食品生物化学实验指导书
食品科学与工程学院
实验一糖的颜色反应及还原性检验
A. 莫氏试验①
一、目的
掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。
二、原理
糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚②生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。
三、实验器材
棉花或滤纸；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；试管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml （×5）；烧杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。
四、实验试剂
莫氏试剂：称取α-萘酚2.5g，溶于95％乙醇并稀释至50ml。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。
1％蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。
五、操作
于5支试管中，分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液与1％淀粉溶液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫氏试剂2－3滴①，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸 1.5ml（切勿振摇！！！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。
注意：①一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。
②亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替α-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。
B. 塞氏试验
一、目的
掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。
二、原理
酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液②。
三、实验器材
1．吸管0.5ml（×3）、5.0ml（×1）。
2．试管1.5cm×15cm（×3）
3．水浴锅。
四、实验试剂
1．塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中[VH2O：V(HCl)=2：1]，临用时配制。2．1％蔗糖溶液：同试验A。
3．1％葡萄糖溶液：同试验A。
4．1％果糖溶液：同试验A。
五、操作
于3支试管中分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液各0.5ml，各加塞氏试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴中，比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。
六、问答题
1、分别写出两个实验的实验结果并进行分析。
C．糖的还原性检验
一、目的和要求
了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、原理
在碱性溶液中，具有自由醛基或酮基糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本身被氧化成酸类化合物。斐林试剂和班乃德试剂均为含Cu２＋的碱性溶液,还原糖被还原成红色或黄色的Cu2O。此法常用作还原糖的定性或定量测定。
三、材料与仪器
吸管1ml（×5），2ml（×1）；试管1.5×15cm；水浴锅
四、试剂
斐林试剂（Ａ液）：称取15g硫酸铜(CuSO4·5H2O)及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。
斐林试剂（Ｂ液）：碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。
班乃德试剂：取无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml；取柠檬酸钠173g，无水Na2CO3 100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml，然后将150mlCuSO4溶液倒入混合即成。此试剂可长期使用。
１％淀粉溶液
１%蔗糖溶液
１%葡萄糖溶液
五、操作
1、于３支试管中各加入斐林试剂Ａ和Ｂ液１ml,混匀,分别加入１%葡萄糖、１%蔗糖和１%淀粉溶液１ml，置沸水浴中加热数分钟,冷却,观察各试管的变化.
2、另取３支试管,分别加入１%葡萄糖、１%蔗糖和１%淀粉溶液１ml,然后每管加入班乃德试剂２ml,置沸水浴中加热数分钟,取出冷却,和上面结果比较.
六.思考题
斐林反应与班乃德反应都发生了什么化学变化?
实验二卵磷脂的提取和鉴定
一、目的和要求
掌握卵磷脂的提取方法及其鉴定方法。
二、原理
卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶剂，可利用此溶剂提取。新提取的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而成黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，具有特殊的鱼腥味，可鉴别。
三、试剂和器材
（一）试剂
1.鸡蛋卵黄
2.95%乙醇
3.10%NaOH溶液
（二）器材
1.烧杯
2.漏斗
3.蒸发皿
4.水浴锅
5.试管
6.量筒
四、操作步骤
1.提取：于小烧杯内置蛋黄2g，加入热95%乙醇15mL，边加边搅，冷却，过滤，如滤液混浊，需重滤直到完全透明。将滤液置蒸发皿内，蒸气浴上蒸干，残留物即卵磷脂。
2.鉴定：取提取的卵磷脂少许，置试管内加 10%NaOH溶液2mL，水浴加热，是否产生鱼腥味。另取一些卵磷脂溶于1mL乙醇中，添加1～2mL丙酮，观察变化。
五、思考题
1.卵磷脂的主要生理功能有哪些?
2.工业用大豆卵磷脂是如何制备的?
3. 卵磷脂在食品工业的应用有哪些?
实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、实验目的
1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理
2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、实验内容
对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。
三、实验操作
（一）双缩脲反应
1、实验原理
当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。
2、试剂
(1)尿素
(2)10%NaOH溶液
(3)1%CuSO4溶液
(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
3、操作
（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液1 ml和1% CuSO4 2~3滴，混匀后观察颜色的变化。
（2）另取一试管，加蛋白质溶液1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。
（二）茚三酮反应
1、实验原理
除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为5~7。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。
2、试剂
蛋白质溶液（同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液
3、操作
取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1 ml，再各加0.5 ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴加热2~3分钟，观察颜色变化。
（三）蛋白黄色反应
1、实验原理
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变
为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。
2、试剂
(1)蛋白质溶液（同前）；(2)头发；(3)指甲屑；(4)0.5%苯酚溶液；(5)0.3%酪氨酸溶液；
(6)10%NaOH溶液；(7)浓硝酸（ρ=1.42克/毫升）
3、操作
取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%NaOH溶液直至碱性，观察颜色变化。
（四）乙醛酸反应
1、实验原理
含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。
2、试剂
(1)蛋白质溶液（同前）。
(2)0.03%色氨酸溶液。
(3)冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。
(4)浓硫酸（分析纯）。
3、操作：
取2支试管，分别加入蛋白质溶液及色氨酸各2滴，再加浓冰醋酸约1~2毫升，混匀，倾斜试管慢慢地沿管各加浓硫酸1毫升，使之两相重叠，静置5分钟后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可在水浴加热。
（五）偶氮反应
1、实验原理
偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则应产物分别为橙红色和樱红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。
2、试剂：
(1)蛋白质溶液（同前）；(2)0.3%组氨酸溶液；(3)0.3%酪氨酸溶液；(4)20%NaOH溶液；(5)重氮试剂
溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000毫升水中。
溶液B：溶解5克ɑ-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升浓硫酸。A、B 液分别存在密闭瓶中，用时以等体积混合。
3、操作：
取3支试管分别加入0.3%组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各4~5滴，再分别加重氮试剂A、B各10滴，振摇，混匀，取后向3支试管分别加入20%NaOH溶液2~3滴，观察各
试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。
（六）、醋酸铅反应
1、实验原理
多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。
2、试剂
(1)未稀释的鸡蛋清。
(2)10%的NaOH溶液
(3)1.5%Pb(Ac)2溶液（醋酸铅溶液）
(4)浓盐酸
(5)醋酸铅试纸(将滤纸条浸入醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可)
3、操作：
向试管中先加入1.5% Pb(Ac)2溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加蛋白质溶液5~6滴，混匀。置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。
实验四蛋白质的沉淀反应
一、目的
1．熟悉蛋白质的沉淀反应。
2．进一步掌握蛋白质的有关性质。
二、原理
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
三、实验器材
1．试管1.5cm×15cm（×7）。2．吸管5.0ml(×2)、2.0ml(×2)、1.0ml(×1)。
3．吸滤瓶500ml(×1)。4．布氏漏斗。
四、实验试剂
1．蛋白质试液：见实验二十三卵清蛋白液。
2．硫酸铵晶体：如果晶体太大，最好研碎。
3．饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。
4．95%乙醇。
5．结晶氯化钠。
6．1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。
7．5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ml。
8．1%硫酸铜溶液：见实验二十三。
9．饱和苦味酸溶液。
10．1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。
五、操作
A、蛋白质盐析作用
向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。
操作方法：
1．取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。
2．将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
注意
（1）应该先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液。
（2）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。
B、乙醇沉淀蛋白质
乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。
操作方法
取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。
C、重金属盐析沉淀蛋白质
蛋白质与重金属离子（如Cu2+、Ag+、Hg2+等）结合成不溶性盐类而沉淀。
操作方法
取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。
D、生物碱试剂沉淀蛋白质
植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。
操作方法
取试管2支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4~5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加苦味酸溶液数滴，观察结果。
实验五醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
一、实验目的
掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。
血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。
在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。
三、实验器材
1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）
2、人血清；
3、烧杯及培养皿数只；
4、点样器；
5、竹镊子；
6、玻璃棒；
7、电吹风；
8、试管六只；
9、恒温水浴锅；
10、电泳槽；
11、直流稳压电泳仪；
12、7220型分光光度计；
13、剪刀
四、实验试剂
1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6)：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠12.76g和巴比妥1.66g 溶解于500ml蒸馏水中,混匀；
2、染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇（A.R.）、冰乙酸（A.R.）10ml、加蒸馏水40ml，混匀即可，可反复使用；
3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸5ml，加蒸馏水50ml，混匀；
4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液；
5、透明液：取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。
五、实验操作
1、准备和点样
取一条醋酸纤维薄膜，浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液；
用玻棒蘸取少量血清，涂在点样器上，然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的纱布上，点样端为阴极；
2、电泳
接通电源，设定电泳电压为100V，通电50分钟；
3、染色.
完毕，将薄膜浸于染色液中5~10分钟，取出，用漂洗液漂至背景无色（约4~5次），再浸于蒸馏水中。....
实验六酵母RNA的提取与鉴定
一、目的
掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法
二、原理
酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2％。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
三、实验器材
1、干酵母粉（市售）。
2、鲜酵母（市售）。
3、pH试纸（pH1~~14）。
4、电子天平。
5、烧杯100mL(×1)。
6、量筒50mL（×1）、10mL(×1)。
7、抽滤瓶500mL(×1)。8、布氏漏斗ф10cm(×1)。
9、吸管0.50mL（×1）、1.0mL(×2)、2.0mL(×2)、5.0mL(×1)。10、离心机4000r/min。
四、实验试剂
1、0.2％氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。
2、乙酸（A .R）
3、95％乙醇
4、无水乙醚（A. R）
5、氨水（A. R）
6、10％硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。
7、5％硝酸银溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL,存于棕色瓶中.
8、苔黑酚--三氯化铁试剂:将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中,再加入100mg FeCl3·6H2O，临用时配制。
五、操作
1、RNA的提取
称取8g干酵母粉于100mL烧杯中, 加入0.2%NaOH溶液40mL,沸水浴加热30min, 经常搅拌. 冷却,加入乙酸数滴,使提取液呈酸性(pH5~6,用石蕊试纸试之), 离心10~15min(4000r/min). 取上清液, 加入2倍体积的95%乙醇, 边加边搅. 加毕, 静置, 待完全沉淀, 过滤. 滤渣先用95%乙醇洗2次(每次约10mL), 继而用无水乙醚洗2次(每次10mL),洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后, 滤渣即为粗RNA, 可作鉴定和测定含量用。
2、鉴定
取上述RNA约0.5g, 加10%硫酸液5mL, 于三角瓶中,沸水浴上加热水解20min左右，将RNA水解.
(1)取水解液0.5 mL, 加苔黑酚--三氯化铁试剂1mL, 加热至沸1min, 观察颜色变化.
(2)水解液2 mL, 加氨水2 mL及5%硝酸银溶液1 mL, 观察是否产生絮状的嘌呤银化
合物.
(3) 磷的鉴定取水解液2ml，加入5滴浓硝酸和1ml 钼酸铵溶液，沸水浴加热2~3min，可见黄色的磷钼铵沉淀生成。
实验七 POD 活性的测定
一、原理
过氧化物酶（POD ）催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H 2O 2将愈创木酚氧化，生成茶褐色产物。此产物在波长470nm 处有最大光吸收，故可通过测470nm 处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性。
二、实验材料、仪器和试剂
1、实验材料
马铃薯块茎、苹果 2、仪器
721型分光光度计（配10mm 比色皿4个）；离心机（配10ml 离心管）；瓷研钵（配研钵棒）；移液枪0.2ml1支、1ml 两支；移液管（1ml 1支）；50ml 烧杯一个 3、试剂及其他
（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH 值7.0） （2）0.05mol/L 愈创木酚溶液 （3）2％H 2O 2溶液 （4）PVP （聚乙烯吡咯烷酮） （5）纸巾适量 （6）滤纸或称量纸适量 （7）碎冰适量
三、实验步骤
（1） 酶液的制备：取1.00g 洗净去皮的马铃薯块茎或去皮苹果，切碎，放入研钵中，加
4ml 磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，以13000r/min 的转速离心15min ，去除沉淀，上清液低温下保存备用。
（2） 过氧化物酶活性的测定：测定酶活性的反应体系包括0.1ml 酶液、1ml0.05mol/L 愈
创木酚溶液和2.0ml2％H 2O 2溶液，以空气调零。反应体系加入酶液后，立即用721型分光光度计在波长470nm 处测反应体系3min 内吸光度，每隔30秒读数一次。
（3） 步骤（2）重复三次。
四、结果计算
以每分钟A 470nm 变化0.01为1个过氧化物酶活力单位，计算马铃薯过氧化物酶的活力及比活力。
D t
01.0A U nm
470???）＝
酶活力（
D wt
01.0A
U/g ???）＝
比酶活力（
式中：△A 为反应时间内吸光值的变化；W 为马铃薯鲜重（g ）；t 为反应时间（min ）；D 为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。
五、思考题
（1） 记录实验结果并计算，分析结果。
（2）若有活性已知的辣根过氧化物酶，设计一个实验，以辣根过氧化物酶为标准绘制标准曲线，测定某植物中过氧化物酶的活力。
（3）酶活力的单位可用g（鲜重）、g（干重）及mg（蛋白）3种方式来表示，哪种表示好些？为什么？
实验八发酵过程中的中间产物的鉴定
一、实验目的
1.学习在无氧条件下，葡萄糖的氧化作用。
2.掌握检测代谢中间物存在的方法。
二、实验原理
在酵母菌中，葡萄糖经一系列反应首先产生丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下转变为乙醛，后者接受NADH2中的2H而还原为乙醇，即生醇发酵。
在正常情况下，代谢中间物丙酮酸、乙醛存在的量是不多的，为了证明它们作为反应途径的中间代谢物存在着，可向反应体系中加入一些酶的抑制剂，在研究的条件下，抑制催化某一化合物转变的酶。或者改变生理条件，使酶的活性降低；或者加入一种“诱获剂”，使它与中间代谢物反应后形成一种不能进一步代谢的物质等。
在弱碱条件下，丙酮酸脱羧酸活性丧失。因此丙酮酸不能进一步代谢而累积下来，它的存在可以通过与硝普酸钠或2，4-二硝基苯肼反应来证明。
向反应混合物中加入亚硫酸钠，它可以“诱捕”乙醛，加入硝普酸钠或哌啶后，蓝色物质的形成说明有乙醛的存在。
三、试剂
1）0.5mol/L的磷酸氢二钠 7）5%的硝普酸钠（使用前制备）
2）磷酸二氢钾溶液（0.5mol/L） 8）浓氨水
3）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于9）硫酸铵
10ml磷酸氢二钠中（4℃冰箱保存）10）亚硫酸钠
4）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于11）10%的氢氧化钠
10ml磷酸二氢钾溶液中（4℃冰箱保存） 12）2，4-二硝基苯肼盐酸饱和溶液（以5）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于10ml 2mol/L的盐酸配制）水中（4℃冰箱保存） 13）三氯乙酸（5%）
6）10%的葡萄糖（4℃冰箱保存）
四、实验器材
1）37℃水浴 4）离心机
2）吸量管（5ml、2ml、1ml、0.5ml） 5）试管及试管架
3）离心管
五、实验操作
1.酵母菌的发酵作用
1) 取2支干净试管，编号为1和2。注意，试管口应平整。把二支试管放于冰浴中冷却。
2) 向每支试管中加入3ml预冷的葡萄糖溶液。
3) 向试管1加入3ml以磷酸氢二钠制备的酵母悬浮液，迅速混合后于试管口上放一个载玻片。
4)向试管2中加入3ml以磷酸二氢钾配制的酵母悬浮液，迅速混合后于试管口上放一个载玻片。
5) 把两支试管放于37℃水浴中精确保温1h，然后向每管中加入2ml三氯乙酸，充分混合后，在3000r/min下离心10min。
6)吸出上清液，监测丙酮酸的生成
2. 丙酮酸的检测
1)硝普酸钠试验
（1）取一支干净试管，加入大约1g硫酸铵，然后加入2ml煮沸过的上清液。
（2）向试管中加入2~5滴新鲜配制的硝普酸钠溶液，充分混合，沿管壁慢慢加入浓氨水使形成两层。
（3）如果有丙酮酸存在，在两液面交界处将产生绿色的或蓝色的环。由于巯基的存在，蓝色的或绿色的环出现之前，往往有桃红色的环出现，但存在的时间很短。
2）2，4-二硝基苯肼实验
取一支试管，加入2ml上清液，然后再加入1ml饱和的2，4-二硝基苯肼，充分混合。另取一支试管，加入2~5滴上述混合液，再加入1ml氢氧化钠溶液，然后加水到大约5ml，如果有丙酮酸存在，将出现红色。
3.中间产物乙醛的鉴定
1) 取三支干净试管，编号为，1、2和3。把三支管放入冰浴中冷却。
2)向管1中加入3ml水，向管2和管3中分别加入3ml葡萄糖溶液，然后再加入以水配制的酵母悬浮液3ml。
3)向管2中加入0.5g亚硫酸钠，充分混合。
4)把三支试管放于37℃水浴中保温1h。
5)将试管内容物在3000r/min下离心10min，取各管上清液检测乙醛的存在。
6)另取三支干净的试管，编号后分别加入管1、管2和管3的上清液2ml，再分别加入0.5ml新鲜配制的硝普酸钠及2ml哌啶，混合，若有乙醛存在，将有蓝色化合物产生。
.思考题：1. 试管为什么要放于冰浴中冷却？
2.硝普酸钠试验为什么要加硫酸铵？
3.试验过程中要注意哪些事项？
1、简述分光光度法的原理和分光光度计的操作步骤。 原理：物质对不同波长的光波有选择吸收的特性，利用单色光可测定物质对光的吸收能力。根据Lambert-Beer定律:A=lgl／T=lgI。／I=εbC，在分光光度计的测定范围内，可测定某一浓度物质的A值。 注:单色光、稀溶液、0.2-0.8、最大波长处、加合性 步骤：（1）预热：通电，开盖，选择“T”，预热20min（2）取比色杯。 光面为光通路，手拿毛面，样品入比色杯后，滤纸擦拭杯外液体 （3）装样：空白管放在靠近自己的第一个孔，比色杯中液体占总体积2／3~4／5（4）调零：选“T”，关盖，按100:；开盖，按0.选择“A”，关盖，按0（5）测量 2、等电点的定义，为什么等电点时蛋白质溶解度最低？ 定义：蛋白质分子酸性离解与碱性离解相等，静电荷和净迁移率均为0时溶液的pH为该蛋白质的等电点 等电点时蛋白质处于等电状态，蛋白质颗粒上的静电荷为零，无电荷间的排斥作用，容易凝集成大颗粒而沉淀，因而最不稳定，溶解度最小。 3、以实验folin酚法测定人体血清蛋白含量为例，说明样品待测液显 色浓度、样品待测液浓度与样品实际浓度三个基本概念。 样品待测液显色浓度：样品与显色试剂甲、乙显色后，和标准液进行颜色强度对比得出的样品浓度； 样品待测液浓度:稀释并显色后的样品由分光光度计测定A值，通过标准曲线法查得或标准管法求得的待测管的蛋白质浓度 样品实际浓度:稀释500倍的待测血清的实际浓度 4、以蔗糖为例，分三个方面简述蔗糖酶专一性测定原理。 蔗糖分子组成为α-吡喃葡萄糖-1,2-β-呋喃果糖，蔗糖酶专一水解α-吡喃葡萄糖-1,2-β-呋喃果糖苷键，故能催化蔗糖水解，水解产物与班氏试剂共热可产生红棕色沉淀。实验在同一条件下设置对照组和实验组，变量分别为pH值、温度、蔗糖酶的浓度。 5、简述醋酸纤维薄膜电泳法的原理及操作步骤。 原理： 用醋酸纤维素薄膜作为支持物，用合适pH值的缓冲液使Pr带电，在电场力作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。依据V=Eq／6πrη得蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。（血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH 7.5以下。将血清放于pH 8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来）。分离后的Pr经显色或紫外光等可进行测定。 步骤：1.泡膜（薄膜毛面一端1.5cm处铅笔划线） 2.准备仪器3.点样 4.电泳 5.检测鉴定（5.染色 6.浸洗 7.定量） 6、简述凝胶过滤层析法的原理和操作步骤。 原理：凝胶颗粒内部有大小不一的孔隙，且孔隙大小有一定范围，相对分子质量大的物质能够更容易从颗粒间缝隙通过而最先被洗脱出来，相对分
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2 滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
生化复习资料 考试： 名：10个（三、四） 选：10个（不含1、6、11、12） 3章重点维生素的载体、作用，嘌呤、嘧啶合成区别，核糖作用，一碳基团载体，ACP，载体蛋白，乙酰辅酶A缩化酶，生物素 填：20空（1、2、8） 简答：3个（1、6、7、8） 简述：3个（9、10、11、12） 血糖来源和去路，葡萄糖6-磷酸的交叉途径 实验与计算：（1、7） 一、名词解释 1、肽键：是一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基脱水缩合而成的酰胺键（-CO-NH-），称为肽键。是蛋白质结构中的主要化学键（主键） 2、盐析： 3、酶的活性中心：在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上的基团，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近，形成的具有一定的构象，直接参与酶促反应的区域。又称酶活性部位 4、米氏常数：是反应最大速度一半时所对应的底物浓度,即当v = 1/2Vm时，Km = S 意义：Ｋm越大，说明E和S之间的亲和力越小，ES复合物越不稳定。米氏常数Km对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个米氏常数。 5、氧化磷酸化：是在电子传递过程中进行偶联磷酸化，又叫做电子传递水平的磷酸化。 6、底物水平磷酸化：是直接由底物分子中的高能键转变成A TP末端高能磷酸键叫做底物水平的磷酸化。 7、呼吸链：线粒体能将代谢物脱下的成对氢原子(2H)通过多种酶和辅酶的链锁反应体系逐步传递,最后与激活的氧结合为水,由于该过程利用氧气与细胞呼吸有关,所以将这一传递体系叫做呼吸链。 8、生物氧化：糖类、脂肪和蛋白质等有机化合物在生物体内经过一系列的氧化分解，生成CO2和水释放能量的总过程叫做生物氧化。 9、葡萄糖异生作用：由非糖前体物质合成葡萄糖的过程。 10、戊糖磷酸通路：指机体某些组织以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程。 11、激素敏感激酶： 12、酮体：脂肪酸在肝脏中氧化分解所生成的乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮三种中间代谢产物，统称为酮体。 13、饲料蛋白质的互补作用：把原来营养价值较低的不同的蛋白质饲料混合使用，可能提高其营养价值和利用率。 14、氮平衡：是反映动物摄入氮和排除氮之间的关系以衡量机体蛋白质代谢概况的指标。 15、从头合成途径：利用氨基酸等作为原料合成 16、补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月
实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆 2．移液管的使用： 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3．离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 4．分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 5．水浴锅的使用 三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写） 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论
实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾－碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 （一）淀粉酶的观察 1、取3支大试管，编号后按表操作 2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应
1．火 （1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火 （2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。 （3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。 2．烧伤 （1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。 （2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。 氨基酸的分离鉴定纸层析法 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层 析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大 小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量 和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨 基酸。 在操作过程中，手不要摸滤纸。 点样直径不超过3mm 。 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。 蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应 紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
生物化学实验报告 姓名： 专业： 院系： 学号：
实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体
积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成： Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积；Vi内体积；Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
实验1 氨基酸纸层析 一、实验目的 通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。 二、实验原理 层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。 层析的种类： 根据原理分为： a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d 离子交换层析 根据支持物分为： a 纸层析 b 柱层析 c 薄层层析 d 凝胶过滤层析 分配层析的原理： 各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。 分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。 一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数。 物质在流动相里的浓度 物质在固定相里的浓度 纸层析: 分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf ）值表示： 色斑中心至上样原点中心的距离 K D = 图1 氨基酸纸层析示意图 R f =
溶剂前缘至上样原点中心的距离 载体：滤纸 固定相：滤纸吸附的水 流动相：水饱和酚 极性：谷氨酸＞丙氨酸＞脯氨酸 对于水－饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，Ｒｆ值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。 三、实验材料 仪器 ⑴层析缸；⑵层析滤纸；⑶电吹风机；⑸喷雾器；⑹毛细管。 试剂 ⑴氨基酸标准液（6mg/mL）；⑵氨基酸混合液（6mg/mL) ⑶展层剂：水饱和苯酚溶液。 ⑷显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液 四、操作步骤 1、层析滤纸的准备 用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。 2、点样(少量多次) 用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.5cm，干燥后再点样，重复3次。 3、展层 将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。 4、显色 滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干。
● 氨基酸的分离鉴定（纸层析法） 分配层析：是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。（固定相和流动相） 分配系数：在一定条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。 纸层析法：是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置使用R ?值（比移）来表示： 影响Rf 值的因素：在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 纸层析过程：点样，扩展，显色，计算 扩展剂（展层剂）：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，上层即为扩展剂。 显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液 ● 蛋白质的性质实验（等电点测定和显色反应） 等电点：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH 值称为此种蛋白质的等电点（pI ）。 蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。（水化层和双电层） 蛋白质的沉淀反应可分为两类：可逆的沉淀反应（蛋白质分子的结构尚未发生变化。如盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。）不可逆的沉淀反应（蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类) 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取0.4g 酪蛋白（干酪素），加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬浮液移入200mL 锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100mL 容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲液：先配制A 液与B 液，取A 液1770mL ，B 液1230mL 混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL 。A 液（0.2mol/L 醋酸钠溶液）：称NaAc ?3H2O 54.44g ，定容至2000mL 。B 液（0.2mol/L 醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g 定容至1000mL 。 ● 透析实验 透析：蛋透析是利用半透膜进行的一种选择性扩散操作，通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。（白质的透析和糖类的透析） ● 蛋白质的含量测定（一）——考马斯亮蓝染色法 分光光度法：是一种利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法。 分光光度计都包括光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置（显示仪表）。 在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机玻璃比色杯。 考马斯亮蓝G-250染色法优点：简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、NH42+以及乙醇等物质都不干扰测定。缺点：但一些去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定，且样品测定后不能回收。 考马斯亮蓝G-250原理：（染料结合法）在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在465nm ，后者在595nm ，在一定蛋白质浓度范围内（0.01～1.0mg/mL ），蛋白质-色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。 ● 蛋白质的含量测定（二） ——紫外吸收法 紫外吸收法的原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm 。在一定波长处，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度成正比，因此可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法的优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用；低浓度的盐和大多数缓冲液都不干扰测定，适合柱层析洗脱液的快速连续检测。 紫外吸收法的缺点：准确度较差，干扰物质多；在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差；样品中若含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰；测定时受样品的pH 影响较大， ● 蛋白质的性质实验（蛋白质及氨基酸的橙呈反应） 双缩脲反应：尿素加热至此180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，结构与双缩脲相似，能发生此反应。故该方法可用于蛋白质的定性或定量测定。 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析中心的距离 R f
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实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
吉大《生物化学（含实验）》（二） 第二章蛋白质的结构与功能 一、简述蛋白质有哪些生物学功能？ 1、生物催化作用 2、代谢调节作用 3、免疫保护作用 4、物质的转运与储存 5、运动与支持作用 6、生长、繁殖、遗传和变异作用 7、生物膜的功能和受体 8、其他功能：眼视网膜上感光的视蛋白；味蕾上的味觉蛋白。 9、蛋白质药物 二、写出定氮法测定蛋白质含量通式。 蛋白质的含量 = 蛋白质含氮量 *100/16 = 蛋白质含氮量 * 。三、组成人体蛋白质的氨基酸有多少种？写出氨基酸的结构通式。1）组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种。 2）R - CH ( N H 2) - COOH （R为不同的侧链基团）。 四、人体20种氨基酸，根据侧链R的结构和性质分为哪几类？ 根据侧链R的结构和性质分4类： 1、极性非电离氨基酸（极性中性氨基酸） 2、非极性疏水氨基酸 3、酸性氨基酸 4、碱性氨基酸 五、根据氨基酸的结构可将20种氨基酸分为哪几类？
脂肪族氨基酸、支链氨基酸、芳香族氨基酸、杂环氨基酸、杂环亚氨基酸。 六、氨基酸的理化性质有哪些？ 1、带电性质与两性解离及其等电点 （1）氨基酸既含羧基，又含氨基，同时能起酸和碱的作用，是两性电解质，在水溶液中以兼性离子的形式存在。（2）氨基酸的等电点。 2、紫外吸收性质 3、茚三酮颜色反应 4、氨基酸的旋光性 5、氨基酸的晶体性质 6、氨基酸的溶解性 七、简述茚三酮颜色反应的原理。 原理：在弱酸的条件下氨基酸与茚三酮水合物供热；氨基酸产生氮；茚三酮水合物被还原产生还原物； 还原物与氮及其另一分子的茚三酮缩合；缩合物承揽紫色，最大吸收峰在570mm。 八、何谓蛋白质的一级结构？维持蛋白质一级结构的化学键有哪些？ 1、蛋白质中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构（primary structure）。 2、肽键是一级结构的主要化学键。有些蛋白质还包含二硫键（-S-S-），即由两个半胱氨酸巯基脱氢氧化而成。 九、蛋白质一级结构的意义？ 1、它使人们从根本上认识由于20种氨基酸排列顺序不同而组成多样的三百只，并具有不同的生物功能。 2、一级结构的测定还应用在临床医学中，许多先天性疾病是由于某一重要蛋白质一级结构发生改变而引起。因为蛋白质一级结构中氨基酸排列顺序是由遗传密码锁决定，氨基酸的改变最根本原因是DNA碱基顺序的改变所致，因此研究蛋白质的一级结构有助于从分子水平诊断和治疗遗传病。 十、蛋白质的二级结构的类型有哪些？维持二级结构稳定的化学键是什么？ 蛋白质的二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。 维持二级结构稳定的化学键是氢键。
实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。 二.基本原理 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。 在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。
生化检测实验讲义 实验一粮食、油料检验-脂肪酸值测定法 一、实验目的 粮食在储藏过程中受到温度、水分和酶的影响，其脂类物质易发生水解和氧化反应。水解造成粮食游离脂肪酸含量增加，对粮食的种用品质和食用品质产生不良影响。粮食游离脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g粮食试样中的游离脂肪酸值所需氢氧化钾的毫克数。通过脂肪酸值的测定，可以判断粮食品质的变化情况，推测储藏方法是否适当。 通过本实验要求掌握测定脂肪酸值的技术。 二、原理 浸出法。脂肪酸能溶于有机溶剂，利用苯来浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用标准KOH溶液中和脂肪酸，根据滴定时所消耗的碱液数量，就可求出脂肪酸值。 三、材料、仪器和试剂 1、材料 大米 2、仪器 带塞锥形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振荡器，漏斗 3、试剂 （1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液 先配制约0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀释至500mL （2）、苯，95%乙醇 （3）、0.04%酚酞乙醇溶液 0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。 四、操作方法 1、浸出 称取事先磨细的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml锥形瓶中，加入50ml苯，加塞摇动几秒钟后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置振荡器振荡30min(或用手振荡45min)，取出，将瓶倾斜静置数分钟，使滤液澄清。 注：粉碎后样品如在20℃以上室温放置，脂肪酸值会很快增加，因此，必须及时进行测定。 2、过滤 用快速滤纸过滤，弃去最初几滴滤液后用量筒收集滤液25ml。 3、滴定 将25ml滤液移入锥形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入锥形瓶中，立即用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈现微红色半分钟内不消失为止。记下所耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V1。 4、空白试验 取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氢氧化钾乙醇溶液滴定，记下耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V2。 五、结果计算 脂肪酸值以中和100g大米样品中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示。 脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M） V1：滴定样品所用的氢氧化钾乙醇溶液体积，ml， V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml,
2016—2017学年度第一学期 食品科学与工程学院《生物化学》期末考试试卷 注意事项:1. 考生务必将自己姓名、学号、专业名称写在指定位置； 2. 密封线和装订线内不准答题。 一、名词解释 (共8小题,每小题2.5分,共20分,答案写在试题第8页) 1. 蛋白质的一级结构 2. 变构效应 3. 透析 4. 增色效应 5.糖酵解 6. 三羧酸循环 7.半保留复制 8. 激素水平代谢调节 二、填空题(共40空,每空0.5分,共20分) 1、蛋白质可受 酸 、 碱 、或 酶 的作用而水解,最后彻底水解为各种 氨基酸 的 混合物。 2、酶活性中心与底物相结合那些基因团称 结合基因 ,而起催化作用的那些基因团称 催化基因 。 3、核酸完全水解的产物是 磷酸 , 含氮碱基 和 戊糖 。 其中 含氮碱基 又可分为 嘌呤 碱和 嘧啶 碱。 4、大多数蛋白质中氮的含量较恒定,平均为__16_%,如测得1克样品含氮量为10mg,则蛋白质含量为 __6.25__%。
5、由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在分子结构中含有__共轭__双键,所以在波长__280nm__处有特征性吸收峰,该特点称为蛋白质的__紫外吸收__性质。 6、当非竞争性抑制剂存在时,酶促反应动力学参数如下Km__不变__,Vmax__降低__。 7、决定蛋白质的空间构象和生物学功能的是蛋白质的__一__级结构,该结构是指多肽链中__氨基酸残疾__的排列顺序。 8、最适温度__不是__酶的特征性常数,它与反应时间有关,当反应时间延长时,最适温度可以__降低__。 9、DNA分子中,两条链通过碱基间的__氢键__相连,碱基间的配对原则是A对__T__、__G__对__C__。 10、三羧酸循环过程中有_____4______次脱氢和_____2____次脱羧反应；该循环的三个限速酶是___柠檬酸合成酶___、____异柠檬酸脱氢酶____和___α—酮戊二酸脱氢酶____ 11、tRNA的三叶草型结构中,其中氨基酸臂的功能是__与氨基酸结合___,反密码环的功能是__识别并结合mRNA__。 12、DNA复制时,连续合成的链称为__前导链__链；不连续合成的链称为__后随链__链。 13、RNA的转录过程分为__起始___、___延长___和__终止__三个阶段。 14、糖异生的主要器官是线粒体。 三、单项选择题(共10小题,每小题1分,共10分) 1.下面好有两个羧基的氨基酸是( D ) A.精氨酸 B.甘氨酸 C.色氨酸 D.谷氨酸 2.下列叙述中不属于蛋白质一级结构内容的是( C ) A.多肽链中氨基酸残基的种类、数目、排列次序 B.多肽链中氨基酸残基的键链方式 C.多肽链中主肽链的空间走向,如a-螺旋 D.胰岛分子中A链与B链间含有两条二硫键,分别是A7-S-S-B7,A20-S-S-B19 3.下列辅因子中,不包含腺苷酸的辅因子是( C ) A.CoA B.NAD＋ C.FMN D.维生素C
生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么？ 答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些？ 答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法； (2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等； (3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？ 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 （1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ 答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答：防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在等电点时蛋白质溶解度为什么最低？ 请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
蛋白质是两性电解质，在等电点时分子所带净电荷为零，分子间因碰撞而聚沉倾向增加，溶液的粘度、渗透压减到最低，溶解度最低。结果中pH约为4.9时，溶液最浑浊，达到等电点。 答： 2、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？ 答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。 实验七氨基酸的分离鉴定－纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？ 答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。 3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ 答:
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。