《2013年高技术发展报告》指出，DNA测序技术、DNA合成技术和计算机建模是支撑合成生物学发展的关键技术。近年来，大量物种的全基因组测序，为合成生物学家构建功能组件的底盘生物体系提供了丰富的遗传信息。快速、廉价的测序技术也促进了新的系统和物种的识别和解析。 2 合成生物学应用研究进展 2.1 合成生物学在医药工业领域的应用 2.1.1 天然药物合成生物学 天然药物合成生物学是在基因组学研究的基础上，对天然药物生物合成相关元器件进行发掘和表征，借助工程学原理对其进行设计和标准化，通过在底盘细胞中装配与集成，重建生物合成途径和代谢网络，从而实现药用活性成分定向、高效的异源合成，以解决天然药物
二甲醚及生产工艺 1、二甲醚的基本概况 二甲醚别名：甲醚 英文名称：methyl ether；dimethyl ether；DME CAS编号：115-10-6 分子式：C2H6O 结构式：CH3—O—CH3 二甲醚又称甲醚，简称DME。二甲醚在常压下是一种无色气体或压缩液体，具有轻微醚香味。相对密度（20℃）0.666，熔点 -141.5℃，沸点-24.9℃，室温下蒸气压约为0.5MPa，与石油液化气（LPG）相似。溶于水及醇、乙醚、丙酮、氯仿等多种有机溶剂。易燃，在燃烧时火焰略带光亮，燃烧热（气态）为1455kJ/mol。常温下DME具有惰性，不易自动氧化，无腐蚀、无致癌性，但在辐射或加热条件下可分解成甲烷、乙烷、甲醛等。 二甲醚是醚的同系物，但与用作麻醉剂的乙醚不一样，毒性极低；能溶解各种化学物质；由于其具有易压缩、冷凝、气化及与许多极性或非极性溶剂互溶特性，广泛用于气雾制品喷射剂、氟利昂替代制冷剂、溶剂等，另外也可用于化学品合成，用途比较广泛。 2 生产原理 生产方法简介
目前国内外二甲醚生产方法主要有合成气一步法和甲醇法。甲醇法又分为甲醇气相法和甲醇液相法。合成气一步法的工业化技术尚未成熟,理由是: ①现有的技术未经装置检验; ②即使按现有技术,其生产成本也高于甲醇气相法 反应方程式 合成气一步法以合成气(CO + H2 )为原料,合 成甲醇反应和甲醇脱水反应在一个反应器中完成, 同时伴随CO的变换反应。其反应式如下。 2CO + 4H2 = 2CH3OH CO +H2O =CO2 +H2 2CH3OH =CH3OCH3 +H2O 总反应: 3CO + 3H2 =H3COCH3 +CO2 甲醇液相法： 甲醇脱水反应在液相、常压或微正压、130 ～130 ℃下进行。其化学反应式如下: 2CH3OH =H3COCH3 +H2O 甲醇气相法： 催化剂为ZSM分子筛、磷酸铝或γ2Al2O3。 甲醇脱水反应的化学反应式如下。 主反应: 2CH3OH =H3COCH3 +H2O
用分子氧一步法催化氧化环己烷制备己二酸 表面催化研究中心，化学系，雷丁大学，校区，雷丁，英国RG66广告 2006年6月1日收到，2006年6月29日受理 用锰-钴转变的合金和羟基临苯二甲酰亚胺作催化剂，在温度353K用分子氧一步氧化环己烷制备己二酸，得到生成氧化物大于95%的选择性，以己二酸为主的转化产率为78%。74%的部分氧化被记录下来。 关键词：己二酸，一步氧化，催化剂，环己烷氧化，羟基临苯二甲酰亚胺，自由基，选择性1.前言 值得注意的研究努力已被付出去研究有效地方法，为了环己烷未活化的C-H键的氧化，因为考虑到工业和合成方面基板的重要性。 已经用不同的氧化剂探讨烷烃类的催化氧化，在温和条件下用分子氧的反应是可行的，归因于他的廉价的有效性和只有产物水为无污染的副产物。 然而，环己烷的氧化在所有主要工业生产过程中表现出很低的效率。 目前，工业氧化环己烷制备己二酸经历了两步过程。第一步包括了环己烷氧化成环己酮和环己醇（KA油），在约温度423K和1-2MPa压力条件下，用可溶性钴催化剂或无催化剂，在液相中，所有环己烷转化率低于4%。 在这样低的转化下朝向环己醇和环己酮的选择性可以优化到70%-85%，没有太多产物的过氧化。第二步历程包括了KA油的氧化制成己二酸，通过硝酸作为温和氧化剂的使用。 这一步产生的副产物包括一氧化二氮（N2O），它显示的全球变暖效率比二氧化碳高300倍。提高这两步反应选择性的研究还在继续。例如，向氧化混合物中加入硼酸被证明是有效的，它允许约环己烷的10%转化朝向KA油有90%的选择性。 Murahashi等人指出环己烷在铁粉上的氧化，观察到11%的转化率，生成KA油95%的选择性。 然而，寻求一步法从环己烷生产己二酸且没有NOx生成，从绿色化学角度是迫切的事情。Tomas和他的同事做了些很有意思的工作，在气相（无溶剂）中用分子筛催化剂在活性部位隔离直接氧化环己烷制备己二酸。 在类似的研究中，Moden 等人已经声明了为了环己烷氧化反应的MnAPO-5催化剂的选择性性质。 从反应机械论方面考虑环己烷制备己二酸的关键难题，它可能需要催化体系去激活分子的C-H键，可能通过烷基自由基的一代，一个C-C键的明确断裂造成开环，在终端形成酸官能度更进一步的氧化之前。 然而，产物和反应中间体含C-H和C-C键，将在高度转化中同样易受相同催化体系的进攻。已经有一些尝试，在有自由基引发剂热力过程下首先聚集烷基自由基。 但是，这自动氧化过程需要严格的反应条件，反应需在高温下进行。 在这样的条件下，C-H键和C-C键的均裂分裂都对于合成己二酸将有很低选择性。 至今为止，还没有满意的一般方法，去在温和条件下环己烷碳氢键的均裂分歧去选择的生成碳自由基。 为了实现它，一种在温和条件下让碳自由基增长的新方法是被需要的。这样一种方法对于有机合成可能变成一种不可或缺的工具。 目前，学者们发现PINO自由基，产生于羟基邻苯二甲酰亚胺，在温和条件下，从不同烃类包括烷烃类，醇类，酯类，缩醛类，还有醛类等的碳氢键摘取一个氢原子，形成相应的碳自由基，有很高的选择性和高催化效率。 羟基邻苯二甲酰亚胺已被命名为“碳自由基生成催化剂”（这在此后为CRPC）。这NHPI能
·综述· 鬼臼毒素生物合成研究进展 陆炜强，傅承新，赵云鹏 * （浙江大学生命科学学院濒危野生动植物保护生物学教育部重点实验室，浙江杭州310058） ［摘要］鬼臼毒素（podophyllotoxin ）是一种成功商品化的天然木脂素，其衍生物依托泊苷（etoposide ）、替尼泊苷（tenipo-side ）等在临床上广泛应用于抗肿瘤、抗病毒治疗。植物提取是鬼臼毒素的主要来源，面对野生资源压力，人们分别开展了植物野生变栽培、 植物细胞或器官培养、化学全合成等研究，以扩大鬼臼毒素来源。鬼臼毒素生物合成研究是开展植物规范化栽培和代谢工程的重要前提。20多年来尤其是近10年来，鬼臼毒素生物合成研究进展迅速，但鬼臼毒素的下游代谢以及整个合成途径基因水平的评述仍不足，因此作者专门针对鬼臼毒素的生物合成，对相关文献尤其是近10年的文献进行综述，重点介绍其合成途径关键环节的过程、主要产物、酶的特点与功能、已报道的酶编码基因等内容，以合理推测和概括鬼臼毒素的生物合成途径，同时对目前研究仍存在的问题和将来研究方向进行了讨论。 ［关键词］鬼臼毒素；生物合成；规范化栽培；代谢工程［稿件编号］20101116002 ［基金项目］国家科技支撑计划项目（2006BAI21B07）；浙江省科技厅中药现代化专项（2006C13077）［通信作者］* 赵云鹏， Tel ：（0571）88206463，E-mail ：ypzhao @https://www.doczj.com/doc/9613146655.html, ［作者简介］陆炜强， Tel ：（0571）88206463，E-mail ：lwq-711@ 163.鬼臼毒素（podophyllotoxin ， PTOX ）是植物来源天然产物成功商品化的经典案例。从其发现至今已有近1个世纪的历史，其具有良好的抗肿瘤、抗尖锐湿疣、抗艾滋病毒活性 ［1-3］ ，虽然自身毒副作用较大，但其半合成衍生物在保证治 疗效果的同时，大大降低了毒性，在临床治疗淋巴癌、肺癌等多种癌症中得到广泛应用， 如依托泊苷（etoposide ，VP-16），替尼泊苷（teniposide ，VM-26），依托泊苷磷酸酯（etopophos ），azatoxin ，tafluposide 等［4］。鬼臼毒素的传统和主要来源是植物提取，来源植物主要分布于小檗科足叶草属Podophyllum 、桃儿七属Sinopodophyllum 、八角莲属Dysosma 、山荷叶属Diphylleia 、Jeffersonia 属，其他还有亚麻科亚麻属Linum ，柏科刺柏属Juniperus 、崖柏属Thuja 、Callitris 属，唇形科山香属Hyptis 、百里香属Thymus 、香科科属Teucrium 、荆芥属Nepeta 、Eriope 属等［5-7］。由于过度采挖、生境破坏和植物自身生长缓慢等原因，鬼臼类野生植物资源逐渐枯竭、物种濒危，已难以满足鬼臼毒素生产的需求，人工规范化栽培势在必行，但目前桃儿七S .hexandrum （异名：Podophyllum hex-andrum ，P .emodi ）、八角莲D .versipellis 的栽培刚刚起步，其他来源植物的新资源开发程度也有待进一步深入 ［8-10］ 。此外，虽然化学全合成技术已经有所突破，但是 复杂的合成过程、极低的合成效率（约为5%），使人工全合成鬼臼毒素目前仍难以实现商业化 ［3，11］ 。近年来基于 生物技术的植物代谢工程快速发展，为鬼臼毒素替代资源的开发提供了更多途径，如植物细胞或器官培养、生物转化等，但仍存在效率低、成本高的共性问题，目前尚未产业化 ［5，12-14］ 。因此，要彻底解决鬼臼毒素的来源问题， 仍需要对上述3种途径的关键科学和技术问题深入研究。 实现药用植物规范化栽培和植物细胞或器官培养生产鬼臼毒素的前提之一是必须充分阐明鬼臼毒素的生物合成途径及其调控机制。因此，自20世纪80年代末以来，学者们以足叶草Podophyllum spp.、亚麻Linum spp.等植物的组织或细胞培养体系为研究系统，探讨了鬼臼毒素的生物合成途径，取得了长足进展。前人综述了不同时期鬼臼毒素生物合成不同方面的研究进展 ［6，12，15-19］ ，揭示了合成途径的大体 框架，为后续的研究提供了良好的基础和背景。但是前人的综述大多是对鬼臼毒素的资源、化学、药理、生物合成、细胞或器官培养等内容的全面评述，或者是对整个木脂素类生物合成的综述， 对于鬼臼毒素生物合成的论述不够全面、详细，比如对鬼臼毒素下游的代谢往往没有讨论，而且对近几年已有新进展的相关酶编码基因的分离、扩增、表达也较少涉及。因此，本文专门针对鬼臼毒素的生物合成，对相关文献尤其是近10年的文献进行综述，重点介绍其合成途径关键环节的过程、主要产物、酶的特点与功能、鬼臼毒素下游代谢、已报道的酶编码基因等内容，以期继续推动该领域的研究，实现优质种源筛选、株系改良、栽培和培养条件优化、生产体系调控，为鬼臼类植物规范化栽培和代谢工程的产业化奠定
复方戊二醛溶液及应用 本品含戊二醛(C5H802)应为14.0％-16.0％(g/ml)，含烃铵盐以 C22H40ClN计应为9.0％～10.0％(g／m1)。 [性状]本品为琥珀色的澄清液体，有特臭。 [检查] 相对密度本品的相对密度(附录33页)为1.030～1.040。 酸度取本品20.0ml，加水10ml与溴麝香草酚蓝指示液8滴，用氢氧化钠滴定液 (0.1mol/L)滴定至溶液由橙黄色变为黄色，消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)不得过3.0ml。 [含量测定] 戊二醛取本品适量(约相当于戊二醛0.2g)，。精密称定，精密加6.5％三乙醇胺溶液20ml与盐酸羟胺的中性溶液(取盐酸羟胺17.5g 加水75ml溶解，加异丙醇稀释至500ml，摇匀，加0.04％溴酚蓝乙醇溶液15ml，用6.5％三乙醇胺溶液滴定至溶液显蓝绿色)25ml，摇匀，放置l小时，用硫酸滴定液(o.25mol／L)滴定至溶液显蓝绿色。并将滴定的结果用空白试验校正。另取本品，同时测其相对密度，将供试品量换算ml数。每1ml 硫酸滴定液(0.25mol/L)相当于25.03mgC5H802。苯扎氯铵取本品适量(约相当于苯扎氯铵0.5g)，精密称定，置含有35ml水的250m1分液漏斗中，加0.1mol／L氢氧化钠溶液10ml与氯仿25ml，精密加入新制的5％碘化钾溶液10ml，振摇，静置使分层，水层用氯仿提取3次，每次10m1，弃去氯仿层，用水约15ml淋洗分液漏斗上部，加盐酸40ml，放冷，用碘酸钾滴定
液(0.05mol／L)滴定至淡棕棕，加氯仿5ml，继续滴定并剧烈振摇至氯仿层无色，并将滴定的结果用空白试验校正。另取本品同时测其相对密度，将供试品量换算成m1数。每lml的碘酸钾滴定液(0.05mol／L)相当于35.40mg 的C22H40ClN。 [功能与主治]/[作用与用途]消毒药。主用于动物厩舍及器具消毒。 [用法与用量]/[用法与判定]1：150稀释喷洒每平方米 9ml 涂刷无孔材料表面每平方米 100ml 有孔材料表面每平方米 300ml [注意事项]避免接触皮肤和粘膜；禁与肥皂及盐类消毒药合用；不宜用于膀胱镜、眼科器械及合成橡胶制品的消毒。 [贮藏]遮光，密闭，在凉暗处保存。 复方戊二醛(畜禽) 【执行标准】《兽药地方标准上升国家标准》第一册 《进口兽药质量标准》2006年版 【主要成分】癸甲溴铵、戊二醛（也可以由戊二醛与癸甲氯铵、苯扎氯铵、苯扎溴铵、双季铵盐等产品中的一种复配） 【性状】淡黄色澄清液体，有刺激性特臭。 【药理作用】戊二醛：具有广谱、高效和速效的杀菌作用。对细菌繁殖体、芽孢、病毒、结核杆菌和真菌等均有很好的杀灭作用。烃铵盐：本品为阳离子表面活性剂，对细菌如化脓杆菌、肠道菌等有较好的杀灭能力，对革兰氏阳性菌的杀灭能力要比革兰氏阴性菌为强。对病毒的作用较弱，对亲脂性病
微生物药物合成生物学研究进展 武临专, 洪斌* (中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 卫生部抗生素生物工程重点实验室, 北京100050) 摘要: 微生物次级代谢产物结构复杂多样, 具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等多种生物活性, 是微生物药物开发的源泉。当前, 微生物药物研究面临一些挑战: 快速发现结构新颖、生物活性突出的化合物; 理性化提高产生菌的发酵效价; 以及以微生物为新宿主, 实现一些重要天然药物的工业生产。合成生物学是在系统生物学和代谢工程等基础上发展起来的一门学科。本文对合成生物学在发现微生物新次级代谢产物、提高现有微生物药物合成水平和创制微生物次级代谢产物方面的研究进展进行了阐述。 关键词: 微生物药物; 合成生物学; 次级代谢产物; 生物合成 中图分类号: Q939.9; Q81; R914.5 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2013) 02-0155-06 Synthetic biology toward microbial secondary metabolites and pharmaceuticals WU Lin-zhuan, HONG Bin* (Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health, Institute of Medicinal Biotechnology, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China) Abstract: Microbial secondary metabolites are one of the major sources of anti-bacterial, anti-fungal, anti- tumor, anti-virus and immunosuppressive agents for clinical use. Present challenges in microbial pharmaceutical development are the discovery of novel secondary metabolites with significant biological activities, improving the fermentation titers of industrial microbial strains, and production of natural product drugs by re-establishing their biosynthetic pathways in suitable microbial hosts. Synthetic biology, which is developed from systematic biology and metabolic engineering, provides a significant driving force for microbial pharmaceutical development. The review describes the major applications of synthetic biology in novel microbial secondary metabolite discovery, improved production of known secondary metabolites and the production of some natural drugs in genetically modified or reconstructed model microorganisms. Key words: microbial pharmaceuticals; synthetic biology; secondary metabolites; biosynthesis 来源于微生物的药物称为微生物药物(microbial medicine, microbial pharmaceuticals), 主要包括来源于微生物(特别是放线菌和真菌) 次级代谢产物的药物。 收稿日期: 2012-09-25; 修回日期: 2012-11-01. 基金项目: 国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(2012ZX09301002-001-016); 国家自然科学基金资助项目 (31170042, 81172964). *通讯作者 Tel: 86-10-63028003, E-mail: binhong69@https://www.doczj.com/doc/9613146655.html,, hongbin@https://www.doczj.com/doc/9613146655.html, 微生物药物例如抗生素, 在控制感染、免疫调节和治疗癌症等方面发挥了重要作用。目前, 已经从放线菌和真菌中发现了2万多种具有生物活性的次级代谢产物, 其中百余种成为微生物药物。随着对放线菌和真菌的持续开发利用, 直接从放线菌和真菌研制微生物新药难度越来越大, 主要原因在于: ①化合物排重难度很大(从微生物已经发现了25 000多种化合物); ②新微生物资源的分离培养工作没有突破性进展, 获得大量的、具有产生新次级代谢产物能 ·专题报道·
戊二醛 戊二醛属高效消毒剂。因具有杀菌谱广、杀细菌芽孢效果可靠、杀菌作用受有机物影响较小、对金属腐蚀性小等特点，适用于不耐热的医疗器械和精密仪器的消毒与灭菌，尤其是内窥镜的消毒灭菌。但由于戊二醛对人体具有潜在的毒性、对皮肤黏膜具有刺激性，目前有些人正在积极寻找其替代品用于内窥镜和其他医疗器械的灭菌。 物理化学性质 戊二醛是一种饱和五碳二醛，分子式为C5H8O2,相对分子质量为100.12；纯品为无色或浅黄色油状液体，有微弱的醛气味，沸点187-189℃，易溶于水和醇。戊二醛水溶液呈酸性。 戊二醛在酸性条件下稳定，可长期贮存，商业出售的戊二醛通常是质量分数为2%、25%、50%的酸性溶液。消毒用的戊二醛通常为2%的碱性溶液，酸性溶液在使用之前需活化（碱性化）。碱性条件下戊二醛不稳定，易聚合成多聚体，pH≥8的溶液通常在4周内失去活性，活化的碱性戊二醛使用时间不应超过两周。 对微生物的杀灭作用 戊二醛杀灭微生物的机理还不清楚，可能是自由醛基与细胞表面或内部蛋白质或酶的氨基结合而引起一系列的反应，导致微生物的死亡。戊二醛与蛋白质和酶的反应速率取决于溶液的酸碱度，在pH4～9范围内，随着pH值的增加，反应速率增加。 戊二醛具有良好的杀菌效果，2%碱性戊二醛溶液（pH7.2～8.5）作用5min可杀灭细菌繁殖体，作用10min 可杀灭各类病毒，作用30min可杀灭真菌和结核分支杆菌，杀灭细菌芽孢需要3h。但干燥细菌对化学消毒剂的抗力明显高于悬液中的细菌，戊二醛也不例外。对干燥枯草杆菌芽孢，2%碱性戊二醛在20℃时达到灭菌需要10h。2%强化酸性戊二醛溶液和2%中性戊二醛也都具有可靠的杀芽孢作用。2%戊二醛溶液浸泡口腔镜7min可使其上的HBsAg 破坏，2%中性戊二醛复方消毒剂作用10min 可使HBsAg破坏。 杀菌的影响因素 1)浓度和作用时间的影响随着浓度的增加和作用时间的延长，杀菌作用增强。但质量分数低于2%的戊二醛溶液，无论怎样延长杀菌时间，也不能取得可靠的杀细菌芽孢效果。因此，杀灭细菌芽孢需用质量分数大于2%的戊二醛溶液。 2) 溶液酸碱度的影响酸性戊二醛的杀菌作用明显低于碱性戊二醛，但随温度升高差异逐渐减小。在 pH4.0～ 9.0范围内，随着pH值的增加杀菌作用增强；pH7.5 ～8.5时杀菌作用最强；pH＞9时，戊二醛迅速聚合，杀菌作用迅速丧失。 3) 温度的影响在较低温度下也有杀菌作用。随温度升高，戊二醛杀菌作用增强，在20 ～60℃其温度系数（Q10）为1.5 ～4.0。 4) 有机物的影响有机物使杀菌作用减弱，但有机物对戊二醛杀菌作用的影响比其他消毒剂小，20%小牛血
学号:3510020031泰山医学院毕业设计（论文） 题目：二甲醚的的合成及其应用前景 院（部）系化工系 所学专业应用化工技术 年级、班级10级1班 完成人姓名 指导教师姓名 专业技术职称 年月日
论文原创性保证书 我保证所提交的论文都是自己独立完成，如有抄袭、剽窃、雷同等现象，愿承担相应后果，接受学校的处理。 专业： 班级： 签名： 年月日
摘要 二甲醚是一种重要的精细化工产品，因其良好的理化性质在化工和医药行业中一直被广泛用作甲基化剂、气雾剂、致冷剂和各种有机合成原料。近年来国内外的研究发现它还具有优良的燃烧性能，可直接用作发动机燃料和民用燃料，被誉为“21世纪的清洁燃料”。本论文将介绍二甲醚的性质，二甲醚的制备方法，二甲醚的应用及市场发展前景，国内二甲醚的生产及研究现状。 关键字：二甲醚；燃料；化工产品；制备方法
Abstrac Two ether is an important fine chemical product, because of its physical and chemical properties in the chemical and pharmaceutical industries has been widely used as a methylating agent, aerosol, refrigerant and various organic synthesis of raw materials. In recent years, the domestic and foreign research found that it also has excellent combustion properties, can be directly used as engine fuel and civilian fuel, known as "the twenty-first Century clean fuel". This paper will introduce the properties of two ether, preparation method of two ether, application and market prospect of the two ether, present situation of production and research of the two ether. Keywords: two ether; fuel; chemical products; preparation method
戊二酸 目录 编辑本段概况 中文名：戊二酸，胶酸，a,γ-丙烷二羧酸，1,3-丙二羧酸。 英文名称： glutaric acid，Pentanedioic acid， Propane-1,5-dicarboxylic acid，a,γ-Propanedicarboxylic acid 。 CAS No.： 110-94-1 EINECS：203-817-2[1] 分子式： C5H8O4 分子量： 132.11 编辑本段理化特性 主要成分：含量: ≥99.0%；水中不溶物≤0.01%；灼烧残渣≤ 0.1%。 外观与性状：针状结晶或大单斜粒状结晶。 熔点(℃)： 97.5-98 沸点(℃)： 302~304（极微分解）、200（2.67KPa）、195~198（1.33KPa）相对密度(水=1)： 1.424(25℃)、1.429(15℃) 饱和蒸气压(kPa)： 2.67(200℃) 折射率：1.418 78(106℃) 溶解性：易溶于水、无水乙醇、乙醚和氯仿，微溶于石油醚。 毒性：有毒。 编辑本段制备 工业上可从生产已二酸的副产品中回收。实验室制备可有多种方法。
1.由γ-丁内酯制备戊二酸将γ-丁内酯和氰化钾加热至190-195℃，搅拌反应2h。冷却，加入浓盐酸酸化生成戊二酸单酰胺，再加热水解即得戊二酸。收率71-75%。 2.由二氢吡喃制备戊二酸将二氢吡喃与0.2N硝酸在沸水浴上加热溶解，然后在冰水浴上冷却，加入浓硝酸，二氢吡喃水解并逸出二氧化氮，当温度降至0℃时，加入硝酸钠，强烈搅拌3h。不再冷却，使温度升至25-30℃。减压蒸发、冷却，得戊二酸，收率70-75%。 3.由戊二腈制备戊二酸将戊二腈与盐酸加热回流4h，然后蒸发至干，残留物含戊二酸和氯化铵，用热乙醚提取，提取液回收乙醚即得戊二酸，可用氯仿或苯重结晶。 4.环己酮氧化法环己酮经硝酸氧化生产己二酸时副产戊二酸。 5.副产回收法石蜡氧化生产氧化石蜡时回收戊二酸。回收方法一般采用水萃取法（或蒸馏、闪蒸和水蒸气蒸馏等）和结晶法。 6.环戊酮液相氧化法。 7.二氢呋喃法。实验室中也用1,3-丙二醇制备戊二酸。 编辑本段用途 生产戊二酸酐的原料，用作合成树脂、合成橡胶聚合时的引发剂。 编辑本段其它 健康危害：吸入、摄入本品对身体有害。对眼睛、皮肤有刺激作用。 环境危害：对环境有危害，对水体和大气可造成污染。 燃爆危险：本品可燃，具刺激性。 危险特性：遇明火、高热可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物, 当达到一定浓度时, 遇火星会发生爆炸。受高热分解, 放出刺激性烟气。 参考资料 1 丁二酸 百科名片 二酸又称琥珀酸。分子式HOOCCH2CH2COOH。丁二酸除存在于琥珀外，还广泛存在于多种植物及人和动物的丁二酸组织中，例如未成熟的葡萄、甜菜和大黄，人的血液和肌肉，牛的脑、脾、甲状腺等。丁二酸是碳水化合物在体内新陈代谢的中间体。 目录 基本介绍 基本信息
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry46:105–110,2003. ?2003Kluwer Academic Publishers.Printed in the Netherlands. 105 The Intercalation of4-Aminopyridine into Layered FePS3 XINGGUO CHEN1,LI ZOU1,XUAN ZHANG1,JINGUI QIN1,?,MAKOTO INOKUCHI2and MINORU KINOSHITA2 1Department of Chemistry,Wuhan University,Wuhan430072,China;2Department of Materials Science and Engineering, Science University of Tokyo in Yamaguchi,Onoda,Yamaguchi756-0884,Japan (Received:28Octoer2002;in?nal form:23May2003) Key words:intercalation,layered FePS3,4-aminopyridine,XRD,IR,paramagnetism Abstract A new intercalation compound,Fe0.81PS3(4-aminopyridineH)0.38,is synthesized by the direct reaction of4-aminopyridine with layered FePS3in the presence of acetic acid.From the XRD results it was found that there are two phases(Phase I and Phase II)in this intercalation compound and that4-aminopyridines as the guests adopt two different orientations between the interlayer region of the host(FePS3).In one of them with the lattice expansion( d)of6.0?the ring plane of the guest is perpendicular to the layer and in the other with d of3.4?the ring plane of the guest is parallel to the layer of the host. The IR spectra imply that the inserted guests take the protonated form to maintain the charge balance of the intercalation compound.Magnetic measurements indicate that Fe0.81PS3(4-aminopyridineH)0.38exhibits paramagnetism in the range of measurement temperature(1.8～300K),where the magnetic behavior is well in agreement with the Curie-Weiss Law above 55K. Introduction In recent years much interest has focused on the inorganic-organic hybrid compounds because this offers perspectives for the realization of molecular-based materials,especially those that can combine different properties such as metal-like conductivity and bulk ferromagnetic property in a single material[1].Intercalation of organic species into layered inorganic solids represents one of the useful approaches to create the ordered molecular-based materials with some novel properties[2]. The MPS3compounds,in which M is a divalent trans-ition metal,are a class of layered inorganic materials. They crystallize to space group C2/m,a monoclinic unite cell related to CdCl2-type structure with metal ions and phosphorus-phosphorus pairs occupying the cadmium pos-itions and sulfur ions occupying the chloride positions,so M ions construct a honeycomb lattice in the ab plane and they are separated by Van der Waals gap between hexagonal layers of sulfur ions[3].Some MPS3phases containing the paramagnetic M2+ions(Mn2+,S=5/2;Fe2+,S =2;Ni2+,S=1)show the quasi-two-dimensional anti-ferromagnetism with a Néel temperature of78K,120K and153K,respectively[4].When guest species are in-serted into the interlayer space of MPS3(M=Mn,Fe), they can lead to the occurrence of some intralamellar M2+ ion vacancies that makes the magnetic properties of the MPS3host lattice be changed and even dramatically altered [5–8].In this paper,the synthesis,structural characteriza-?Author for correspondence.E-mail:jgqin@https://www.doczj.com/doc/9613146655.html, tion and magnetic property of the intercalation compound (Fe0.81PS3(4-aminopyridineH)0.38)are presented and a pos-sible intercalation process is proposed for4-aminopyridine into layered FePS3. Experimental X-ray powder diffraction(XRD)patterns were obtained with Dmaxr A X-ray diffractometer using Cu Kαradiation(λ= 1.5418?).Infrared spectrum was performed on a Nicolet SX Fourier transform spectrometer.Elemental analysis was performed with a Carlorba-1106microanalyzer,and the magnetic property was studied by a SQUID-magnetometer (MPMS,Quantum Design). Pure FePS3was synthesized as described by Taylor [9].It was identi?ed by means of XRD and indexed in a monoclinic unit cell(space group C2/m,d=6.439?, a=5.934?,b=10.280?,c=6.722?,β=107.16?) [10].4-aminopyridine was purchased from Aldrich and 4-aminopyridine·HCl was synthesized by the reaction of 4-aminopyridine with chloride acid(HCl36.5%,AR). The intercalation compound Fe0.81PS3(4-amino-pyridineH)0.38was prepared by stirring the mixture of FePS3 (0.20g,1.1mmol),4-aminopyridine(0.60g,6.4mmol)and acetic acid(HOAc)(1.0mL)in a Pyrex ampoule containing 12mL acetonitrile sealed under vacuum for two weeks at70?C.The black powder was?ltered off,and washed with acetonitrile,ethanol and distilled water,and then dried in air.Elemental analysis led to the formula Fe0.81PS3(4-
第!期中!国!科!学!基!金"# !! !学科进展与展望! 合成生物学研究的进展 !!"中国科学院院士$ 本文于!%%&年’!月!"日收到$张春霆" !天津大学生命科学与工程研究院"天津(%%%)!# "摘!要#!本文简要介绍了合成生物学发展的历史背景与定义"它的主要研究内容"包括基因线路$合成基因组$合成药物与生物基产品或材料等%探讨了合成生物学与基因工程的异同"介绍了合成生物学在中国的发展情况"讨论了伦理道德与安全问题"最后展望了合成生物学的发展前景% "关键词#!合成生物学!基因线路!合成基因组!合成药物!合成生物基产品或材料!合成*+,序列 !!合成生物学的历史背景与定义 ’--%年人类基因组计划启动!随后模式生物基因组计划也快速实施!产生了大量的基因组*+,序列信息"由于新技术的出现!又促进了转录组学#蛋白质组学和代谢组学等的产生和发展"这一切又催生了一系列新兴交叉学科!如生物信息学和系统生物学等"基础研究的成果最终要转化为生产力!而合成生物学在!’世纪初的出现则是上述学科发展的一个合乎逻辑的结果"那么什么是合成生物学呢$合成生物学网站是这样介绍的%合成生物学包括两重意义%&’’新的生物零件&./01’#组件&234563’和系统的设计与构建(&!’对现有的#天然存在的生物系统的重新设计!以造福人类社会&711.%))89:; 173156<5=>=?9$=0?)’"维基百科全书是这样描述的%合成生物学旨在设计和构建工程化的生物系统!使其能够处理信息#操作化合物#制造材料#生产能源#提供食物#保持和增强人类的健康和改善我们的环境&711.%))3:$@5A5.325/$=0?)@5A5)B9173156*<5=>=; ?9’" "!合成生物学的主要研究内容 "#!!基因线路$$%&%’())(*)+(’% 说起基因线路或基因回路!最早可追溯到C/6=<和D=:=2关于半乳糖操纵子模型的经典工作" !"#$%&杂志在!%%%年发表了基因振荡和基因双稳态两个基因线路!被认为是奠基性的工作"现在则 已发表了大量的有关基因线路的工作!本文不拟详加介绍"一个典型的基因线路是基因双稳态线路+’,!由两个蛋白质编码基因与两个相对应的启动子组成"线路是这样设计的%蛋白质’的表达抑制了蛋白质!的表达!系统只有蛋白质’存在(反之!蛋白质!的表达抑制了蛋白质’的表达!系统只有蛋白质!存在"可在双稳态线路中加入诱导物!促使系统在两个稳定状态之间任意翻转"基因线路有广泛的应用!因篇幅所限不能展开介绍!下面只介绍(个应用例子" &’’大肠杆菌照相术+!, 首先从集胞兰细菌基因组中克隆两个基因并转入大肠杆菌!使之能生成对光敏感的藻青素!简称E F G"接着利用大肠杆菌中双组份信号转导系统’()*+,-./!将与E F G共价结合的脱辅基蛋白与’()*的组氨酸激酶结构域融合构成一个嵌合体!成为一个光敏部件"同时!将0-.1基因与2"3*基因融合!通过在2"3*基因上游引入0-.1启动子使其表达依赖于,-./"通过这一基因线路!2"3*基因的表达就会受光调控"当有红光照射时&相当于被摄物体的光亮部分’!’()*的自磷酸化被抑制!从而,-./不能被磷酸化激活!2"3*基因关闭!由涂抹在琼脂基片上的菌苔形成的底片保持原色"当没有红光照射时&相当于被摄物体的黑暗部分’!过程正好相反!’()*的自磷酸化被激活!从而使2"3*基因被磷酸化的,-./激活而表达!其产物为半乳糖苷酶!催化菌苔中的B;?/>&一种化合物’反应生成