第2讲细胞工程
1．(2017年江苏卷)牛雄性胚胎中存在特异性H－Y抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H－Y单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行制药。下列相关叙述正确的是( )
A．H－Y单克隆抗体由骨髓细胞分泌
B．应选用原肠胚做雌雄鉴别
C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植
D．用H－Y抗原免疫母牛可获得相应抗体
【答案】D
【解析】单克隆抗体是杂交瘤细胞分泌的，A错误。通常选用囊胚的滋养层细胞进行胚胎性别鉴定，B错误。因为是利用乳腺生物反应器进行生物制药，则鉴别后的雌性胚胎应进行筛选，选出形态正常、发育良好的雌性胚胎进行移植，C错误。用H－Y抗原免疫母牛，会刺激母牛的免疫系统，产生相应的抗体，D正确。
2．(2017年海南卷)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：
(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是__________________________________________________。
(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到______________。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是______________(填“具有完整的细胞核”“具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。
(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是__________________________________。
A中的愈伤组织是叶肉细胞经__________形成的。
(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，______(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是____________________________________________ ________________________________________________________________________。
【答案】(1)绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株
(2)葡萄糖、果糖具有完整的细胞核
(3)细胞分裂素、生长素脱分化
(4)不能对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株
【解析】(1)绿色叶片和白色花瓣是细胞分化的结果，遗传物质并没有改变，所以以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性。(2)一分子蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖组成，所以蔗糖水解后可得到葡萄糖、果糖。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是具有完整的细胞核。(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是细胞分裂素、生长素。A中的愈伤组织是叶肉细胞经脱分化形成的。(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖；在培养时，不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，通过减数分裂形成花粉粒，可以导致等位基因分离，非同源染色体上的非等位基因自由组合等，花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，后代会出现性状分离，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株。
3．(2017年全国新课标Ⅲ卷)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA 聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为__________，加入了________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________________________________。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是
__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少__________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
【答案】(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
(2)模板dNTP
(3)①进行细胞传代培养维持培养液的pH ②C
【解析】(1)由基因乙的碱基序列可知，由该序列转录出的mRNA无起始密码子，所以在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列后，所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。(2)PCR反应体系中除了加入了DNA聚合酶、引物等，还应加入序列甲作为模板，加入四种脱氧核苷酸(dNTP)作为合成DNA的原料。(3)当细胞浓度达到a时，T淋巴细胞的浓度不再增加，是因为出现了接触抑制现象，所以可以进行细胞传代培养，使T淋巴细胞继续增殖；培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是维持培养液中的pH。根据图2可知，甲、乙两组的T淋巴细胞数量多，丙组的T淋巴经胞数量少，根据图1比较可知，丙组T淋巴细胞少的原因是蛋白丙缺少C片段所编码的肽段。
4．(2016年全国新课标Ⅱ卷)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用______________的方法。②代表的过程是__________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中________________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了________________________________________________________________________。
【答案】(1)XX或XY 显微操作(去核法) 胚胎移植
(2)遗传物质
(3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响
(4)已经分化的动物体细胞核具有全能性
【解析】(1)提供体细胞的供体可能为雌性，也可能为雄性，因此图中A(正常细胞核)的性染色体组成为XX或XY。常采用显微操作去核法来去除卵母细胞的细胞核。②过程表示将早期胚胎移入受体，其过程为胚胎移植。(2)取供体动物的体细胞培养，一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。超过10代继续培养，则其遗传物质(或核型)的稳定性会降低。(3)克隆动物的细胞核基因来自供体，因此大部分性状与供体相同，但细胞质基因来源于受体(或提供卵母细胞的个体)，即卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响，这就决定了克隆动物的性状与供体不完全相同。(4)克隆动物的培育采用的是核移植技术，核移植技术的原理是已经分化的动物体细胞核具有全能性。
5．(2014年全国新课标Ⅰ卷)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是___________________________________________ ________________________________________________________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。
(4)未融合的B淋巴细胞经过多次传代培养后都不能存活，原因是________________________________________________________________________。
【答案】(1)4 Y Y小鼠的血清抗体效价最高
(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
(3)1 100 (4)不能无限增殖
【解析】(1)分析题图可知，经4次免疫后，小鼠Y的血清抗体效价就可达到16 000以上。由于4次免疫后的Y小鼠的血清抗体效价最高，故最适合用于制备B淋巴细胞。(2)细胞融合实验中，由于细胞融合是随机的，而且诱导融合率不可能达到100%，所以会有未融合的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞、融合的具有同种核的细胞和杂交瘤细胞。(3)杂交瘤细胞同时具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的核物质，但细胞核只有一个。由于杂交瘤细胞在分裂过程中染色体会丢失，故细胞核中染色体数目最多是40＋60＝100(条)。(4)B淋巴细胞已经分化，没有无限增殖的潜能。
6．(2014年广东卷)铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一。应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎(简称PLBs，类似愈伤组织)生产生物碱的实验流程如下：
在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图所示，请回答下列问题：
(1)选用新生营养芽为外植体的原因是________________________________，诱导外植体形成PLBs的过程称______________。
(2)与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在______________，______________，______________。
(3)脱落酸(ABA)能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案时探讨了以下问题：
①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设置4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基___________________后按比例加入。
②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品(PLBs)称重(g/瓶)后再测定生物碱含量。如初始(第0天)数据已知，实验过程中还需测定的样品数为________。
③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品(重复样)的________________________________________________________________________
时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。
【答案】(1)细胞分化程度低，容易诱导形成PLBs(或含病毒极少，甚至无毒) 细胞的脱分化
(2)生长起始较快快速生长时间较长PLBs产量较高
(3)①灭菌、冷却②75③PLBs重量和生物碱含量乘积的平均值最大
【解析】本题主要考查植物组织培养相关知识，并以植物组织培养实验为背景考查实验探究能力。(1)植物组织培养中外植体常选用茎尖、芽尖，原因是茎尖和芽尖分裂能力强，易诱导其脱分化，而且一般不含病毒。(2)从图中比较光照和黑暗条件下PLBs重量曲线可知，光照条件下PLBs生长优势主要体现在开始生长时间、快速生长的时间及达到生长稳定时PLBs重量的大小等方面。(3)①因ABA受热易分解，所以必须在培养基灭菌并冷却至常温后才能加入无菌ABA。②依题干信息可知，本实验有5组，每组3个样品，需分别在第0天、10天、20天、30天、40天、50天测定PLBs重量和生物碱含量，而初始数据(第0天)已知，因此还需测定的样品数是5×3×5＝75。③根据实验探究目的，当3个样品(重复样)的PLBs 重量和生物碱含量乘积的平均值最大时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间为适宜培养时间。
7．(2014年福建卷)Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图：
(1)步骤①中，在核移植前应去除卵母细胞的___________________________________。
(2)步骤②中，重组胚胎培养到________期时，可从其内细胞团分离出ES细胞。
(3)步骤③中，需要构建含有Rag2基因的表达载体。可以根据Rag2基因的________设计引物，利用PCR技术扩增Rag2基因片段。用Hin d Ⅲ和PstⅠ限制酶分别在片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有________________________酶的酶切位点。
(4)为检测Rag2基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的________，用抗Rag2蛋白的抗体进行杂交实验。
【答案】(1)细胞核(2)囊胚
(3)核苷酸序列Hin d Ⅲ和PstⅠ限制
(4)蛋白质
【解析】(1)步骤①为动物核移植，核移植是将动物一个体细胞(上皮细胞)的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，最终发育为动物个
体的过程。(2)步骤②为动物细胞培养，当培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出胚胎干细胞(ES细胞)。(3)利用PCR技术获取目的基因(Rag2基因)的前提是要有一段已知目的基因(Rag2基因)的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。由于Rag2基因的两侧是用Hin d Ⅲ限制酶和PstⅠ限制酶剪切的，为了将该片段直接连接到表达载体上，也应用Hin d Ⅲ限制酶和PstⅠ限制酶剪切载体，以确保产生的末端一致，再利用DNA连接酶连接起来，故所选择的表达载体上应具有Hin d Ⅲ限制酶和PstⅠ限制酶的酶切位点。(4)为了检测目的基因(Rag2基因)是否表达出蛋白质，可采用抗原—抗体杂交技术，因此可用抗Rag2蛋白的抗体与治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质(抗原)进行杂交实验。
8．(2014年江苏卷)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为_________________________________。
(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有______________________；培养液中蔗糖的作用是____________________、______________________________。
(3)多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经________处理，会产生染色体数目加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和________酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞(2n)经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是________________________、_____________________。
(4)为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有________(填序号)。
①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋②必须在光照条件下培养③培养过程中需通空气④固定化后植物细胞生长会变慢
【答案】(1)脱分化
(2)蔗糖浓度下降，pH降低提供能源调节渗透压
(3)秋水仙素(低温) 果胶经加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期经加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期
(4)①③④
【解析】(1)外植体经脱分化可形成愈伤组织。(2)分析坐标曲线图可知，培养液中的蔗糖浓度已降至较低，pH也由6降为4，因此使得细胞生命活动受阻，细胞干重减小。培养液
中的蔗糖可为培养的细胞提供能源，又可调节培养液的渗透压。(3)二倍体愈伤组织经秋水仙素或低温等人工诱导处理，可产生染色体数目加倍的细胞。植物细胞之间除纤维素外，还存在果胶层，因此可利用纤维素酶和果胶酶解离愈伤组织。愈伤组织细胞(2n)经人工诱导后，细胞中染色体数目加倍成4n，染色体数为4n的细胞进行有丝分裂，处于有丝分裂后期的细胞中含有8n条染色体；若加倍到4n的细胞经诱导后继续加倍形成染色体数为8n的细胞，这样的细胞再进行有丝分裂，在中期时会看到染色体数为8n的细胞。(4)通过愈伤组织获得次生代谢产物时，需选择生长旺盛的细胞，由于植物细胞进行有氧呼吸，培养过程需通入空气。愈伤组织细胞没有叶绿体，不进行光合作用，无需光照。植物细胞固定化后，与外界环境的物质交换能力降低，生长变慢。
9．(2013年新课标Ⅱ卷)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的__________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为________________________________________________________________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指__________________________________
________________________________________________________________________。
假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_______________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的________________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
【答案】(1)纤维素果胶原生质体愈伤再分化(或分化) 植物体细胞杂交技术
(2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体(其他合理答案也可) 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常
(3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一项即可)
【解析】(1)纤维素和果胶是细胞壁的主要成分，所以去除细胞壁常用纤维素酶和果胶酶。去除细胞壁后，得到原生质体。诱导原生质体融合后，融合细胞需要经过脱分化过程形成愈伤组织，然后再经过再分化过程形成完整的杂种植株。(2)植株是否可育的关键是同源染色体能否正常联会，甲与乙有性杂交后代含有两个染色体组，但是没有同源染色体，故进行减数分裂时联会异常，而甲与乙体细胞杂交后代含有4个染色体组，含有同源染色体，能进行正常联会。(3)制造人工种子一般采用经植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽或腋芽等。
10．(2013年海南卷)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV1)可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSV1 的单克隆抗体可快速检测HSV1。回答下列问题：
(1)在制备抗HSV1 的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSV1 蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗______________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了__________反应，再从小鼠的____中获取B 淋巴细胞。将该B 淋巴细胞与小鼠的________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是________________________________。
(2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的________中使其增殖，再从__________中提取、纯化获得。
(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSV1 蛋白，其原因是该抗体具有__________和____________等特性。
【答案】(1)HSV1蛋白体液免疫脾脏(其他合理答案也可) 骨髓瘤能无限增殖且可产生专一性抗体(其他合理答案也可)
(2)腹腔腹水
(3)灵敏度高特异性强(其他合理答案也可)
【解析】(1)单克隆抗体制备的第一步是免疫处理。先给小鼠注射一种纯化的HSV1蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗HSV1蛋白的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了体液免疫反应。第二步制备杂交瘤细胞。从小鼠的淋巴器官(如脾、骨髓、扁桃体、胸腺等)中获取B 淋巴细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生专一性抗体。(2)若想获得大量单克隆抗体，通常有两种方法：一是将杂交瘤细胞培养在动物细胞培养液中，然后从动物细胞培养液中分离出单克隆抗体；二是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖，然后从小鼠的腹水中提取纯化获得。(3)单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特性。