孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验二油脂酸价的测定
一、目的与要求
初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。
二、实验原理
油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。
酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。
三、主要仪器、实验材料和试剂
1. 锥形瓶（250 mL）3个；
2. 量筒（50 mL）1支；
3. 碱式滴定管1支；
4. 花生油、菜油、芝麻油等；
5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；
6. 0.1 ％KOH（1克KOH溶于1000 mL纯水中）。
四、操作步骤
1. 准确称取1~2 g油脂于250 mL锥形瓶中。
2. 在瓶内加入乙醇－乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。
待油样完全溶解后，加入1％酚酞指示剂3～5滴，立即用0.1％KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。
酸价＝2(V2-V1)/W
V2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数
V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数
W：油样重(g)
注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。
五、实验结果
油脂名称起始刻度终点刻度体积（mL）酸价备注
空白对照
六、思考题
请对你的实验结果进行分析。
批阅教师：年月日
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验三蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)
一、目的与要求
掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 试验材料：萌发3天的小麦种子
2. 主要仪器
（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管（5）研钵（6）100 mL容量瓶
3．试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。
四、操作步骤
1．蛋白质（淀粉酶）的提取
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。
2. 标准曲线制作
按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。
批阅教师：年月日
表1 蛋白质标准曲线制作
管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm
1040
20.5 3.50.125
3 1.0 3.00.25
4 1.
5 2.50.375
5 2.0 2.00.50
6 2.5 1.50.625
7 3.0 1.00.75
8 4.00 1.0
3.样品测定
取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。
蛋白质浓度=
五、思考题
1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？
2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验四淀粉酶活力的测定
一、目的与要求
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。
二、实验原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70 ℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1
（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13（8）试管架（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 （10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
批阅教师：年月日
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：
表1 麦芽糖标准曲线制作
管号
试剂
1234567
麦芽糖标准液（mL）00.20.6 1.0 1.4 1.8 2.0
蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.4 1.00.60.20
麦芽糖含量（mg）00.20.6 1.0 1.4 1.8 2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
吸光度值
摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10 mL，放入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
3．酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表
2 酶活力测定取样表
将各试管摇匀，置沸水浴中煮沸5 min 。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL 。以1号管（做标准曲线时用过的）作为空白调零点，在540 nm 波长下比色测定光密度，记录测定结果。
管号 Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6
吸光度
麦芽糖含量
五、结果计算
计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg ），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。
＝
计算Ⅱ- 5、Ⅱ- 6光密度平均值与Ⅱ- 4光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg ），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力(单位同上)。
（α＋β）淀粉酶总活力
＝
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力＝
六、思考题
1．为什么要将Ⅰ- 1、Ⅰ- 2、Ⅰ- 3号试管中的淀粉酶原液置70 ℃水浴中保温15min ？
2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40 ℃水浴中保温？
操 作 项 目 α-淀粉酶活力测定 α＋β-淀粉酶活力测定 Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6 淀粉酶原液（mL ） 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化β-淀粉酶 置70 ℃水浴15min ，冷却
淀粉酶稀释液（mL ） 0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸（mL ） 2.0 0 0 2.0 0. 0 预保温 将各试管和1%淀粉溶液分别置于40℃恒温水浴中保温10 min 1%淀粉溶液（mL ） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸（mL ） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验五醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
一、目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。
二、原理
带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳有很多类型，如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。
不同的质点在同一电场中泳动速度不同，据此可将不同带电物质分开。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材及试剂
1．器材：
①醋酸纤维薄膜（2×8cm）⑥玻璃板
②常压电泳仪⑦竹镊
③点样器（盖玻片）⑧白磁反应板
④培养皿（染色及漂洗用）⑨人血清或鸡血清
⑤粗滤纸
2．试剂：
①巴比妥缓冲液（PH8.6）：巴比妥2.76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000毫升。
②染色液：氨基黑10B 0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复用）。
③漂洗液：含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。
④透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。
四、操作步骤
1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在无光泽面角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。
2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。
批阅教师：年月日
3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V ，电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。
4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。
5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。
6．定量（了解）：有两种方法 （1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于4.0ml 0.4mol ·L -1NaOH 溶液中（37℃）5—10分钟，色泽浸出后，比色（590nm ）。设各部分的光密度分别为：OD 白、OD α1、OD α2、OD β、OD γ。则光密度总和（OD 总）为：
OD 总=OD 白+OD α1+OD α2+OD β+OD γ
白蛋白%=
总
白OD
OD ×100 α1球蛋白%=
总OD OD 1α×100 α2球蛋白%=
总
OD OD 2α×100
β球蛋白%=
总
OD
OD β
×100 γ球蛋白%=总
OD
OD γ
×100
（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后．．．．．．．．，浸入透明液中约5—10分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。
五、思考题
1．点样端为何放在负极？ 2．实验中应注意哪些事项？
膜条
+ 样品
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验六氨基酸的分离鉴定――纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：
Rf = 原点到层析中心的距离/ 原点到容剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1、层析缸
2、毛细管
3、喷雾器
4、培养皿
5、小烧杯
6、长颈漏斗
7、层析滤纸(新华一号)
8、电吹风
四、试剂
1、扩展剂正丁醇:88%甲酸:水＝15:2.5:2.5（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制40 mL。
2、氨基酸溶液0．5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0．5％)。
3、显色剂50～l00 mL 0.1％水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1．将盛有扩展剂10 mL的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。
2．戴手套取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘2～3 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2.5 cm作一记号。
3．点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后重复点一次，直径最大不超过3 mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约10~30分钟。4．展层用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。溶剂扩展至滤纸上沿约5厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。
5．显色用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有α－氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。
批阅教师：年月日
6．计算各种氨基酸的Rf 值。
六、实验结果
各种氨基酸的Rf 值： 赖氨酸 脯氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸
Rf 值
七、思考题
1. 实验过程中切勿用手直接接触滤纸和显色剂，为什么？
2. 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为什么？
溶剂前沿
层析点
原点
溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯
赖
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：
实验七基因组DNA的快速提取---碘化钾法
一、实验目的
了解碘化钾法提取动物组织基因组DNA的原理；掌握DNA提取的相关操作技术。
二、实验原理
快速、经济地从血液、组织或培养细胞中得到高产量、高纯度的DNA 对于基因研究非常重要。
目前国内外基因组DNA 的提取方法有传统的蛋白酶K 消化法、尿素法、氯化锌法、辛酸法等，这些方法存在操作步骤繁杂或者使用蛋白酶，且国内许多实验室不易得到方法中使用的试剂。高浓度碘化钾可直接将细胞膜、核膜破坏、使DNA 释放出来，然后用异丙醇沉淀DNA。实验表明，KI 的浓度对DNA 的提取效率有影响，5 mol/ L 的KI 提取DNA 效果较好。
KI 法操作简便，不用价格较高的蛋白酶K。DNA 丢失少。该方法提取的DNA 与经典的蛋白酶K 法提取的DNA 比较电泳结果基本一致。
三、实验材料、试剂及主要器材
1. 实验材料
冷冻的新鲜动物肝脏。
2. 试剂
氯仿/异戊醇（24∶1）:异戊醇21 mL加入到500 mL的氯仿试剂瓶中，混匀；5 mol/L 碘化钾：（41.5克碘化钾溶于50 mL纯水中）；0. 9 % NaCl：4.5克NaCl溶于500 mL纯水中；无水乙醇。
3. 主要器材
台式高速(冷冻)离心机、移液器（10, 100，1000 μL），旋涡混合器、Eppendorf管等。
四、实验步骤
1. 取黄豆粒大小冷冻肝组织于EP管中（EP管上写上自己学号的最后两位数），有眼科剪捣碎；
2. 加50 μL 5 mol/ L KI，旋涡振荡30 s，静置3 min；
3. 加0. 9 % NaCl 375 μL，氯仿/异戊醇(24:1) 600 μL，充分振荡10 min，10 000 r/ min 离心5 min ；
4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇1000 μL，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；
5. 加冷无水乙醇1000 μL，12，000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37 ℃烘干约10 min）；以50 μL无菌双蒸水溶解DNA ，备用。
2. 加50 μL 5 mol/ L KI ，旋涡振荡30 s，将沉淀物混匀3 min；
3. 加0. 9 % NaCl 250 μL，氯仿/异戊醇(24∶1) 375 μL，充分振荡10 min ，10 000 r/ min 离心5 min ；
4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇（-20度）300 μL，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），-20度冰箱静置5 min后12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；
批阅教师：年月日
5. 加冷无水乙醇1000 μL，12，000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37℃烘干约10 min）；以50 μL无菌双蒸水溶解DNA ，备用。
五、思考题
1）在DNA 提取过程中乙醇的作用是什么？为什么用-20度预冷的乙醇效果更好？
2）实验所用的EP管和枪头等需要高温灭菌吗，为什么？
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业：学号：姓名：分数：实验八琼脂糖凝胶电泳技术――DNA样品检测
一、实验目的
学习与掌握琼脂糖凝胶电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量以及分子量，分离不同大小DNA片段。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。
三、试剂配制
1. 5×TBE：Tris 54g；硼酸27.5g；0.5 M EDTA（pH 8.0）20 mL；加双蒸水至1 L。用时5倍稀释。
2. EB：用水配制成10 mg/mL的贮存液，分装，避光，4℃保存（1g溴乙锭于100 mL水中）。
3. 6×加样buffer：0.25%溴酚蓝；40%（W/V）蔗糖；溶于水中，贮存于4℃。
四、实验操作
1. 胶模水平放置胶模。
2. 制胶量取200 mL 1×TBE 缓冲液倒入三角烧瓶中，称取1.6克琼脂糖加入，在微波炉上加热至全熔（清澈透明）。凝胶加热时间不宜过长，以免蒸干。
3. 倒胶用琼脂糖封好胶模，待凝胶冷至50℃左右时（手感容器能耐受），缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在3～5 mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。
4. 凝胶条件凝胶通常需要在室温中放置２0～30分钟。
5. 电泳缓冲液凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中（点样孔在负极），加入1×TBE电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1 mm。
6. 拔梳子小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整。
7. 点样用移液器取1-2 μL配制好的Loading Buffer，分别与需要电泳的样品或Marker混合(5-10 μL)，点样，记录点样次序。注意：每次电泳每块胶需留一孔点DNA marker。加样时Tip 头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的上方加样，样品会沉入孔内。
8. 电泳开启电泳仪电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源。电泳起始时需采用低压（80～100V），待电泳几分钟后溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中，可调整电压至200V恒压电泳，当溴芬兰接近胶的先端，停止电泳。
9. 观测将胶在溴化乙锭（EB）溶液中浸泡约10分钟后，在用凝胶成像仪积分成像后观察并拍照。
批阅教师：年月日
五、实验结果
DNA样品琼脂糖凝胶电泳检测图（在自己的点样孔上做上记号）。
六、思考题
1、如果实验成功了，请总结经验；如果实验失败了，请分析原因。
2、谈谈对生物化学实验的看法和建议。
孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料小麦面粉(1000 g) 2．主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2； 10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。 （5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年月日
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法； 2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容： 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理： ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3～4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇(-20℃），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50℃）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；制冰机；－20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min， 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min （条件：4℃、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min， 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。 （条件：4℃，12000r/min） ④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。 6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。 7. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1：1体积比加入样品处理液，在100℃加热5min以使蛋白质变性。 8. 浓缩胶聚合完全后（30-60 min），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 二、上样电泳 1. 按预定顺序加样，加样量通常为10～25μL。 电泳检测样品至少包括：蛋白Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。 2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。 3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色 染色时间：现温度下不少于2h。 脱色需3～10小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录，应尽快对凝胶进行拍照。 四、实验结果与讨论 1、质粒的提取、酶切电泳图谱 1 2 M 图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱 1：酶切后的质粒2：质粒M ：Marker 1、2：质粒4、5：酶切后质粒 观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱，可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面，并且质粒泳道条带比较多；电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很明显地观察结果。 原因分析：
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗
入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者：张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm 左右，且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸（pH1-14）烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀）RNA标准蛋白溶液（200μg/ml）
1.RNA的提取 （1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却； （2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min； （3）离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min； （4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min； （5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min； （6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。 2.RNA样液的配制 （1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。 （2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。 （3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 （1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。 （2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离 心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可， 防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；
生物化学实验安排 实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 3.苯环的黄色反应 Tyr + 浓硝酸黄色 Trp Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应： 检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。 5. 偶氮反应
偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。 6. 醋酸铅反应 ()↓ --→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。 （2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。 3. 苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9） 4. 乙醛酸的反应： 向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA 的提取 ②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒： 质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤： a 细菌培养使质粒大量扩增； b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ； c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA ： 在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ）， 使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310 装 订 线
专业：农业资源与环境 姓名：李佳怡 ____________ 学号：_J6 _______________ 日期： __________________ 地点：生物实验中心310课程名称：生物化学实验（丙） 实验名称：蔗糖酶的提取 一、实验目的和要求（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） .指导老师：方祥年 成绩:_ _同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、 巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 订 1、实验内容: 线 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ① 酵母细胞破碎 液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法 固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。 ② 蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告 细 胞 破碎 的 常 用 方 法
三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉10g/组（3?4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇（-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）：研碎（每组一套）：50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）：高速冷冻离心机：恒温水浴箱（50°C）；量筒（50ml）、微量移液枪（lOOOu 1）及枪头或移液管（1ml）、玻棒、滴管等;离心管（留样品I、II用）及离心管架：制冰机：一20°C冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨（干磨）：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液，分2次加研磨lOmin, 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后（托盘天平上），离心lOmin （条件:4°C、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上淸液并量出体积VI （样品I）,另留1ml上淸液（样品I ）放置一20°C冰箱保存 用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I）,迅速放入50°C恒温水浴，保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min a （条件：4°C, 12000r/min） ④收集+测量：收集上淸液并量出体积V2 （样品II）,另留1ml上淸液（样品II ）放宜一20°C冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理 （1）实验原理 1、离子交换层析： 以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 基质 基质 — ＋ — ＋ 可逆交换 可逆交换 溶液中的离子 （交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) 阳离 阴离子交
由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用 3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 （2）实验内容 1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ； 2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)； ②20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 ①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； ②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； ③掌握分光光度计的使用方法。 2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法； ②学习酶的比活力的计算。 二、实验内容和原理 1、Folin-酚测定法 Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L 。 优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。 缺点： 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。 专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.5. 26 地点： 生物实验中心310 装 订 线
细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚， 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应，生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多，使发 酵液的pH下降到以下，当加入甲基红试剂后，时发酵液变红色，为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗 糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 （一）V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物，分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中，加入与培养液等量的V-P试剂，充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 （二）甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中，分别加入2-3滴甲基红指示剂，立即观察培养液的颜色变化（三）吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面，此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 （四）糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 （一）V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———