四川大学
硕士学位论文
野外放归大熊猫和圈养大熊猫肠道正常菌群的研究
姓名：谭志
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：刘成君
20040501
健康研讨：肠道菌群生物学意义与婴幼儿过敏性疾病 益生菌哪个品牌好抗过敏益生菌“台敏乐”典型代表新选择 摘要：肠道菌群是一个被遗忘的“器官”，其在宿主消化营养免疫发育等诸多方面发挥着极为重要的作用。０～３岁是婴幼儿肠道菌群建立的关键时间窗，其与肠道免疫系统的成熟同步，是形成免疫耐受的关键时期，如果这一时期肠道菌群发生紊乱，可导致免疫耐受破坏，引起婴幼儿过敏性疾病。近年来流行病学调查和实验研究提示婴幼儿早期肠道菌群紊乱与过敏性疾病的发生发展密切相关，本研究就婴幼儿常见过敏性疾病如特应性皮炎、食物过敏、哮喘、过敏性鼻炎等与肠道菌群的相关性进行综述。 2004年世界变态反应组织（WAO）针对全球过敏展开了一项调查，调查结果于2006年公布：在33个国家进行的过敏性疾病流行病学调查，结果显示这些国家的13.9亿人口中，约22％患有不同种类的过敏性疾病。过敏性疾病的发生发展有着一定的自然规律，婴幼儿最早出现的过敏问题是特应性皮炎和食物过敏，可持续数年，并逐步发展成过敏性鼻炎和哮喘。本研究就肠道菌群与婴幼儿过敏性疾病的关系，以及几种常见的儿童过敏性疾病作一综述。 一、肠道菌群的建立及生物学意义 新生儿刚出生时胎粪是无菌的，出生后大约２ｈ即可从肠道检出大肠埃希菌、肠球菌、葡萄球菌等，即微生物开始在肠道定植，最终形成以厌氧菌为优势菌的菌群结构，此过程一般需３年左右的时间。伴随着肠道菌群的定植，宿主的黏膜屏障和免疫系统也在发育成熟，主要体现在出生后肠上皮细胞增殖增强，淋巴细胞开始迁移分化。出生后到脱奶期（0-1岁）是To11样受体（To11－like receptor,TLR）介导的免疫耐受形成的关键时间窗，期间肠道菌群的异常定植会导致ＴＬＲ表达异常，免疫耐受无法正常形成。婴幼儿肠道菌群的建立受分娩方式、喂养方式、环境卫生和抗生素应用等多种因素的影响。健康成人肠道栖息着约1014个细菌，多达近1000～1150种细菌。肠道菌群承载着人类后天获得基因，参与人类正常生理和疾病病理过程，是被遗忘的特殊器官。生理状态下，肠道菌群的功能主要体现在以下方面。 １、维持和增强肠道黏膜屏障：肠道内的共生菌通过占位性保护效应、营养代谢产生有机酸和拮抗作用发挥生物屏障功能。 ２、促进固有和获得性免疫的发育成熟：肠道菌群能够通过不断刺激局部或着全身免疫应答来促进肠黏膜相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues,GALT）的发育，可激发Th1免疫应答，平衡Th1/ Th2，共生菌DHN特定的CpG基序能刺激Th1细胞分化。 ３、刺激肠道分泌sIgA: sIgA黏附于肠道黏液层，阻止病原微生物的黏附并促使其随肠道蠕动排出体外。 ４、参与免疫耐受的形成。肠道共生菌通过抑制转录因子NFKB的活性（普氏粪杆菌），或通过抑制NFKB的抑制剂IKB的磷酸化、泛素化、降解，或通过促进NFKB的亚基ReIA出核，减弱其转录因子功能（多形拟杆菌），从而达到抑制炎症反应的作用。 二．过敏性疾病的发生机制 过敏性疾病的发生是由遗传因素和环境因素两者相互作用的结果。近年来过敏性疾病的发病率显著升高，这显然已经不能简单地用遗传因素来解释。Strachan提出的“卫生假说”认为，生命早期因缺少细菌、病毒、寄生虫等微生物的接触，从而导致免疫系统发育不成熟，进而增加了患过敏性疾病的可能性。细菌和病毒感染引发的自然免疫可以诱导Th1细胞因子的释放，胎儿及初生时免疫反应以为主，随着出生后环境中抗原的刺激，免疫反应逐渐向Th1转化，达到“Th1／Th2平衡”。如今随着家庭大小、生长环境、个人卫生、生活方式的不断改善，“过度卫生”的环境使得婴幼儿受环境中抗原刺激的机会减少，造成机体免疫反应向Th2偏移，分泌的ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３等细胞因子增多，刺激Ｂ细胞产生
大熊猫的生活习性 在野外，大熊猫的雄兽和雌兽平常都是过着独居的生活，每个个体的活动范围大约为4-7平方公里左右，所以它的种群通常也是由零散的个体所组成的，每个个体均栖息于相同的环境条件下，分享着同一地区的食物来源，彼此之间互相依赖和制约，自然地组合成一个统一的整体。 大熊猫的面部缺乏表情，一般通过视觉、嗅觉和听觉来保持种群之间的通讯联系，其中嗅觉最为重要。在它的肛门两侧各有一片裸露的区域，是肛周腺的所在地，这种腺体可以分泌一种闻起来带酸味的物质，它常在高大的树干基部或者其他显著的物体如石块、土堆等，用肛周腺的分泌物涂抹，同时也用粪便和尿液等，作为互相之间识别的标记，表明各自所在的地理位置。 大熊猫的眼睛的瞳孔象家猫一样，呈纵裂状，说明它具有夜行性动物的特征。大熊猫发出的声音比较复杂，专家们采用了对其各种可分辩的叫声进行声谱分析的方法，并且参照它的行为表现，从而分析其叫声所表示的本能行为、求偶和感情状态等生物学意义。研究结果表明，大熊猫成体的叫声由12个比较清晰的叫声和喘声所组成，其声音信号的意义可以表示占有领域、寻觅配偶、抚育幼仔、受到了威胁的恐惧等等，包括嗷叫、低嗷、哼叫、吠叫、强吠、吼叫、尖叫和嘶叫等叫声，还有呼气、鼓鼻、咂嘴等声音。大熊猫初生幼仔的叫声比较单调，只有“吱吱”、“哇哇”和“咕咕”等三种，表示饥饿、身体不适或者需要排便等生理现象。到了9月龄时，还会发出呻吟、鼓鼻，以及类似牛叫和犬吠等叫声，其意义已经接近成体。随着其月龄的增长和体重的增加，它们的叫声变得越来越复杂。 大熊猫的洞巢大多位于针阔混交林中的空心大树的基部或者树兜的凹穴中，树洞是由于人类在采伐时在树的基部一侧砍过几斧或由于其他原因而腐朽穿孔，里外沟通形成的。洞内一般有20-40厘米厚的朽木粉、碎屑、朽块。树兜凹穴则是由树根包围而成。这些洞巢或巢穴以高大的冷杉树为主，所处的环境都比较僻静，附近食物资源丰富，隐蔽条件也比较好。筑成的巢，结构比较简陋而粗糙。里面的铺垫物通常呈浅盘状，由从洞外衔入的几十根干枯的或新鲜的、带有嫩叶
大熊猫的生活习性： 大熊猫体型肥硕似熊，憨态可掬，但头圆尾短。头部和身体毛色绝大多数为黑白相间，大熊猫在树上嬉戏即鼻吻端、眼圈（呈“八”字排列）、两耳、四肢及肩胛部（横过肩部相连成环带）为黑色，其余即头颈部、躯干和尾为白色。腹部淡棕色或灰黑色。其体长120~180cm；尾长10~20cm，白色；肩高一般为65～70cm；体重60~125kg。前掌除了5个带爪的趾外，还有一个第六趾。背部毛粗而致密，腹部毛细而长。陕西秦岭佛坪自然保护区共有四次发现白色大熊猫。据陕西人民出版社《当代陕西大事（1948-1990）》725页载，最早在秦岭南坡佛坪自然保护区发现白色大熊猫的时间是1990年11月15日。那只大熊猫体高0.7米，除眼圈、四肢下部外，从耳朵、肩胛到整个胸脯，均为白色，堪称“宝中之宝”。此后在1991年、，此后于1990年、1991年和2009，在佛坪自然保护区内的竹林中又有3次分别观察到棕色大熊猫的2只成体和1只幼仔。这种熊猫两耳、眼圈、睫毛、吻头、肩胛及四肢的毛均为棕色。北京大学大熊猫专家称其为“世界上最美的大熊猫”。无论棕色或白色大熊描，确为世界罕见。它们的发现，打破了熊猫研究史上“单形性”（即毛色黑白相间）的说法，具有重大科学意义。这样，目前已知的大熊猫的毛色共有三种：黑白色、棕白色、白色。生活在陕西秦岭的大熊猫因头部更圆而更像猫，被誉为国宝中的“美人”。大熊猫喜欢独自生活，都是单独行动。不冬眠 大熊猫栖息于长江上游各山系的高山深谷，为东南季风的迎风面，气候温凉潮湿，其湿度常在80°以上，故它们是一种喜湿性动物。它们活动的区域多在坳沟、山腹洼地、河谷阶地等，一般在20°以下的缓坡地形。这些地方土质肥厚，森林茂盛，箭竹生长良好，构成为一个气温相对较为稳定、隐蔽条件良好、食物资源和水源都很丰富的优良食物基地。居住于海拔2400~3500米的高山竹林中。生活环境湿度很大，温差也比较大。食物主要是高山、亚高山上的50种竹类，偶食其它植物，甚至动物尸体。日食量很大，每天还到泉水或溪流饮水。熊猫趣闻：近几年，科学家的野外隐藏摄像机发现，雄性野生熊猫在树上留下气息记号时，会抬起一条后腿，像公狗一样，然后把尿往树的高处撒去。尿撒得越高，雄性大熊猫的社会地位也就越高。 大熊猫的食谱非常特殊，几乎包括了在高山地区可以找到的各种竹子，大熊猫也偶尔食肉（通常是动物的尸体，有时也吃竹鼠）。大熊猫独特的食物特性使它被当地人称作“竹熊”。竹子缺乏营养，只能提供生存所需的基本营养，大熊猫逐步进化出了适应这一食谱的特性。在野外，除了睡眠或短距离活动，大熊猫每天取食的时间长达14个小时。一只大熊猫每天进食12~38公斤食物，接近其体重的40%。大熊猫喜欢吃竹子最有营养、含纤维素最少的部分，即嫩茎，嫩芽，和竹笋。大熊猫栖息地通常有至少两种竹子。当一种竹子开花死亡时（竹子每30~120年会周期性地开花死亡），大熊猫可以转而取食其他的竹子。但是，栖息地破碎化的持续状态增加了栖息地内只有一种竹子的可能，当这种竹子死亡时，这一地区的大熊猫便面临饥饿的威胁。 如何消化竹子科研人员发现，大熊猫的消化道粗短而又简单，没有一般食草动物细长的肠道和复杂的胃或发达的盲肠。此外，在大熊猫的基因序列于2009年公布之后，他们还发现大熊猫消化道内缺乏一些帮助食草动物消化纤维素和半纤维素（它们是纤维性植物饮食的主要成分）的酶。这让科研人员感到非常困惑，缺乏这些必要条件的大熊猫是如何消化竹子的呢？科研人员利用基因测序技术，分析5000多个核糖体RNA序列，最终在大熊猫体内发现了多种消化道微生物，而且和一些食草动物体内的微生物非常类似。这些都有助于动物消化体内的纤维素，而且其中有了7种是熊猫消化道内独有的。 人类迫使大熊猫吃竹子 大熊猫为什么喜欢吃竹子呢？科学家推测，随着古时候人口数量的急剧膨胀，大熊猫被迫迁徙到一些高山地区生存。它们为了避免和一些肉食动物比如亚洲黑熊等进行竞争，最终逐渐习惯以竹子为食。不过，尼可·麦克科也补充到，如果给大熊猫提供肉类食品，它们也会吃的，不过不会主动去索取。
肠道菌群研究的主要方法 长期以来，为了研究肠道菌群的成员及其功能，科学家们建立和发展了众多技术 手段。经典的微生物学研究方法主要通过对细菌进行纯培养，然后在不同的培养条件下对细菌的生理活性进行研究。而随着分子生物学技术的飞速发展，在对环境中的复 杂微生物群落进行研究时，科学家们越来越多地运用不依赖于培养的方法，全面分析 各种微生物在环境中的活动和对环境的影响。 基于分离培养的方法 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对 粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格 的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长非常重要。但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。 二．分子生态学研究方法 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或RNA）为研究 对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基 RNA 基因（细菌中的16S r RNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基 因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌16S r RNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息 量巨大且更新迅速的公开数据库，如Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的16S r RNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位。类似的，为了对肠道菌群中具有特定功能的类群进行检测，研究者们也建立了以功能基因片段为分子标签的分析方法。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法， 对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的16S r RNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法，已被多次应用于人体肠道菌群的多样性分析，并获得了在物种检测深度和物种鉴定水平上均远远优于DNA 指纹图谱技术的结果 肠道菌群与健康相关研究中的应用
三年级上语文补充素材-11可爱的大熊猫西师大版（2019） 大熊猫（学名：Ailuropoda melanoleuca 英文名称：Giant panda），属于食肉目、熊科、大熊猫属的一种哺乳动物，体色为黑白两色，它有着圆圆的脸颊，大大的黑眼圈，胖嘟嘟的身体，标志性的内八字的行走方式，也有解剖刀般锋利的爪子。是世界上最可爱的动物之一。大熊猫已在地球上生存了至少800万年，被誉为“活化石”和“中国国宝”，世界自然基金会的形象大使，是世界生物多样性保护的旗舰物种。 据第三次全国大熊猫野外种群调查，全世界野生大熊猫不足1600只，属于中国国家一级保护动物。截止2019年10月，全国圈养大熊猫数量为333只。大熊猫最初是吃肉的，经过进化，99%的食物都是竹子了，但牙齿和消化道还保持原样，仍然划分为食肉目。野外大熊猫的寿命为18～20岁，圈养状态下可以超过30岁。是中国特有种，现存的主要栖息地是中国四川、陕西和甘肃的山区。 大熊猫体型肥硕似熊、丰腴富态，头圆尾短，头躯长1200-1800毫米，尾长100-120毫米。体重80-120千克，最重可达180千克，饲养的熊猫略重，一般雄性个体稍大于雌性。头部和身体毛色黑白相间分明，但黑非纯黑，白也不是纯白，而是黑中透褐，白中带黄。秦岭地区的个体偏大，体毛粗糙，腹毛略呈棕色色泽。岷山（尤以青川平武）则个体较小，体毛也较前者为细，腹毛棕色不明显，但凉山的个体并不偏小。黑白相间的外表，有利于隐蔽在密林的树上和积雪的地面而不易被天敌发现。相对锋利的爪和发达有力的前后肢，有利于大熊猫能快速爬上高大的乔木。大熊猫皮肤厚，最厚处可达10毫米。身体不同部分的皮肤厚度也不一样，体背部厚于腹侧，体外侧厚于体内侧，皮肤的平均厚度约为5毫米，并且色白而富有弹性和韧性。
人体肠道菌群定量技术研究进展 姜美娟，梁冰 (中国人民解放军第401医院检验科，青岛266071) 摘要在传统微生物学研究中，人们只重视致病菌的作用，而没有重视正常菌群的作用。通过对肠道菌群的分布特点和生理功能的了解，我们认识到肠道菌群的微生态平衡与人的健康及疾病的密切关系系，针对传统培养方法存在的问题，国内外专家先后开展了分子生物学方法的研究和生物学评价工作。本文结合本课题组的研究，对各种技术的特点及存在的不足进行了全面的论述。 关键词肠道菌群;定量技术;进展 中图分类号:R445.6文献标识码:B doi:10.3969/j.issn.2095－1434.2011.03.013 正常菌群在人体内分布很广，其中以肠道菌群最具有代表性。对健康人的粪便标本研究已知，肠道内栖息着大约400 500种微生物，其中包括细菌、真菌和病毒等。这些微生物的总质量约为1kg，其体积相当于1个人的肝脏，其数量为1014个，是人体自身细胞总数的10 20倍［1］。在常见的十几种细菌中，绝大多数为专性厌氧菌，约占99%以上，包括双歧杆菌、乳杆菌、优杆菌、拟杆菌、消化链球菌等，也有少量的兼性厌氧菌、专性需氧菌和微需氧菌，如肠杆菌属细菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母样菌等。它们构成了人体胃肠道的生物学屏障。肠道正常菌群与宿主、菌群中各种微生物之间相互依存，相互协调，处于动态平衡。大量研究表明，肠道正常菌群对宿主具有消化、吸收、营养、生物拮抗等生理作用，实际上已成为宿主生命的必需的组成部分。当这些正常的微生物群落受宿主及外环境影响，其种群数和菌量、活性发生了异常或定位转移时，这些群落中就容易容纳外籍菌，原先的平衡遭到破坏，出现菌群失调。在人体抵抗力降低的情况下，如瘦弱婴幼儿，年老体弱和患急、慢性疾病者，以及长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和放射治疗者，尤其是应用广谱抗生素者，可使肠道正常菌群被抑制而数量减少，耐药的过路菌过量繁殖，造成肠道菌群失调，同时，肠道菌群的失调还会加重某些疾病的严重程度。因此确切了解肠道菌群变化及对肠道菌群进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义。 1直接镜检法 镜检法是目前广泛采用的进行肠道菌群分析的方法。该方法是通过油镜观察革兰染色粪便涂片的菌群象，估计细菌总数、球菌与杆菌比例，革兰阳性菌与革兰阴性菌的比例，结合各种细菌的形态特点、有无特殊形态细菌增多等结果来综合判断菌群状况。 观察细菌总数可以先计数部分(如1/8视野)油镜视野中细菌的数量，再对整个视野进行估计，观察几个视野后取平均值。一般来说，每视野细菌数在501 5000个为正常，101 500个为轻微少，11 100个为明显减少，11个以下为显著减少，也有高于5000的情况，但较少见，临床意义不大。细菌总数减少则与肠道菌群失调存在密切关系，应引起重视，并结合细菌类别构成等指标进行综合评估。由于通过涂片镜检的方法无法精确区分细菌种类，一般就细菌形态和染色性将细菌分为4大类，即革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌，通过计算4者的比例来评估肠道菌群的特征。具体计数方法为:计数1000个细菌中各类细菌的百分率。可先计数部分视野中(如1/8视野)各类细菌数，然后估计全视野中的各类细菌数［2］。该方法虽然由于所需设备简单，操作简便，耗时短，很适宜临床应用。但是并不能完全反映肠道菌群的状态，更不能对细菌种类及数量进行精确定量，而且操作过程受主观因素影响较大，不易于推广。 2活菌定量培养计数法 Hartemink等人［3］于1997年提出了活菌定量培养及计数的方法，即将一定质量的粪便标本，悬浮于PBS中，经连续10倍稀释，分别接种于不同的选择培养基中，进行培养。对不同培养基选取最佳分布菌落进行计数，并根据其相应稀释倍数而得到细菌在标本中的含量。此法可以同时显示肠道菌群的多样性和比例构成。但是，目前选择性培养基并不能真正做到完全特异性选择，仍有85%的肠道菌群无法培养得到。而且稀释平皿接种费时，通常孵育需2 3d，如果微生物分布不均，呈链状或成丛，则导致低估真正菌数。平皿接种中的氧化作用会杀死像双歧杆菌这样的厌氧菌，影响菌数的估计。 3聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR) 16S rRNA是编码细菌核糖体16S小亚基的核酸序列，而16Sr DNA是编码它的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA基因可分为保守区和可变区，在不同的微生物可变区其核苷酸序列不同，一个16SrRNA的基因序列就代表着一种原核生物［4］。16SrRNA/rDNA分子是研究微生物的最佳靶分子，利用保守区系列设计通用引物来判断细菌的存在与否，也可以利用16Sr DNA可变区特异性序列来进行特异性微生物种属鉴定和分型，这在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。基本过程是:先用PCR法扩增模板DNA，然后对扩增片段进行测序，获 182 第22卷第3期航空航天医学杂志2011年3月
第17章中国保护大熊猫及其栖息地工程 中国是一个发展中国家自然资源相对贫乏大部分自然景观已被改变或被破坏经济发展与自然保护之间的矛盾尤为突出 分布区面积缩小Fan 等 1991徐学良 1993 3é?a?àí?×?è??°1?oí?a±￡?¤í?ò????????¨á￠μ?±￡?¤???????ó??éú?????ò????μ?è?ààéú 2ú???ˉ??????êüμ?±￡?¤μ??????ú??·?2? ???ú±?·????ú?￥2??àá?μ?±￡?¤???úò?′??ˉ±?oí?ü??ê1??èoμ?ò? ′??àì?D??μμíMeffe等1994 Rails等1986á?òμ2? Ailuropoda melanoleuca ò2ê?êà??×?è?àúê·ò?2úμ???òa×é3é2?·?′óDü?¨??1?·o·?2?óú????μ?Dí?àμ??????á??μé?ì??μè1983 ′óDü?¨μ?·?2?·??§?ú?D1ú??oóò????1ê?á?3éò???μ?何业恒 1989 óè??ê??ü??ê??ê?ú·￠éúμ??aàà?a·￠ ê1?????úμ?·?2????????T?ú?D1úμ??à2????-???? ??′¨ê?μ?ú?ááé?D??àá?oú??′￡ 1985 Schaller 1993?ü?￠μ????y???a25 000平方公里 早在1963年就建立了4处以大熊猫及其栖息地为保护对象的自然保护区为了进一步采取有效的保护措施在70年代和80年代组织了两次大规模的专项调查MOF ′óDü?¨·?2????ú??ààá?′?′ó???y?a?¨?Y?à?a′??÷???t????3éá￠ á?áìμ?D?×é??μ?′óDü?¨á?òμ2??áí??D1ú???§?ooí′óר?o D￡μ?ò°éú?ˉ???§?òó?êà??ò°éúéú???ù?e?á??′óDü?¨??DDá??a?ú10年的研究 范志勇
Nature Genetics上的肠道菌群GWAS研究是怎么做的 木子君 肠道菌群与人类健康的密切关系越来越受到重视，已经成为时下最热门的研究方向之一。被称为人类“第二基因组”的肠道菌群除了受到环境、饮食、疾病等因素的影响以外，还在一定程度上受到遗传因素影响，也就是说肠道微生物会受到宿主基因的控制。例如已报道的乳糖编码基因（lactase gene，LCT）与双歧杆菌的关联性(Goodrich, Davenport et al. 2016)。尽管这种概念已被广泛接受，但是基于GWAS的肠道菌群研究还很有限，到底有多少微生物受到宿主基因的影响，以及这种关联如何影响健康和疾病的发生，都非常值得研究。 那么一篇肠道菌群的GWAS研究如何做，怎样才能发到高水平的期刊呢？今天就以2016年发表在Nature Genetics上的一篇文章为例，讲讲肠道菌群的GWAS研究思路。 Genome-wide association analysis identifies variation in vitamin D receptor and other host factors influencing the gut microbiota 本文主要利用1812人样本集进行GWAS研究，发现了一系列影响肠道菌群induvidual bacteria 和β-diversity的SNP。之后针对VDR基因上的SNP为例，研究了该基因影响肠道微生物的机制。 大致可以把这篇文章的思路分为三步： 下面我们看看作者如何一步步有理有据地走下来。 第一步：全基因组关联分析 本文的数据来自两个人群（PopGen和FoCus），共1812个样本有肠道微生物的16S测序以及SNP芯片数据。同时还有性别，年龄，吸烟状况，饮食情况等一些对于肠道微生物有影响的环境因素数据。 1. 前期处理 1.1 协变量 在做关联分析之前，要先确定协变量，校正其他因素对于肠道微生物的影响。经过相关性分析发现年龄，性别，吸烟，饮食等情况对于肠道微生物的影响都是显著的（图1），因此都被纳入关联分析作为协变量。
大熊猫的生存现状 说到国宝，大家一定会即时联想起身形肥胖、样子傻楞楞的大熊猫。自从多年前熊猫「安安」及「佳佳」移居本港后，迅即成为港人的宠儿。今年适逢香港回归祖国10周年，中央政府为庆祝这意义重大的时刻，特别成立了一个为香港选赠大熊猫的专家小组，为「安安」及「佳佳」挑选两名活泼可爱的新伙伴。小组近日就制订了送港熊猫的5大条件，除了要天真可爱，还包括身体健康、心理行为态度正常、漂亮温驯、基因优良等，而最重要的就是要「青春无敌」，指定必须于2005年出生，只有2岁的小熊猫才符合赠港资格。小组表示，希望新来港的熊猫能适应本港的环境并开枝散叶。从中央对送港熊猫珍而重之的态度，除了因其崇高的国宝地位外，全球熊猫数目日渐稀少也是大家所关注的问题。族群减少影响遗传基因多元性样子可爱的熊猫虽然得到全中国人的爱，但却似乎得不到自然界的眷顾，未能保证其子孙能延绵不绝地存活于世。据世界自然基金会资料显示，原本广泛分布于亚洲东部的熊猫群，近年已缩小至只分布于我国川、甘、陕等地。随着熊猫分布地不断缩小，族群亦相应减少，势必影响熊猫遗传基因的多元性，减低熊猫的抵抗力、繁殖力及生存能力。据统计，当前全球只剩下约一千只熊猫，俨然已踏入濒临绝种的警戒线。究竟是什么原因让熊猫的数目大幅减少呢？其中一个原因是郊区城镇化。大家可能都知道，熊猫最喜欢吃竹子，特别是竹子中最幼嫩多汁的部分。然而随着社会发展一日千里，为配合城市发展，人们砍伐了大量的树木，当中自然包括了竹子，加上工业发展所造成的空气及水源污染，令原本适合熊猫生长的「世外桃源」不断萎缩，同时亦令熊猫赖以维生的食粮也逐渐消失，因此而饿死、病死的熊猫可谓不计其数。「一索得子」是奢求另一个主因则出自熊猫本身的问题，对大熊猫来说，「一索得子」似乎是一种奢求。熊猫的发情期其实并不短，雌性熊猫4至5岁就已经进入成熟期，拥有长达10年或以上的生育年期，虽然如此，但熊猫的交配表现却似乎并不理想，事实上，雌性熊猫在排卵期间，能真正受孕的日子只有一至三天，使成功受孕的机会大减。再加上近年因族群减少而出现的近亲繁殖问题，下一代的存活率及交配机会就因遗传因子缺憾而大幅降低。不少世界环保组织近年已积极进行熊猫拯救工作，而我国可算是最早拯救濒危大熊猫的国家之一。内地拯救大熊猫其中一法为保护现存的熊猫，包括禁止破坏自然林木地区及捕杀熊猫等可耻行为，并且由专人照顾、协助及研究熊猫繁殖。而早于40多年前，中国已成功为人工饲养的大熊猫繁殖，其后发展至以人工授精方式，协助熊猫繁衍下一代，并积极研究新技术保育熊猫品种，稳定熊猫数目下降的走势。内地禁止破坏林木及捕杀行为据专家表示，要让熊猫成功繁殖，必须要为其制造适合的环境，包括让雌雄熊猫多见面，在两者四周放置一些冷杉树、铁杉树及红桦树等植物，并且让环境温度维持于摄氏13至22度间，从而营造出适合交配的理想生境，而内地研究中心更不断进行熊猫繁育研究并引入新技术，使受孕率、熊猫宝宝出生率及存活率得以提升。改良了的人工授精技术更提高了熊猫诞下双胞胎的机会。保育人员更会协助照顾约200克重或以下的熊猫幼儿，确保细小及脆弱的熊猫宝宝不会夭折。建造半野生环境训练生存能力据卧龙大熊猫俱乐部网站，中国保护大熊猫研究中心正实行圈养熊猫，目的是希望熊猫最终可回归野外生活。2000年，该中心已为大熊猫建造了一个半野生的环境，并有计划扩大熊猫的圈养地，以及进行野外释放的研究，如培养熊猫的野性、训练其野外生存能力、寄生虫及预防疾病等，期望最快可于3年后让5只熊猫回归野外。但放熊猫归山的目标仍然不易实现，需要内地有关机构多番研究才能成事。早于古代，熊猫已被视为珍贵的异兽，西汉文帝之母的陵墓中就用熊猫的头骨作为陪葬。时至今日，其珍贵性也与其数目直接挂钩。科学家们虽然积极提升熊猫的出生率，希望让熊猫品种延续下去，然而今天我们还能否向熊猫们保证它们未来有适合居住的环境？如果连茂盛的竹林也于世上消失，熊猫也许只能于展馆中望着翠绿的图画发呆。
作者简介：窦会娟（1977-），女，硕士，副教授，从事微生物生态学方面研究，Email：douhj106@163．com 通讯作者：窦会娟·综述· 肠道菌群研究方法进展 窦会娟，郭文涛，王婷婷，李林珂 漯河医学高等专科学校，河南漯河462000 摘要：肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用，如何对肠道菌群的丰度与数量变化进行全面分析是开展肠道微生态研究的瓶颈问题。通过查阅大量资料，总结了当前肠道菌群研究常用的方法及每种方法的优缺点，为进一步深入进行肠道微生态方面的研究提供参考。 关键词：肠道菌群；分离培养技术；基因检测技术；质谱技术 中图分类号：Ｒ378文献标志码：A文章编号：1005-376X（2014）01-0119-03 DOI编码：10．13381/j．cnki．cjm．201401032 Progress on the research technology of intestinal flora DOU Hui-juan，GUO Wen-tao，WANG Ting-ting，LI Lin-ke Luohe Medical College，Luohe462000，China Corresponding author：DOU Hui-juan，Email：douhj106@163．com Abstract：Intestinal microorganisms play an important role in the maintenance of human health and prevention of disease．It is very important to analyze the intestinal flora well for further researches．Based on a number of refer-ence literatures，we summarized most of the methods used in studying the intestinal flora，as well as the advantages and disadvantages of each method，in order to provide useful reference for further studies on gut microflora． Key words：Intestinal flora；Isolation and culture；Genetic testing；Mass spectrometry 人体肠道中的微生物有1000多种，总重量大约为1．0 1．5kg，总数在1014个以上，相当于人体所有组织细胞总数的10倍。肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用［1］，肠道微生物群落及其对人类健康的影响近年来已成为广受关注的热点。肠道菌群分析是进行复杂微生态系分析的基础，如何对肠道菌群丰度与数量变化进行全面分析是开展微生态研究的瓶颈问题。现将肠道菌群研究方法的进展做一综述，方便肠道微生态研究者进行参考。 1基于分离、培养的方法 该方法一般是采用各种选择性培养基培养细菌，将各种细菌分离并根据染色、生化反应及血清学实验等方法对细菌进行鉴定，同时可进行倍比稀释和菌落计数来测定活菌数量。此方法比较成熟，依然被许多进行肠道菌群的研究者采用。例如陈琛等［2］研究了中草药对小鼠肠道的影响，在研究中采用分离培养、生理生化鉴定的的方法鉴定出了小鼠肠道菌群中的乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌。李建婷等［3］采用选择性培养基分离培养细菌，研究了王氏保赤丸对小鼠肠道菌群的影响。O'Keefe等［4］发现7α-去羟化菌在结直肠癌高风险人群肠道菌群中的比例显著高于低风险人群，而植物乳酸杆菌（Lactobacilli plantarum）在高风险人群肠道菌群中的比例则显著低于低风险人群。 对环境中获得的细菌菌株进行培养有助于全面、完整地研究细菌的功能和不同生长条件下的生理活性。例如，Falony等［5］以果寡糖为唯一碳源，将长双歧杆菌株（Bifidobacterium longum）BB536分别与来源于人体肠道的丁酸盐产生菌株Anaerostipes caccae DSM14662和Ｒoseburia intestinalis DSM14610进行共培养，发现了这些细菌之间两种不同的交叉互养（Cross-feeding）模式，作者提示，这些行为的揭示有助于理解肠道微生态系统中各种细菌对营养成分的利用情况和各种细菌之间的互作。但自然界中有90% 99%的微生物用传统方法无法培养出来，因此该方法只能对部分的菌群进行分析，而且耗时。
肠道菌群领域研究进展（完整版） 已有大量研究证实，肠道菌群与肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压、心脑血管疾病、慢性肾病、神经系统疾病等相关，肠道菌群科学家们2019年在肠道微生物组研究领域取得了研究成果； 【1】Nat Biotechnol：突破！科学家在人类肠道微生物组中鉴别出100多种新型肠道菌群！ 近日，一项刊登在国际杂志Nature Biotechnology上的研究报告中，来自英国桑格研究院等机构的科学家们通过对肠道微生物组研究，从健康人群的肠道中分离出了100多个全新的细菌类型，这是迄今为止研究人员对人类肠道菌群进行的最全面的收集研究，相关研究结果获奖帮助研究人员调查肠道微生物组在人类机体健康及疾病发生过程中所扮演的关键角色。 本文研究结果能帮助研究人员快速准确地检测人类肠道中存在的细菌类型，同时还能帮助开发出治疗多种人类疾病的新型疗法，比如胃肠道疾病、感染和免疫疾病等。人类机体中细菌大约占到了2%的体重，肠道微生物组就是一个主要的细菌聚集位点，同时其对人类健康非常重要。肠道微生物组的失衡会诱发诸如炎性肠病等多种疾病的发生，然而由于很多肠道菌群难以在实验室环境下生存，因此研究人员就无法对其进行更加直观地研究。
【2】Science：肠道微生物组可能是药物出现毒副作用的罪魁祸首 药物本是用于治疗很多患者，但是一些患者遭受这些药物的毒副作用。在一项新的研究中，来自美国耶鲁大学的研究人员给出了一种令人吃惊的解释---肠道微生物组（gut microbiome）。他们描述了肠道中的细菌如何能够将三种药物转化为有害的化合物，相关研究结果发表在Science期刊上。 研究者表示，如果我们能够了解肠道微生物组对药物代谢的贡献，那么我们能够决定给患者提供哪些药物，或者甚至改变肠道微生物组，这样患者具有更好的反应。在这项新的研究中，研究人员研究了一种抗病毒药物，它的分解产物可引起严重的毒副反应，并确定了肠道细菌如何将这种药物转化为有害的化合物。他们随后将这种药物给予携带着经基因改造后缺乏这种药物转化能力的细菌的小鼠，并测量了这种毒性化合物的水平。利用这些数据，他们开发出一种数学模型，并成功地预测了肠道细菌在对第二种抗病毒药物和氯哌嗪（一种抵抗癫痫和焦虑的药物）进行代谢中的作用。 【3】Nat Med：肠道微生物组的改变或与结直肠癌发生密切相关肠道中“居住”着很多不同的微生物群落，即肠道微生物组，其与人类健康和疾病息息相关，近来有研究表明，评估粪便样本中的遗传改变或能准确反映肠道微生物组的状况，或有望帮助诊断人类多种疾病。近日，一项刊登在国际杂志Nature Medicine上的研究报告中，来自
转自《生物学通报》2004年第39卷第3期，26页。 肠道菌群与疾病 尹军霞 (绍兴文理学院生物学系浙江绍兴312000) 林德荣 (绍兴第二医院肿瘤科浙江绍兴312000) 摘要：一般情况下，肠道茵群与人体和外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用，但在某些情况下，这种平衡可被打破，形成肠道茵群失调，引发疾病或者加重病情，引起并发症甚至发生多器官功能障碍综合症或多器官功能衰竭。本文对肠道菌群在种类、数量、比例、定位和疾病的关系以及调整肠道菌群失调的措施作了简单的介绍。 1 肠道菌群一般介绍 刚出生的婴儿由于在子宫内是处于无菌的环境．所以肠道内是无菌的，出生后，细菌迅速从口及肛门侵人，2 h左右，其肠道内很快有肠球菌、链球菌和葡萄球菌等需氧菌植入，以后随着饮食，肠道就有了更多的不同菌群进驻，3 d后细菌数量接近高峰…。而一个健康成人胃肠道细菌大约有1014个，由30属、500种组成，包括需氧、兼性厌氧菌和厌氧菌。从来源上看，有常住菌和过路菌两种，前者是并非由口摄入，在肠道内保持稳定的群体；而后者则由口摄入并经胃肠道。常住菌是使过路菌不能定植的一个因素。 人体胃肠道各部位定植的细菌的数量和种类不同：胃内酸度高，含大量消化酶，不适合细菌成长，所以胃内菌数量很少，总菌数0～103个，主要是一些需氧抗酸性细菌，如链球菌、乳杆菌等。而小肠是个过渡区，虽然pH值稍偏碱，但含有消化酶，蠕动强烈，肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠。所以，小肠菌量在胃和结肠之间逐渐增多；空肠菌数105个，仍以需氧菌为主；回肠菌较多，总菌数103-107个，以厌氧菌为主，如拟杆菌、双歧杆菌等；结肠内菌量最多达1011-1012个，厌氧菌占绝对优势，占98％以上，菌种也达300多种，干大便的重量近1／3是由细菌组成。 同一肠道，不同类菌的空间分布也不相同。总的来说，人体肠道菌群在肠腔内形成3个生物层：深层的紧贴粘膜表面并与粘膜上皮细胞粘连形成细菌生物膜的菌群称为膜菌群，主要由双歧杆菌和乳酸杆菌组成，这两类菌是肠共生菌，是肠道菌中最具生理意义的两种细菌，对机体有益无害；中层为粪杆菌、消化链球菌、韦荣球菌和优杆菌等厌氧菌；表层的细菌可游动称为腔菌群，主要是大肠杆菌、肠球菌等好氧和兼性好氧菌…。 肠道菌群的种类和数量只是相对稳定的，它们受饮食、生活习惯、地理环境、年龄及卫生条件的影响而变动。 正常情况下，肠道菌群、宿主和外部环境建立起一个动态的生态平衡，对人体的健康起着重要作用。 1．1 防御病原体的侵犯 1)直接作用
大熊猫 王其虎 （中南林业科技大学，湖南长沙 410004） 摘要：大熊猫Ailuropoda melanoleuca是世界上最珍贵的动物之一，数量十分稀少，属于国家一级保护动物，体色为黑白相间，被誉为“中国国宝”。本文从大熊猫的形态特征、生活习性、栖息分布、人工养殖、疾病防治及等文化价值方面切入浅谈国宝大熊猫。 关键词：大熊猫国宝野生动物 大熊猫Ailuropoda melanoleuca是中国特有珍贵子遗物种，已有数百万年的进化史，是从远古走来的“活化石”，具有极高的观赏、科研和文化价值。它深受世界各国人民喜爱，在中国经济、社会和对外文化交往中扮演着独特而重要的角色，成为野生动物保护和自然保护的旗舰物种。 1 形态特征 大熊猫体形肥胖，野生的一般重60～76千克，最重可达110千克。圈养条件下，由于营养的关系，一般体重可达80～125千克。 大熊猫的唇形似兔唇，这有利于剥竹青。吻鼻甚短，鼻垫似猫，黑色，鼻腔很大，这是对高山空气稀薄的适应。整个面颊显得很圆，具有丰满的咀嚼肌肉，故它们咬断竹子不费吹灰之力。眼睛很小，瞳孔似猫，为纵列状。它们生活在深山密林中，夜幕降临后，在微弱的光线下也能照样正常活动。耳朵圆，听觉较灵敏。 大熊猫的头大而沉重，故颈部较粗短，肌肉也很发达。身体虽较肥胖，但全身关节却十分灵活，可以用嘴舔咬胯部和尾巴，高兴时翻筋斗十分灵巧。 大熊猫初生时尾几乎与后肢等长，随着个体发育而逐渐缩短，尾毛很蓬松，似帚。 大熊猫四肢粗壮，以支撑笨重的身体。四肢向内撇，行走蹒跚，这样便于它们在竹丛中漫游、采食竹子。前掌和手能采食、握竹进食。前后掌都被有黑色粗毛，可在冰雪上行走而不打滑。趾端有坚硬的爪，利于攀爬。 大熊猫体色基调为黑白色，这在茂密的森林里或雪地中，既能起到保护作用，也能对它们个体之间起到相识作用。 2 生活习性 大熊猫性情温驯，在野外一般不攻击人，偶尔相遇，多迅速穿入竹林中。繁殖育幼期间会主动攻击人以保护其幼体，见到人会追赶到约30米后停止，在返
大熊猫的生活环境和方式特征 我国是一个动物资源极其丰富的国家，仅兽类就有400多种。在种类繁多的动物中，有些还是举世公认的珍稀动物，要问在这些举世公认的珍稀动物中哪种动物“知名度”最高，大家一定会异口同声地说：大熊猫。 大熊猫是一种非常古老的动物，至少在300万年前已经形成现在的模样了。它曾经在地球上分布很广，和凶猛的剑齿象是同时代的动物。后来，地球的气候越来越冷，进入了“第四纪冰川”时期，许多动植物都被冻死和饿死了，剑齿象就是这个时期灭绝的，可是唯有大熊猫却躲进了食物较多、避风而又与外界隔绝的高山深谷里去，顽强地活了下来。几大熊猫盈盈百万年来许多动物都在不断地进化，与原样相比早已面目全非了，可是熊猫却几乎没有变化，成为动物界的“遗老”和珍贵的“活化石”了。 大熊猫是国家一级重点保护动物。说起大熊猫，首先要为它正名。有关资料表明，动物学界的人士于1869年才发现大熊猫，大约过了70年左右，人们才第一次捕捉到熊猫。1869年，法国的一位传教士戴维来到中国。这年3月在四省宝兴县的一户农民家里看到一张兽皮，这张皮上只有黑白两色的毛。10余天后这位农民又捕回一只动物，这只动物的皮与那张皮完全一样，除了四脚、耳朵、眼圈周围是黑色外，其他部位的毛都是白色。戴维就确认它是熊属中的一个新种。此后不久，他在公开自己的新发现时将这种动物定名为黑白熊。
大约在本世纪30年代后期，这种熊的标本在重庆展出，它的中文名字定为“猫熊”。展出时标本的名牌是由左往右写的，写作“猫熊”。但是当时汉字是由上往下直书，写满一行再往左写，参观者拘于习惯，将字从右往左读，于是“猫熊”就被读成了“熊猫”。此后又有一种香烟命名为“熊猫牌”香烟，对“熊猫”的称呼起了推波助澜的作用。由于约定俗成的缘故，我国的动物学家也就把它定名为“熊猫”了。又由于它形体肥大，在“熊猫”二字前面又加了个“大”字。“大熊猫”就成了“官名”。如今已经没有人再坚持叫它“大猫熊”了。 作为珍稀动物，大熊猫“稀”在哪里呢？ 大熊猫独产于我国，在世界上除了我国有野生大熊猫外，只有极少数几个国家的大型动物园里饲养着一两只大熊猫，而这些被珍养在动物园中的大熊猫还都是我国作为“国礼”赠送去的。 从栖息地看，大熊猫主要分布于川西北的深山密林里。此外，只有陕西、甘肃的个别县境内有零星的大熊猫了。据专家们估算，所有这些地方栖息的大熊猫，总数也只在1000只左右。 “物以稀为贵”，大熊猫的数量为什么这么稀少呢？这与它的生活习性和生理特征相关。大熊猫性情孤独、不喜群居，喜欢独处，独来独往是它的生活习性之一。即便是雌性大熊猫在产仔后，对幼仔大约也只带领上一年左右的时间，母子也就不再结伴而居了。只有在繁殖期到来时，它们才会去寻找异性伙伴。然而，大熊猫发情期极短，一只成年大熊猫每年也就几天的时间。雄性、雌性大熊猫发情期不尽