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化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

一、材料与方法

1.实验材料

1.1实验材料

Hela细胞(宫颈癌细胞)、Eca-706细胞(食管癌细胞)、PC-12细胞(神经胶质瘤细胞)、53种化合物

1.2主要仪器

CO2恒温培养箱:力申HF151

生物安全柜:阿尔泰实验室设备(北京)有限公司BHC-1300ⅡA2

低速大容量离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司LC-4016

相差倒置显微镜:宁波舜宇仪器有限公司XD30

高端研究级倒置显微:德国蔡司Axio Observer A1

恒温水浴锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂H21-4

液氮罐:成都金凤液氮容器有限公司YDS-65-216

分析天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司BSA224S-CW

全光栅酶标仪:美国莫赛飞世尔Mμltiskan GO

调速多用振荡器:金坛市华峰仪器有限公司HY-4

KQ5200DB型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司

1.3主要试剂

表1

名称厂家货号/批号

PBS磷酸盐缓冲液粉剂北京中杉金桥ZLI-9062

胎牛血清美国Hyclone 16000-004,Lot#GM K0070 DMEM培养基(高糖)美国gibco 12800-017 ,Lot#1655697

0.25%胰酶美国gibco 25200-056, Lot#1627654

青霉素-链霉素双抗美国gibco 15140-122 ,Lot#1631430 MTT(噻唑蓝)美国sigma M-2128

DMSO(二甲基亚砜)美国sigma 67-68-5,Lot#67-68-5

CCK-8 上海贝博BB-4202-2,BB150011

2.实验方法

2.1试剂配制、抗体稀释及53种化合物的溶解

DMEM培养基:DMEM培养基粉末溶于1L经0.22μm孔径滤膜过滤后的超纯水中,用NaHCO3调PH值至7.2-7.6之间。

10%血清完全培养基:10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中,添加1ml的青-链霉素双抗溶液。

MTT溶液:称取150mgMTT,溶于30ml未过滤的PBS中,用0.22μm的滤膜过滤后待用。

53种化合物的浓溶液:10mg化合物加入200μl DMSO溶解,再加9.80 ml完全培养基配成终浓度为1mg/ml的化合物浓溶液(有些化合物200μl DMSO不能溶解,具体DMSO用量见结果与分析)。

冻存液:6ml无血清培养基中加入3ml胎牛血清和1ml DMSO(培养基:血清:

DMSO=6:3:1)。

2.2 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞培养基本操作方法

2.2.1细胞复苏

1、从液氮中取出冻存的细胞,立刻置于37℃水浴锅中快速晃动冻存管使细胞快速

解冻;

2、将细胞转移至15ml离心管中,1000rpm,6min离心后,弃培养基;

3、用DMEM完全培养基1ml重悬细胞,并接种到25ml培养瓶中;

4、显微镜下观察细胞密度合适并且无细胞聚团后,置于37℃,饱和湿度,5%CO2

细胞培养箱中培养。

2.2.2细胞传代

1、观察培养瓶中细胞贴壁融合达90%时,即可进行细胞的传代

2、开启生物安全柜紫外消毒30min,以75%乙醇擦拭台面灭菌,并预先准备细胞培

养瓶、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、DMEM完全培养基,

3、取出长满细胞的培养瓶,倒空瓶中的培养基,加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液

反复冲洗2遍,倒空PBS缓冲液,每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液,使胰酶溶液平铺在细胞层面上,缓缓摇动细胞培养瓶,待细胞70%脱落时加入1ml的DMEM 完全培养基终止胰酶的消化作用,并用1ml移液器反复冲洗培养瓶底将未脱落的细

胞冲洗下来,转移液体至15ml的离心管中,1800rpm离心5min,小心吸弃离心管中的液体,并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞,倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中于37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养。2.2.3细胞冻存

1、消化、离心步骤同细胞传代;

2、离心后弃去培养基,加入1ml的细胞冻存液重悬混匀后移至2ml的冻存管中;

3、冻存管中细胞经4℃(30min)、-20℃(30min)、-80℃(过夜)的程序降温后,

转移至液氮中冻存。

2.3 MTT法对53种化合物的筛查实验

2.3.1 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的接种

1、消化、离心、重悬的步骤同细胞传代;

2、取50μl细胞悬液用于细胞计数板进行计数,计数后调整细胞浓度至1 ×105

个/ml待用;

3、将细胞接种到96孔板中,接种Hela和PC-12细胞时每孔加50 μl细胞悬液(5000

个细胞/孔),接种Eca-706时每孔加100 μl细胞悬液(10000个细胞/孔),每

孔用完全培养基补加至200 μl,边缘孔用200μl无菌PBS进行填充。

4、将接种好的细胞放入37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养。

2.3.2 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的饥饿处理

1、显微镜下观察待96孔板中的细胞铺至孔底约50%时开始进行饥饿处理(其中

Hela和Eca-706细胞培养24h,PC-12细胞培养约65h);

2、具体操作步骤:先弃去96孔板中的DMEM完全培养基,用无菌PBS洗去残留

的培养基后,加入无血清的DMEM培养基,放入37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养。

2.3.3 对Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞分别进行化合物处理

1、进行饥饿处理24h以后,在显微镜下观察细胞的生长状态;

2、加入浓度梯度的化合物,每种化合物设置6个浓度梯度3个重复,所配化合物

原浓度为1mg/ml,设置的6个浓度梯度分别为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml;

3、阳性对照:顺铂(顺铂的6个浓度梯度同化合物相同)

空白对照:只加含化合物培养基

阴性对照:加完全培养基和细胞

4、37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养24h后,显微镜下观察不同化合物

对细胞的作用效果。

2.3.4 MTT检测

1、对上述化合物处理后的细胞每孔加入20μl MTT溶液(终浓度0.5mg/ml,即

0.5%MTT),继续放入37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中孵育;

2、孵育4h后,弃掉上清,每孔加入150 μl DMSO,并在调速多用振荡器上低速

震荡10min使结晶充分溶解(甲瓒);

3、酶标仪检测490nm吸光值,并记录数据。

2.3.5 利用CCK-8做出Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的生长曲线

1、接种细胞:

Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的分别接种4000个/孔、5000个/孔、5000个/孔,每组5个重复,共8个时间点,每孔用完全培养基补至200μl体系,放

入37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养24h。

2、饥饿处理

接种细胞培养24h后,饥饿处理24h,之后更换完全培养基,开始计时0h;

3、分别在1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h加入cck-8 20μl进行检测(加

入CCK-8后3h分别检测450nm波长吸光值),并记录数据。

二、结果与分析

1、化合物的溶解情况

1.1 化合物溶解方法

化合物使用含有1/ 50 DMSO的完全培养基来溶解,对不溶或溶解不完全的化合物加大DMSO用量溶解,DMSO的使用情况见表2:

表2:

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

1.2 药物溶解后的状态统计见表

3

表3

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

2、Hela 细胞、Eca-706

细胞、PC-12细胞化合物处理

Eca-706、PC-12、Hela

细胞经化合物处理前后分别在50倍下显微镜下观察,化合物处理前细胞分布均匀,形态均一;化合物处理后,与阴性对照组对比,部分化合物组细胞形态随着浓度梯度的增加,悬浮细胞数目增加,孔内整体细胞数目减少。

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

3、化合物对不同肿瘤细胞的IC50

3.1 hela 细胞

不同化合物对hela细胞的IC50(浓度单位:μg/ml)

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

不同化合物对PC-12细胞的IC50(浓度单位:μg/ml)

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

不同化合物对Eca-706细胞的IC50(浓度单位:μg/ml)

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

注:红色字体:超出药物筛选最大浓度(>20 μg/ml),绿色字体:低于药物筛选最小的浓度(<0.625 μg/ml)。

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