网络出版时间：2013-02-26 17:21
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29(1)104-109 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2013年2月
红树内生细菌AiL3抗菌蛋白的纯化及其
防治芒果炭疽病机理研究
余莎1，何红1*，詹儒林2*，马凌燕1，李琳1
（1．广东海洋大学农学院，湛江 524088；2．中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室，
湛江 524091）
摘要：本文对红树内生细菌AiL3菌株的抑菌蛋白及其防治芒果炭疽病的效果与防病机理进行了研究。结果表明，AiL3菌株产生的抑菌物质主要为分子量28 kD的抑菌蛋白；60 μg·mL?1抑菌蛋白处理芒果9 d后对炭疽病的防治效果达45.1%，与施保克的防治效果（43.6%）相当；抑菌蛋白抑制病原菌菌丝生长，导致菌丝现肿胀、膨大、畸形、细胞膜透性增加、细胞内含物外渗；抑菌蛋白处理后诱导芒果体内过氧化物酶（POD）活性下降，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性上升。
关 键 词：内生细菌；抑菌蛋白；分离纯化；防治效果；防病机制
中图分类号：S482.2文献标识码：A文章编号：1005-9261(2013)01-0104-06
Purification and Bio-control Mechanism against Mango Anthracnoses of Antifungal Protein of Mangrove Endophytic Bacteria AiL3
YU Sha1，HE Hong1*，ZHAN Rulin2*，MA Lingyan1，LI Lin1
(1. College of Agriculture, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088; 2. South Asia Tropical Crop Research Institute,
CATAS/Key Laboratory of Hainan Province for Post-harvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products,
Zhanjiang 524091, China)
Abstract: An antifungal protein was separated and purified from endophytic bacterium AiL3 in mangrove Acanthus ilicifolius. The efficacy on mango anthracnose and bio-control mechanism was investigated. Results showed that the antifungal protein had strong antagonistic activity to Colletotrichum gloeosporioides. The molecular weight of antifungal protein from strain AiL3 was 28 kD. Control efficiency achieved 45.1% at 9 days after the antifungal protein treatment of concentration 60 μg·mL?1, which had no significant difference with that of Sportak (43.6%). The antifungal protein could inhibit the hyphal growth and caused abnormal hyphal morphology of C. gloeosporioides, such as swollen, curliness and deformity. The treatment could also disrupt the structure of cell membrane, thereby induced the leakage of cytoplasm. The activities of peroxidase (POD) and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) of mango after the treatment were decreased and increased, respectively.
Key words: endophytic bacterium; antifungal protein; isolation and purification; control efficiency; bio-control mechanism
芒果炭疽病是由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的侵染性病害，主要为害芒果叶片、花穗和果实，可引起叶斑、花疫和果实腐烂，其中以引起果实腐烂最为严重，造成的损失最
收稿日期：2011-10-13
基金项目：中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（sscri200711、sscri201002）；海南省自然科学基金（808183）；广东省科技计划（2009B020310015、2009B030803055）
作者简介：余莎（1986-），女，硕士研究生，E- mail: e200524140420@https://www.doczj.com/doc/9f8587009.html,；*通讯作者，博士，E-mail: hehong893@https://www.doczj.com/doc/9f8587009.html,。
第1期余莎等：红树内生细菌AiL3抗菌蛋白的纯化及其防治芒果炭疽病机理研究 105
大[1]。目前芒果采后防腐保鲜主要采用物理和化学方法，其中以化学杀菌剂如咪鲜胺等控制处理最为
常见，但由于化学杀菌剂长期使用后易引起药物残留、污染环境、病菌产生抗（耐）药性[2]等不良影响
而越来越受到限制。生物防治因效果好、对目标病原菌具有专一性强、无环境污染等优点，成为果
蔬采后病害防治的研究热点[3,4]，目前已从土壤、植物体内外及海洋中分离筛选到大量的对多种果蔬
采后病害具有良好防病效果的微生物及其活性物质[5~7]。但有关芒果采后炭疽病的生物防治，目前
研究报道却不多见。本实验室对海陆两栖特殊植物（红树）内生细菌资源进行了系统分离，从中筛选到
一株对芒果炭疽病菌具有较强拮抗作用的内生细菌AiL3菌株，并证明了其抗菌活性物质主要为抗菌蛋
白[8,9]，本文对该菌株的抗菌蛋白进行了分离纯化，对其防治采后芒果炭疽病的效果与作用机理进行了初步
研究，以期为微生物源抗菌活性物质用于果蔬采后病害的生物防治、防病保鲜制剂的研制与开发应用等提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌株供试菌株AiL3为本实验室从湛江红树植物——老鼠簕叶片中分离获得，对芒果炭疽菌等多
种植物病原菌具较强的拮抗作用，经鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens，菌株产生的抗菌物
质主要为抗菌蛋白[8,9]；
供试病原菌：芒果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides为本实验室分离保存。
1.1.2 芒果及施保克供试芒果为金黄芒，由市场购得，试验时选取健康无病、大小均一、约八成熟芒果，
清水表面冼净，晾干后备用。
供试对照农药施保克由市场购得，拜耳作物科学公司制造，珠海经济特区瑞农植保技术有限公司分装，
有效化学成分为咪酰胺，化学式为C15H16C l3N3O2，有效成分含量为250 g·L?1。
1.1.3 培养基供试菌株平板培养用NA培养基（蛋白胨5 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖
2.5 g，琼脂20 g，
蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2）；供试菌株发酵培养用PSS液体培养基（马铃薯200 g，蛋白胨5 g，蔗糖
20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.5）；供试病原菌产孢培养用PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，
琼脂20 g，蒸馏水1000 mL）。
1.2 菌株抗菌蛋白的分离纯化
挑取NA平板培养的菌株AiL3单菌落，接种于100 mL PSS液体培养基，培养18 h后，按5%接种量
接种于PSS液体培养基，25 ℃、180 r·min?1振荡培养72 h，12000 r·min?1离心 20 min去除菌体，硫酸铵
分级沉淀法[10]提取粗蛋白，分别测定活性。将粗蛋白于121 ℃处理20 min，12000 r·min?1离心后取上清进
行Sephadex G-50（Sigma公司生产）凝胶柱层析，逐管收集洗脱液（20 mmol·L?1 Na2H2PO4-NaHPO4，pH 7.0），
冷冻干燥浓缩后测活性，SDS-PAGE电泳测其分子量[11]。
1.3 蛋白提取液抑菌活性测定及蛋白浓度测定
1.3.1 蛋白提取液抑菌活性测定方法取芒果炭疽病菌孢子液（浓度为 106孢子?mL?1）200 μL，均
匀涂布于PDA平板培养上制成带菌平板，在平板上对角线放置灭菌牛津杯，取200 μL蛋白提取液注
入牛津杯中，以加入200 μL无菌培养液离心上清液为对照，于28 ℃恒温箱内培育48 h后，测量抑
菌圈大小。
1.3.2 蛋白浓度测定方法考马斯亮蓝法测定蛋白浓度参考王林嵩[12]的方法，以磷酸氢二钠溶液和磷酸
二氢钠缓冲液（PB缓冲液）调节蛋白浓度。
1.4 抗菌蛋白防治芒果炭疽病的效果测定
试验设5个处理，分别为喷雾20、40、60 μg·mL?1蛋白液、25%施保克500倍稀释液和无菌水（对照）。
每处理5个芒果，3次重复，待各处理后的果面液体自然晾干后，立即喷雾接种芒果炭疽病菌分生孢子悬
浮液（浓度为106孢子?mL?1），然后分别装入保鲜盒中于25～29 ℃、相对湿度约70%环境下放置，处理
后9 d调查发病情况。芒果炭疽病病情指数分级标准：0级，无病；1级，病斑面积占果实面积的5%以下；
3级，病斑面积占果实面积的6%～15%；5级，病斑面积占果实面积的16%～25%；7级，病斑面积占果
106 中国生物防治学报第29卷
实面积的26%～50%；9级，病斑面积占果实面积的50%以上。
1.5 抗菌蛋白对芒果炭疽病菌菌丝影响测定
1.5.1 抗菌蛋白对芒果炭疽菌菌丝形态的影响取1 mL芒果炭疽菌孢子悬液（浓度为104孢子?mL?1）至
2 mL离心管中，25 ℃，180 r·min?1培养10 h后，加入抗菌蛋白至终浓度为30 μg·mL?1，继续培养，以不加抗菌蛋白小管为对照。加入抗菌蛋白后10 h取样，用光学显微镜（Olympus BX51）观察菌丝形态的变化并拍照。
1.5.2 抗菌蛋白对芒果炭疽菌细胞膜透过性影响将芒果炭疽菌接于200 mL PDB培养液中，25 ℃、120 r·min?1振荡培养3 d后，6000 r·min?1离心10 min收集菌体。分别称取3 g湿菌体，加入20 mL无菌水中，再分别加入终浓度为0、30、60 μg·mL?1的抗菌蛋白液后，立即取出5 mL液体，用电导仪（DDB－600型）测定各处理的电导率，每0.5 h离心测定1次。
1.6 抗菌蛋白对芒果防御性酶活影响的测定
设菌株?1
24 h PAL）等防御性酶活。PAL
1.7
用
2
2.1 菌株AiL3
30%、30%～
70%、70%～80%
15.3、16.8、19.7
50%
性[8]
样品，经121
抑菌带宽度为
测定后发现峰2
且有抗菌活性，
电泳得分子量约为28 kD的一条带（图1）。表明红树内生细菌AiL3菌株产生的抗菌物质可能主要为分子量约为28 kD的热稳定蛋白。
AiL3图谱
SDS-PAGE analysis of purified antifungal protein produced
注：1. 低分子量标准蛋白分子量标记；2. 纯化后的抗菌蛋白；3. 粗蛋白Note：1. Low molecular weight protein marker；2. Purified antifungal
protein；3. Crude protein
2.2 菌株AiL3抗菌蛋白防治芒果炭疽病的效果
红树内生细菌菌株AiL3抗菌蛋白对芒果炭疽病室内防病效果结果表明（表1），菌株抗菌蛋白液对采后芒果炭疽病具有一定的防治效果，随着抗菌蛋白浓度的增加，其防病效果也逐渐增强。处理9 d后，20、40、60 μg·mL?1蛋白液的防治效果分别为27.3%、38.2%、45.1%，其中60 μg·mL?1的防治效果与25%施保克的防治效果无显著差异。
2.3 菌株AiL3抗菌蛋白对芒果炭疽菌菌丝的影响
菌株抗菌蛋白处理后，芒果炭疽菌的菌丝畸形，中间呈球状膨大，粗细不均（图2B），部分菌丝末端呈现膨大，并有内含物渗出现象（图2C），说明该抗菌蛋白对芒果炭疽菌具有较强的抑制作用。
第1期余莎等：红树内生细菌AiL3抗菌蛋白的纯化及其防治芒果炭疽病机理研究 107
表1 抗菌蛋白对采后芒果炭疽病的防治效果
Table 1 Control efficiency of the antifungal proteins from AiL3 to anthracnose of postharvest mango
处理Treatment
病情指数
Disease index
防效（%）
Control efficiency
20 μg·mL?1蛋白液 20 μg·mL?1 proteins 53.2 27.3 cC
40 μg·mL?1蛋白液 40 μg·mL?1 proteins 45.3 38.2 bB
60 μg·mL?1蛋白液 60 μg·mL?1 proteins 40.2 45.1 aA
施保克500倍液Prochloraz diluted 500 times 41.3 43.6 aA
无菌水对照Sterile water CK 73.3 — 注：同列数据后不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）, 不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
Note: In the same column, different small and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 respectively. The same below.
A B C
1 h其
00.51 1.52 2.5
时间 (h) Time
图3 AiL3抗菌蛋白对芒果炭疽菌菌丝细胞膜通透性影响
Fig. 3 Effect of antifungal protein on the electric conductivity of mycelium of C. gloeosporioides
2.4 菌株AiL3抗菌蛋白对芒果体内丙二醛（MDA）含量及防御性酶活性影响
2.4.1 丙二醛（MDA）含量测定各处理芒果丙二醛（MDA）含量变化测定结果表明（图4），抗菌蛋白处理后芒果体内的MDA含量变化较平稳，且量值均比对照低；各处理3 d后的MDA含量开始上升，以对照处理上升更为迅速，这与病害发生情况基本吻合。
108 中国生物防治学报第29卷
2.4.2 防御性酶活影响测定接种炭疽菌孢子后芒果体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）活性变化趋势测定结果表明（图5），各处理PAL酶活性变化趋势大体一致，均为先升高后略有下降，随后又较大幅度上升；处理48 h后，抗菌蛋白处理的PAL酶活性显著高于对照（图5A）。而各处理POD 酶活性变化趋势基本相似，但抗菌蛋白处理的POD酶活均比对照低（图5B）。表明抗菌蛋白处理后可诱导芒果体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）等活性改变，以提高其防病作用。
t
2
4
6
8
48
P
A
L
活
性
变
化
(
μ
m
o
l
·
g
–
1
)
P
A
L
a
c
t
i
v
i
t
y10
15
g
–
1
F
W
)
t
y
P B buffer
时间 (h) Hours after treatment
A B
3 讨论
关于植物病害生防芽胞杆菌产生的抗菌活性物质，现报道的主要有：高分子量的抗菌蛋白、脂肽抗生素、细菌素以及低分子抗菌肽等低分子量的抗菌素和醇、醛、酯、酮类等挥发性的化合物三大类。抗菌蛋白是芽胞杆菌抗菌活性物质的重要组成部分，芽胞杆菌的分泌功能十分发达，从整个基因组估算大约可合成4107种蛋白，其中约有25%的蛋白是可输出胞外的，有许多蛋白被证实是对植物有价值的抗真菌病害蛋白质[16,17]。本文研究结果表明，红树内生芽胞杆菌AiL3菌株产生的拮抗芒果炭疽菌的活性物质主要为分子量约为28 kD的抗菌蛋白，测定发现该抗菌蛋白含有19种氨基酸，以谷氨酸含量最高，达27.66%（未发表资料）。防病测定表明该抗菌蛋白不仅对芒果炭疽菌有明显的抑制作用，且对采后芒果炭疽病具有良好的防病作用，60 μg·mL?1抗菌蛋白处理9 d后的防治效果与目前芒果等果蔬采后防腐保鲜主要咪鲜胺类杀菌剂施保克相当，虽然本研究中施保克等处理对采后芒果炭疽病的防效较相关报道偏低[18]，但经多次试验重复结果基本相似，这可能是由于本研究测试时接种芒果炭疽病菌孢子量较大所致。由于该抗菌蛋白稳定性好[8]，且添加助剂（如乳化剂Tween80等）能增加其对芒果炭疽病的防效[19]，可见AiL3菌株抗菌蛋白具有良好的开发前景。有关该抗菌蛋白的氨基酸序列及其相关基因等正在进一步研究，结果另文报道。
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关于果蔬采后病害生物防治的机理，前人报道认为主要是抗菌与诱导抗病等共同作用的结果[20,21]。本
研究结果表明，AiL3菌株抗菌蛋白不仅可使芒果炭疽菌菌丝出现肿胀、膨大、畸形，菌丝细胞膜透性增加，
细胞内含物外渗；浓度较高时还可导致病菌分生孢子消解[9]；同时测定发现，抗菌蛋白处理后可使芒果体
内MDA含量降低，过氧化物酶（POD）活性下降，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性上升，说明该抗菌蛋
白处理后可诱导寄主抗病性增强。因此本文认为，抑制芒果炭疽菌生长、繁殖，并诱导芒果抗病性的增强
共同作用可能是该抗菌蛋白防治芒果炭疽病的主要机理，该结果与前人报道相似。但关于该抗蛋白防治芒
果炭疽病的分子机理等尚有待进一步研究。
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第一种方法 蛋白匀浆缓冲液： 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离 第二种方法 裂解液配方： 尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤： 取300mg样品在液氮环境下研磨， 加入1ml裂解液混匀， 室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻）， 15000g离心1小时， 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以
除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？ （可以的，最后上胶条的时候可以再加） 不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好） 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul 测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定
提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月
第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%
细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021
细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
[【生物化学与分子生物学】]细菌总蛋白和膜蛋白提取方法 膜蛋白, 细菌膜蛋白, 细菌 一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。 2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。 4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol裂解液中分离总蛋白 1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。 2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。 3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。 4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g 离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。 6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g 离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。 2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。 3、菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。 4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。 5、将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。 6、于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。 7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验 8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。
生物化学综合性实验 蛋白质的提取（沉淀法）和定量分析之 鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定 一、实验目的 研究盐析沉淀和等电点沉淀法的基本原理和技术。 一、二、实验原理 1、沉淀法粗分离蛋白质[1][2] 沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。 蛋白质分子表面含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液和稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。 由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗分离蛋白质的目的。 盐析法是1878年Hammarster首次使用的，可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等，其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。 鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。 等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。 卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋的等电点是5.1。 2、蛋白质的测定 根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得
医学生物学研究技术与实验 实验报告 实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot 一、实验目的 1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术 二、实验原理 1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。 蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水
解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。 2. Lowry法测定蛋白质浓度 1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物； 2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线 3.SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 （1）浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸
细胞总蛋白提取 准备： 1、冰盒、提前开启低温高速离心机、预冷1× PBS、细胞刮刀、移液器（吸头）。 2、1×RIPA buffer [Thermo (89901)]、100×Cocktail [CALBIOCHEM (#539131)]、100×PMSF [Beyotime (ST506-2)]、10×Phosstop [Roche (4906837001)] (Cocktail 和Phosstop 分装储存于-20℃，需提前置于冰上解冻，根据xuyao)。Cocktail和Phosstop的配制方法为：1粒药片加入1ml RIPA buffer [Thermo (89901)]，分别配成100X Cocktail 和10X Phosstop。 PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂, -20℃保存1年。 Coaktail:抑制丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶；2- 8°C保存1-2周，-20°C 可保存至少1个月。 PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。溶解后的储存液体4℃可以稳定保存一个月以上，-20℃下可以保存6个月。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 3、标记并预冷1.5ml离心管（样品数）、0.5ml离心管（样品数）、0.2ml离心管（样品数）。 样品： 1、根据实验需求干预细胞，蛋白提取前用显微镜拍照记录细胞数量及状态（用于评估需要裂解液的量和Western Blot数据分析参考）。 举例：HCT-8细胞接种于2块6孔板中，用PZH干预24h后，对照组细胞汇合度约为80%时，PZH 0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml所需加入裂解液的体积为60μl、60μl、60μl、50μl，即所需加入孔中裂解液总量为690μl，所配量比所需份数多2-3份，预计所配量为800μl（1× RIPA Buffer 704μl + 100×Cocktail 8μl + 100× PMSF 8μl + 10×Phosstop 80μl、），剩余裂解液另存于离心管中保存于-20度，供测定BCA时使用。提取在冰上操作及试剂置于冰上保存。
植物膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用） 货号：BB-31841 V2.16 试剂盒组成： 产品组成 BB-31841-1 BB-31841-2 组份编号 规格 50T 100T 试剂A：植物膜蛋白提取液A 25ml 50ml 31841A 试剂B：植物膜蛋白提取液B 250ul 500ul 31841B 试剂C：膜蛋白溶解液C 10ml 20ml 31841C 试剂D：蛋白酶抑制剂混合物 100ul 200ul 31841D 使用说明书 1 1 知识产权： 贝博TM BBproExtra TM试剂盒及其使用方法包含专有技术。 产品简介： 膜蛋白承担各种生物功能，扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。 贝博TM BBproExtra TM植物膜蛋白提取试剂盒（二维电泳用）是一种基于化学方法的高产膜蛋白提取试剂盒。植物膜蛋白提取试剂盒可以从各种植物中提取膜蛋白，可用于纯化膜蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白用于双向电泳。如需要用于报告基因检测、SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验的试剂盒，请联系贝博，选用其它产品号的产品。 使用方法： 1、试剂准备： 每500ul膜提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。 2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加 入500ul提取液A，用组织匀浆机/匀浆器充分匀浆。 3、匀浆或研磨后加入500ul提取液A，混匀后于一个干净离心管中在2-8℃振荡1小时。 4、将提取液在2-8℃条件下12000g离心5分钟，取上清。 5、在上清中加入5ul提取液B，充分混匀。 6、在37℃水浴10分钟。 7、在37℃ 1000g离心3分钟。 8、此时液体分为2层，小心移除上层部分，吸取下层管底部大约50ul液体。 9、用50-150μl冷的膜蛋白溶解液C溶解下层溶液，即得膜蛋白样品。
优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
蛋白质提取常用试剂及操作方法 一、原料选择和前处理 （一）原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 （二）前处理 1.细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ.反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ.冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 Ⅲ.超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法 一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH ）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，% Triton X-100，调pH 值至备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。 2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。 4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol裂解液中分离总蛋白 1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。 2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。 3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。 4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。 6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至备用。
《分子生物学实验》 实验报告 实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定 姓名：杰 学号：3140104666 组别： 同组同学：唐曦
带教教师：伟俞萍 实验日期：2015年9月15日 目录 1.原理： (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)
3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论： (11) 1.原理： 1.1生物样本中蛋白质的提取 离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色