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碳酸二甲酯甲基化反应催化剂和反应机理研究进展
作者：朱茂电， 刘绍英， 贾树勇， 王公应， ZHU Mao-dian， LIU Shao-ying， JIA Shu-yong ， WANG Gong-ying
作者单位：朱茂电,ZHU Mao-dian(中国科学院成都有机化学研究所,四川成都610041;常州轻工职业技术学院,江苏常州213164;中国科学院研究生院,北京100049)， 刘绍英,王公应,LIU Shao-
ying,WANG Gong-ying(中国科学院成都有机化学研究所,四川成都610041;常州化学研究所常
州市绿色化学和技术重点实验室,江苏常州213164)， 贾树勇,JIA Shu-yong(常州化学研究
所常州市绿色化学和技术重点实验室,江苏常州,213164)
刊名：
化学试剂
英文刊名：Chemical Reagents
年，卷(期)：2012,34(7)
参考文献(31条)
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本文链接：https://www.doczj.com/doc/987542225.html,/Periodical_huaxsj201207011.aspx
常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
第17卷 第1期 2003.3 沈 阳 化 工 学 院 学 报 JOURNAL OF SHEN YAN G INSTITU TE OF CHEMICAL TECHNOLO GY Vol.17 No.1 Mar.2003 文章编号: 1004-4639(2003)01-0001-03 用碳酸二甲酯和环戊二烯制备甲基环戊二烯的研究 张建西, 张大洋, 刘瑞祥, 赵鸣玉 (沈阳化工学院,辽宁沈阳110142) 摘 要: 以碳酸二甲酯为甲基化试剂,在二乙二醇二甲醚溶剂中,进行环戊二烯催化甲基化的研究.通过实验考察反应温度、反应时间、物料配比、催化剂量及碘化钾试剂对甲基环戊二烯产率的影响,确定反应最佳条件,甲基环戊二烯产率达8518%. 关键词: 碳酸二甲酯; 甲基环戊二烯; 环戊二烯; 合成中图分类号: TQ23112 文献标识码: A 收稿日期: 2002-07-12 作者简介: 张建西(1978-),男,山西原平人,硕士,主要从事精细化学品和有机化工产品的合成研究. 甲基环戊二烯是一种重要的有机化工原料,可用来制备环氧树脂固化剂MNA [1],也可用于合成MM T (甲基环戊二烯三羰基锰)[2].但是,甲基环戊二烯与环戊二烯相比,在乙烯裂解所产生的C 52C 6组分中含量很少.因此,以环戊二烯为原料,经过甲基化反应制备甲基环戊二烯的研究,具有十分重要的意义. 碳酸二甲酯(简称DMC )是近年来发展起来的一种新型“绿色”化工产品.它能代替剧毒的光气生产多种异氰酸酯、聚碳酸酯等及各种医药农药中间体.作为甲基化试剂,可代替剧毒的硫酸二甲酯.近年来,实验表明它是一种优良的甲基化、羰基化试剂[3].对于碳酸二甲酯,文献报道一般为在其它杂原子(如氧、氮等杂原子)上甲基化,而在碳原子上甲基化报道很少. 以碳酸二甲酯为甲基化试剂,与环戊二烯和钠反应制备甲基环戊二烯.结果表明:此方法具有反应时间短、产物产率高、无污染物排放、后处理方便、无污染等优点.这是一条与环境友好的符合可持续发展战略的工艺路线. 1 实验部分 111 主要仪器与药品 仪器:阿贝折光仪WZS 2Ⅰ型,上海光学仪器 厂;SP501型气相色谱仪;CDMC 21B 色谱数据处 理器,上海计算技术研究所. 药品:金属钠,分析纯,天津丽东区大东化工厂;双环戊二烯,83%工业品,辽化;二乙二醇二甲醚,分析纯,苏州工业园区正兴化工研究院;碳酸二甲酯,化学纯,上海石油化工有限公司. 分析条件:色谱柱:Φ3mm ×3m ;固定液:聚乙二醇20mol 10%;担体:Chromosorb G AW 2DMCS ,60～80目;柱温:70℃;汽化室:190℃;热导池检测器:150℃;桥电流:190mA ;氢气流速:60mL/min ;进样量:013μL.112 反应方程式 反应方程式如下: 113 甲基环戊二烯的制备 在通有氮气的干燥的250mL 圆底三口烧瓶中分别加入140mL 二乙二醇二甲醚,810g 金属钠,加热至钠呈熔融的液体状态时,立即开动搅拌器,将钠打成细小微粒,制成钠砂.将45g 新蒸环戊二烯滴入钠砂中,很快便可以观察到有大量气
DNA甲基化——试剂盒+抗体解决方案 DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 一、DNA甲基化修饰相关产品 DNA甲基化修饰研究手段——DNA亚硫酸盐转化，使用亚硫酸氢钠将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持完整。即未甲基化的胞嘧啶残基被脱氨成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶（5-mC）残基不受影响，这使PCR扩增可将尿嘧啶视为胸腺嘧啶，将5-mC或5-hmC识别为胞嘧啶。这样便能够区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶残基，从而提供有关DNA甲基化区域的单核苷酸分辨率信息。 要成功地进行DNA甲基化研究，必须进行完全转化，并减少通常由于严酷的化学反应而导致的DNA降解量。基于亚硫酸氢盐和亚硫酸氢钠的方法是用于研究DNA甲基化并帮助制备基因组DNA进行基因特异性DNA甲基化分析的常用方法。亚硫酸氢盐转化后通常是下游应用，在基因特异性基础上分析DNA甲基化的流行下游方法包括亚硫酸氢盐测序，甲基化特异性PCR（MS-PCR）和基于甲基化的微阵列。 整个转换过程中，高质量的DNA是至关重要的，因为转换过程中的酸性物质会破坏DNA。而对于大规模亚硝酸氢盐转化实验，高通量选择对于节省时间和降低成本至关重要。 此外，还有高通量DNA修饰试剂盒，EpiNext高灵敏度亚硫酸氢盐测序试剂盒（Illumina），一步法DNA 修饰试剂盒，Methylamp通用甲基化DNA试剂盒，Methylamp全细胞亚硫酸氢盐修饰试剂盒等。
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法） 基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点. 第一部分基因组DNA的提取。 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
Data Supplement Title: Circulating methylated SEPT9 DNA in Plasma is a Biomarker for Colorectal Cancer. Theo deVos1, Reimo Tetzner2, Fabian Model1,3, Gunter Weiss2,Matthias Schuster2, Jürgen Distler2, Kathryn V. Steiger1 , Robert Grützmann5, Christian Pilarsky5, Jens K. Habermann6, Phillip R. Fleshner7, Benton M. Oubre8, Robert Day1, Andrew Z. Sledziewski1, Catherine Lofton-Day1 1) Detailed m SEPT9 Assay Protocol: DNA Extraction: DNA was extracted from 5 mL of blood plasma using a modified viral DNA/RNA extraction kit (chemagen AG, Baesweiler Germany). Plasma samples were thawed at room temperature and extracted following the directions of the kit with modifications. Samples were lysed and treated with protease at 56?C for 10 min in a 50 mL Falcon tube. 100 μL of magnetic particles and 15 mL of binding buffer were then added, and binding was performed for 60 min at room temperature on a rotator. Magnetic particles were captured for 4 min, the supernatant discarded and the pellet was resuspended in 3 mL of wash buffer. 1.5 mL of particle solution were transferred to a 2 mL SafeLock, the beads captured and the supernatant discarded. This was repeated to complete the 3 mL transfer. Tubes were briefly centrifuged and the residual wash buffer was removed by pipetting after bead separation. The tubes were then placed in a 56?C dry block for 5 min, 100 μl of elution buffer was added, the tubes incubated at 65?C with shaking on a thermomixer for 15 min, the particles separated on a magnetic stand and the eluted DNA transferred to a 0.5 mL SafeLock tube (Eppendorf). A 5μl aliquot of the DNA sample was transferred to 45 μl of elution buffer for the measurement of genomic DNA. Bisulfite Conversion: The sample input for bisulfite treatment was 95-100 μl of extracted DNA in elution buffer. The bisulfite reagents (for 25 reactions) were prepared as follows. Bisulfite solution: Sodium bisulfite (4.71gm) and sodium sulfite (1.13gm) were dissolved in 10 mL of ddH2O in a falcon tube, by vigorous shaking and heating to 50?C if required, and the pH adjusted to 5.4-5.5 with 0.2M NaOH as necessary. DME-radical scavenger solution: 188 mg of 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid was dissolved in 1.5 mL diethyleneglycoldimethylether (DME), vortexing to ensure an uniform solution. Bisulfite Reaction: 190 μL of bisulfite solution and 30μl DME-radical scavenger solution were added to the 95-100 μl DNA sample in 0.5 mL SafeLock tubes. The tubes were incubated in a Eppendorf Mastercycler (Eppendorf)according to the following protocol: 5 min 99°C, 25min 50°C, 5 min 99°C, 1h 25min 50°C, 5 min 99°C, 4h 55min 50°C, hold 20°C. This protocol allowed overnight bisulfite conversion. Bisulfite Purification: Following bisulfite conversion, DNA was purified using a customized kit from chemagen AG. The bisulfite reaction (320 μL) was transferred to a 2 mL SafeLock tube, and 1 μLof polyA (500 ng/μL) and 1.5 mL of binding buffer were added. 10 μL chemagen magnetic particles were added and the sample was mixed by vortexing. The samples were incubated at room temperature on a thermal mixer at a rotation of 1000 rpm for 60 min. Magnetic particles were separated on a magnetic stand, the liquid discarded, the tubes briefly centrifuged and the residual liquid removed following magnetic separation. The particles were washed twice with wash buffer II from the kit, and once with 70% ethanol. Following the ethanol wash, the tubes were centrifuged again, and the residual liquid removed following magnetic
碳酸二甲酯(简称DMC)是近年来受到国内外广泛关注的环保型绿色化工产品。由于其分子中含有CH3-、CH3O-、CH3O-CO-、-CO-等多种官能团，因而具有良好的反应活性；另外，1992年DMC在欧洲通过了非毒性化学品(Non toxic substance)的注册登记，属于无毒或微毒化工产品。因此，一方面DMC有望在诸多领域全面替代光气、硫酸二甲酯(DMS)、氯甲烷及氯甲酸甲酯等剧毒或致癌物进行羰基化、甲基化、甲酯化及酯交换等反应生成多种重要化工产品；另一方面，以DMC为原料可以开发、制备多种高附加值的精细专用化学品，在医药、农药、合成材料、染料、润滑油添加剂、食品增香剂、电子化学品等领域获得广泛应用；第三，其非反应性用途如溶剂、溶媒和汽油添加剂等也正在或即将实用化。所以，DMC被誉为21世纪有机合成的一个“新基块”，其发展将对我国的煤化工、甲醇化工、C1化工起到巨大的推动作用。 1 DMC的性质 DMC结构式(CH3O)2CO，分子量为90.08，相对密度1.070，折射率1.3697；熔点4℃，沸点90.1℃。在常温下为无色液体，具有可燃性，微溶于水但能与水形成共沸物，可与醇、醚、酮等几乎所有的有机溶剂混溶；对金属无腐蚀性，可用铁筒盛装贮存；微毒(LD50＝6400~12900mg/kg，而甲醇的LD50＝3000mg/kg)。由于DMC 的化学性质非常活泼，可与醇、酚、胺、肼、酯等发生化学反应，故可衍生出一系列重要化工产品；其化学反应的副产物主要为甲醇和CO2。与光气、DMS等的反应副产物盐酸、硫酸盐或氯化物相比，危害相对较小。 2 DMC合成技术评述 DMC合成方法可分为三大类：光气法、甲醇氧化羰基化法、酯交换法。后两法将成为未来DMC的主要生产方法。 2.1 光气法 2.1.1 光气甲醇法 是最早的DMC合成方法，反应分两步进行，氯甲酸甲酯为中间产物。 COCl2十CH3OH→ClCOOCH3十HCl ClCOOCH3十CH3OH→(CH3O)2CO十HCl 总反应：COCl2十2CH3OH→(CH3O)2CO十2HCl 原料剧毒，产品含氯，且副产大量HCl，属于淘汰型工艺。一般只有生产光气的企业就近生产DMC，且须采取周密安全措施。 2.1.2 光气醇钠法 光气和甲醇钠直接反应合成DMC，是光气甲醇法的改进。 COCl2十2CH3ONa→(CH3O)2CO十2NaCl 2.2 甲醇氧化羰基化法 2CH3OH十CO十1/2O2→(CH3O)2CO十H2O 该法以CH3OH、CO和O2为原料，原料价廉易得，投资少，成本低且理论上甲醇全部转化为DMC，无其他有机物生成，受到工业界极大重视，被认为是DMC最有前途的生产方法，也是各大工业国家重点研究、开发的技术路线。 2.2.1 ENI液相氧化羰基化法 2CH3OH十1/2O2十2CuCl→2Cu(OCH3)Cl十H2O CO十2Cu(OCH3)Cl→(CH3O)2CO十2CuCl 总反应： 2CH3OH十1/2O2十CO→(CH3O)2CO十H2O 以氯化亚铜为催化剂，反应在两台串联的带搅拌的反应器中分两步进行。甲醇
免疫组化 免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 免疫组化试剂盒： Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒： Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN?ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。试剂盒组份： 2ml试剂A（Avidin DH溶液） 2ml试剂B（生物素化的酶） 1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体） 3ml阻断血清 其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂B VECTASTAIN?ABC系列产品 VECTASTAIN?ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN?ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织 VECTASTAIN?ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。 VECTASTAIN?ABC Kits（辣根过氧化物酶）灵敏度高，特别适用于神经组织
甲基化DNA定量试剂盒与羟甲基化DNA定量试剂盒产品特点 --Epigentek 启维益成提供---甲基化DNA定量试剂盒(比色法) MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) 产品优点： 1、整个比色法检测实验的操作简单易学，方便快捷，能定量检测全基因组的DNA甲基化 水平，只需要4小时就能完成实验。 2、新颖的试剂盒组分使背景信号极低，去掉了平板封闭并使分析更加地简单、精确、可靠、 稳定。 3、灵敏度高，能在50ng的基因组DNA中检测出低至0.2ng的甲基化DNA。 4、优化的抗体和增强溶液对检测5mC具有高度特异性，不会对未甲基化的胞嘧啶产生交 叉反应，且在指定的样品DNA的浓度范围内与羟甲基胞嘧啶无交叉反应或有轻微的交叉反应 5、试剂盒提供通用阳性和阴性对照，能用于定量检测任何物种来源的甲基化DNA，包括 哺乳动物、植物、真菌、细菌以及病毒； 6、96孔板模式使分析具有灵活性，您可以根据自己的需要选择用手工或者高通量分析。 启维益成提供---甲基化DNA定量试剂盒(荧光法) MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit （Fluorometric） 产品优点： 甲基化定量试剂盒荧光法的产品优点与比色法基本相同，不同点为灵敏度不同，比色法能在50ng的基因组DNA中最低检测出0.2ng的甲基化DNA；荧光法能在20ng的基因组DNA中最低检测出50pg的甲基化DNA。 启维益成提供---羟甲基化DNA定量试剂盒(比色法) MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) 关于5-hmC 5-hmC是近年来在动物组织中发现的，由胞嘧啶修饰而来。5-hmC在表观遗传学上的功能可能与5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同，尽管到现在为止还不确知其功能。有研究者猜测它在调控基因的表达与关闭过程中起着重要的作用。5-mC的发现让我们不得不重新评估DNA
碳酸二甲酯在有机合成中的应用 摘要： 介绍新的绿色化工基本原料---碳酸二甲酯（DMC ）在有机合成中的应用. 主要介绍碳酸二甲酯参与的甲基化反应, 羰基化反应, 酯交换反应和氨解反应. 关键词：碳酸二甲酯(DMC); 光气; 甲基化; 羰基化; 酯交换; 氨解 1. 前言 碳酸二甲酯(DMC) 是一种新的低污染、环境友好型的绿色基础化工原料，对于环境保护具有重大意义。分子式为CO(OCH 3)2，其分子结构中含有一CO 、一 COOCH 3、一CH 3等多种官能团，化学性质非常活泼，作为有机合成中间体能与酚、 醇、胺、肼、酯类化合物发生反应合成许多具有特殊性质的化合物[1]。1992年它在欧洲通过了非毒性化学品的注册登记，因而在许多领域有望全面替代剧毒的光气、硫酸二甲酯、氯甲烷及氯甲酸甲酯等[2]。 2. 羰基化反应 2.1 碳酸二甲酯和3一戊酮合成丙酸甲酯. + CH 3CH 2CCH 2CH 3CH 3OCOCH 2CH 3CH 2CCHCOCH 3O O O CH3 +CH 3OH 2 CH 3CH 2COCH 3 O O 以碳酸二甲酯(DMC)和3-戊酮为原料, 以具有中强碱位的Mg 为催化剂合成丙酸甲酯[3]. 丙酸甲酯是一种重要的化工原料,可以用作香料、溶剂、萃取剂及增塑剂等，在食品、香料等行业有着广泛的应用. 2.2 碳酸二甲酯和苯乙酮反应合成苯甲酸甲酯. CCH 3+CH 3OCOCH 3 O COCH 3+CH 3COCH 3O O 碳酸二甲酯和苯乙酮在固体碱催化下合成苯甲酸甲酯. Bronsted — Lewis 酸碱离子对和固体碱表面配位不饱和的02-所造成的强碱位由有利于碳
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
一.产品介绍 碳酸二甲酯(Dimethyl carbonate,简称为DMC)就是无毒无公害的主要化工原料与产品之一,化学式CH3OCOOCH3,分子量为90、08,常温下为透明液体,略带香味。难溶于水,但能与醇、酮、酯等任意比混溶。DMC 毒性很小,对金属基本上无腐蚀性。DMC 具有酯的通性,可与水发生水解反应;可与含活泼氢基团的醇、酚、胺、酯等化合物反应;与二元醇或二元酚反应生成聚碳酸酯。DMC 分子中含有羰基、甲基、甲氧基等基团,具有良好的反应性能,可代替剧毒的光气、硫酸二甲酯、氯甲烷等作为羰基化剂、甲基化剂与甲氧基化剂,成为开发一系列洁净化工工艺的新基块。一种新型的绿色有机合成中间体,被称为“21世纪有机合成领域的新基块”。 二.主要用途 DMC就是一种重要的有机合成中间体,其结构中含有甲基、甲氧基、羰基、甲氧基羰基,因而具有良好的反应活性,能与酚、醇、胺、肼、酯类化合物发生反应,生成许多重要的化工产品。DMC可代替有毒的硫酸二甲酯作甲基化剂,制备苯甲醚(苯甲醚就是重要的农药、医药中间体),还可用作油脂工业抗氧化剂、食用香料等,以及生产主要用于照相印刷中作显影液的四甲基醇胺(TMAH)。可代替有剧毒的光气作羰基化剂,合成如聚碳酸酯等工程材料,也可用于制造磁带、磁盘等光电子产品。另外,由于DVD等高档视听产品的普及,光盘需求量大幅提高,对以DMC为原料生产的聚碳酸酯的需求将不断增大,因而用在此方面的DMC用量会大幅上升。DMC还可用于生产烯丙基二甘醇碳酸酯(ADC)。ADC就是一种性能优异的热固性树脂,可替代玻璃用于眼镜片与光电材料等新的领域,代替各种有毒溶剂(苯、甲苯)作涂料、油漆的溶剂,也可代替甲基叔丁基醚作汽油添加剂。DMC的分子量含氧高达53％,且辛烷值高,可用作汽油添加剂,以增加汽油含氧量,提高燃烧效率,降低毒性尾气排放,这些方面都要优于MTBE。DMC还就是与环境友好的“绿色化合物”,随着世界各国对环境污染的日益重视,利用DMC的特性及将其作为合成中间体开发绿色化工产品,有着巨大的吸引力与市场潜力。 1.代替光气作羰基化剂 光气(Cl-CO-Cl)虽然反应活性较高,但就是它的剧毒与高腐蚀性副产物使其面临巨大的环保压力,因此将会逐渐被淘汰;而DMC(CH3O-CO-OCH3)具有类似的亲
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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