中国环境科学 2012,32(7)：1293~1301 China Environmental Science 内蒙古高原干涸湖泊反硝化及甲烷氧化细菌的群落分析白玉涛1,周玉2,赵吉2*(1.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021；2.内蒙古大学环境与资源学院,内蒙古呼和浩特 010021)
摘要：以内蒙古高原半干旱草原区干涸湖泊为研究对象,应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术对湿地土壤中的反硝化和甲烷氧化关联菌群的关键功能基因nosZ和pmoA进行了研究,根据末端限制性片段(T-RFs)分析了两种菌群的群落结构及多样性变化,以及环境因素所产生的影响,并探讨了土壤微生物群落对湖泊干涸的响应机制.结果表明:干涸湖泊的湖心、湖底土壤反硝化和甲烷氧化细菌多样性指数较高,群落结构较复杂;而较早干涸的湖坡以及相邻草原对照区,两个菌群多样性指数较低,群落结构相对单一.从湖心到相邻草原,反硝化和甲烷氧化细菌的群落相似度逐渐降低,显示两个菌群处于动态演替中.湖泊干涸过程中,水分含量和有机质含量对反硝化和甲烷氧化细菌的群落结构影响显著;高pH值和高铵态氮分别对反硝化和甲烷氧化细菌有抑制作用.随着湖泊干涸,土壤微生物群落因环境扰动而受到胁迫,这一过程会加剧CO2等温室气体的排放.
关键词：反硝化细菌；甲烷氧化细菌；末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术；干涸湖泊；草原湿地
中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2012)07-1293-09
Community structures of denitrifying bacteria and methanotrophs in wetland soils of dry-up lake in the Inner Mongolia Plateau. BAI Yu-tao1, ZHOU Yu2, ZHAO Ji 2* (1.College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China；2.College of Environment and R esources, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China). China Environmental Science,2012,32(7)：1293~1301
Abstract：The method of terminal restriction fragment length polymorphism (T-R FLP) was used to study the community structures and diversities of denitrifying bacteria and aerobic methanotrophs by two key functional genes nosZ and pmoA in the wetland soils of dry-up lake in the Inner Mongolia Plateau. And the effects of soil factors on them were also evaluated, then the mechanism of microbiological communities in wetland soils response to the dry-up lake were discussed. The results showed that the diversity indices of denitrifying bacteria and aerobic methanotrophs were higher, and community structures appeared more complicated at the later dry-up plots. The opposite results were shown at the earlier dry-up plot and the adjacent steppe. Their similarity coefficients gradually declined from the middle of the lake to the adjacent steppe, indicating communities dynamic succession. During drying process, soil moisture and organic matter content had significant influence on both of them. In addition, high pH value and high NH4+-N had inhibitory effects on denitrifying bacteria and the aerobic methanotrophs, respectively. The microbial communities were under the stress of dry-up process, which led to more emission of carbon dioxide and other greenhouse-gas from wetland soils.
Key words：denitrifying bacteria；methanotrophs；T-RFLP；dry-up lake；steppe wetland
N2O和CH4都是重要的痕量温室气体,对全球变暖的贡献仅次于CO2,而其增温潜势却分别是CO2的296倍和23倍[1],土壤则是这两种气体重要的源与汇.土壤反硝化细菌和甲烷氧化细菌是控制N2O和CH4释放的关键菌群.反硝化细菌在呼吸作用中以硝酸作为电子受体,把硝酸依次还原为亚硝酸、一氧化氮、一氧化二氮和氮气,是N2O产生的主要过程[2-3].nosZ基因编码一氧化二氮还原酶的催化亚基,该酶能将N2O还原成N2.甲烷氧化细菌利用甲烷作为唯一碳源和能源,通过收稿日期：2011-11-09
基金项目：国家“973”项目(2009CB125909);国家自然科学基金资助项目(31160129);内蒙古大学‘211工程’创新人才培养项目
* 责任作者, 教授, ndzj@https://www.doczj.com/doc/904527186.html,
1294 中国环境科学 32卷
逐步氧化甲烷获得生长所需的能量.甲烷氧化过程一方面释放有机产物,如甲醇等,可被反硝化细菌利用,另一方面消耗氧为反硝化作用提供缺氧环境[4].pmoA基因编码颗粒性甲烷单加氧酶的最保守亚基,该酶能将CH4氧化成CH3OH,存在于除Methylocella silvestris以外的所有甲烷氧化菌中[5],普遍用于环境中甲烷氧化菌的检测.
目前,对农田[6-7],森林[8-9],湿地[10-11]等土壤的反硝化和甲烷氧化菌研究较多,而对干涸的退化湖泊研究很少见报道. 末端标记限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术因具有灵敏度高、工作量较少、重复性高[12]的特点在研究微生物群落结构中得到越来越多的应用.本研究旨在应用T-RFLP 技术研究反硝化和甲烷氧化细菌群落组成和多样性及其与土壤环境因素之间的内在联系,以此来掌握二者的分布特点,为退化湖泊湿地的综合治理和恢复及人工湿地的构建提供科学依据.
1材料与方法
1.1样品采集与处理
研究区(112°33′~112°42′E, 41°05′~41°12′N)位于内蒙古半干旱草原区辉腾锡勒草原九十九泉湿地,乌兰察布市察右中旗中南部,近年来逐步退水已成为干涸的湖泊.研究区属典型的温带大陆型气候,年平均气温为-1.3,℃最低气温-39.9,℃最高气温28.2,℃年平均降水量385mm,无霜期100d,土壤以栗钙土为主.土壤样品的采集按照地表植被群落变化,选取有代表性的处于不同群落演替阶段的样点为研究对象(图1):S1样点位于湖中心,地上植物仅有碱茅(Puccinellia distans)、蓼(Polygonum spp.)、雾冰藜(Bassia dasyphylla);S2样点位于湖底,植物主要为海乳草(Glaux maritima)、苔草(Carex spp.);S3样点位于湖坡,主要种类为鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)、针蔺(Eleocharis vallcculosa)、苔草、海乳草;S4位于临近该湖的典型草原,主要植被为羊草(Leym u s chinensis)、大针茅(Stipa grandis)、星毛委陵菜(Potentilla acaulis)、洽草(Koeleria cristata)等.采用S型五点取样法,取样深度为0~10cm.将土样充分混匀后过2mm筛,保鲜带回实验室冷藏保存,用于分子生物学研究.土壤理化性质数据和土壤呼吸数据由本实验室测定分析(表1).
草原
湖坡
湖底湖心
S4
S3
S2
S1
图1 样点分布
Fig.1 Distribution map of the sampling plots
S1:湖心样点S2:湖底样点S3:湖坡样点S4:草原样点
1.2土壤总DNA的提取
依据Li等[13]提出的玻璃珠-氯化钙-SDS法,对土壤样品进行总DNA的提取,并对产物纯度进行测定.
表1部分土壤理化性质及生物学活性
Table 1 Partial physical and chemical properties of the soil samples and biological activity
1.3功能基因的PCR扩增
nosZ基因的巢式PCR扩增:第一步扩增引物为nosZ-F:5′-CGY TGT TCM TCG ACA GCC AG-3′,nosZ-R:5′-CAT GTG CAG NGC RTG GCA GAA-3′,扩增条件参照文献[14];第二步扩增引物为nosZ-F(5′-Cy5标记,上海生工生物工
样点有机质
(g/kg)
全磷
(g/kg)
全氮
(g/kg)
铵态氮
(mg/kg)
硝态氮
(mg/kg)
pH
值
含水率
(%)
微生物生物量碳
(mg/kg)
微生物生物量氮
(mg/kg)
基础呼吸
[mg/(g?h)]
诱导呼吸
[mg/(g?h)]
S1 114.84 0.90 11.56 1.18 7.54 9.69 33.33461.53 111.28 127.58 542.11 S2 96.65 1.01 6.93 1.00 3.61 9.33 21.26387.79 117.63 117.00 396.48 S3 84.74 1.04 7.35 1.12 1.94 8.54 17.51661.64 171.52 62.63 432.36 S4 120.62 1.05 11.71 2.31 3.19 7.96 20.95897.45 200.60 42.91 147.90
7期白玉涛等：内蒙古高原干涸湖泊反硝化及甲烷氧化细菌的群落分析 1295
程有限公司),nosZ 1622R:5′-CGS ACC TTS TTG CCS TYG CG-3′,扩增条件参照文献[15],退火温度为58℃.每个样品做3个重复.pmoA基因的巢式PCR扩增:第一步扩增引物为A189: 5′-GGN GAC TGG GAC TTC TGG-3′,A682: 5′-GAA SGC NGA GAA GAA SGC-3′,扩增条件参照文献[16];第二步扩增引物为A189(5′-Cy5标记,上海生工生物工程有限公司),mb661: 5′-CCG GM G CAA CGT CYT TAC C-3′[17],扩增条件为:95℃预变性3min,95℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸40s,30个循环,72 ℃终延伸10min.每个样品做3个重复.PCR扩增反应仪:Eppendorf Mastercycler.扩增产物用DNA纯化回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司,北京全式金生物技术有限公司)纯化.
1.4限制性酶切与纯化
从GenBank中得到部分的nosZ和pmoA基因序列,通过DNAstar 7.1软件分析发现HhaⅠ限制性内切酶对序列切割可产生很好的多态性.用HhaⅠ对NosZ基因的纯化PCR产物进行酶切反应,反应体系为:7μLPCR产物,2μL10×buffer,10U 内切酶(TaKaRa),加ddH2O至20μL. 37℃酶切4h.pmoA基因的纯化PCR产物使用AluⅠ和HhaⅠ双酶切,反应体系为:15μLPCR产物,2μL 10×buffer,两种内切酶各5U(TaKaRa),加ddH2O 至20μL,37℃酶切4h.
在酶切产物中加入1μLglycogen (20 mg/mL, Beckman Coulter, USA),2μLNa2Ac(3mol/L),2.5倍体积的95% 冰乙醇,14,000r/min离心10min.弃上清,加100μL 70% 冰乙醇,14,000r/min离心5min,弃上清,自然干燥后加入40μL 甲酰胺(Beckman Coulter, USA),溶解备用.
1.5限制性片段的毛细管电泳
取制备好的样品39.5μL,再加入0.5μL Size Standard-600内标(Beckman Coulter, USA),混匀后转移到96孔板中,使用GenomeLab GeXP遗传分析系统(Beckman Coulter, USA)进行毛细管电泳,电压为4.8kV,时间为60min.
1.6群落及多样性分析
使用GeXP Fragment Analyse软件分析毛细管电泳结果.除去荧光信号值小于1,000RFU的峰,并
选取在3个重复中反复出现的峰,这里粗略认为每
个峰代表1个OTU(操作分类单元, Operational Taxonomic Unit).多样性采用如下指数计算:
基因的丰富度指数:S=T-RFs的个数;
Shannon-Weiner(H')指数:
H'= -∑(P i)(log2P i) (1) 均匀性指数:E=H/H max
式中: H max=log2(S).
辛普森优势度指数:D=1-∑P i2
式中: P i表示某个峰的峰面积占该样点所有峰
的总面积的比例;T-RF表示末端限制性片
段,bp.
对T-RFLP结果计算Bray-Curtis相似系数,
并根据结果进行等级聚类分析(PRIM ER 5.2.9),
对环境数据进行Z-score标准化处理,转变成无
量纲的数据(SPSS 13.0),环境因子对T-RFs分布
的影响进行典型对应分析(CCA, Canoco for Windows 4.5)和主成分分析(PCA, Canoco for Windows 4.5).
2结果与分析
2.1干涸湖泊湿地功能微生物的群落特征
2.1.1反硝化细菌群落分布特征及多样性对
于反硝化细菌的NosZ基因,322bp、427bp、448bp
为样点S1、S2中共有优势T-RFs,在S1中相对
丰度分别为8.1%、6.2%、7.0%,在S2中分别为
6.0%、15.2%、14.1%,但在S3、S4中不存在;355bp
在S3、S4中为优势T-RFs,相对丰度分别为
11.8%、30.1%,而在S1、S2中不存在.S2、S3之
间没有共有的优势T-RFs.反硝化细菌的多样性
指数如表2.从S1到S4多样性指数(除丰富度指
数S4大于S3外)和均匀性指数呈现从高向低的
变化趋势.样点S1的反硝化细菌多样性高,分布
均匀,但优势种类不明显,群落结构较复杂.S2的
优势种类与S1相似,但相对丰度较高,较为明
显;S3 优势种类较S2发生很大变化,并且群落多
样性较低,均匀性下降.在S4中,355bp相对丰度
高达30.1%,群落结构更加单一,群落多样性和均
匀性最低.
1296 中国环境科学 32卷
表2反硝化细菌的多样性指数
Table 2 Diversity indexes of the denitrifying bacteria at
different plots
样点丰富度
指数
Shannon-Weiner
指数
辛普森
指数
均匀性
指数
S1 22 4.21 0.94 0.94
S2 15 3.55 0.89 0.91
S3 12 3.20 0.87 0.89
S4 14 2.85 0.77 0.75 2.1.2甲烷氧化细菌群落分布特征及多样性对于甲烷氧化细菌的pmoA基因,95bp为样点S1、S2、S3共有优势T-RFs,相对丰度分别为26.4%、16.9%、41.9%,但在S4即草原样点没有分布.457bp是S2的另一优势T-RFs(17.8%),也是该样点的特有T-RFs.131bp是S3的另一个优势T-RFs(35.4%).82bp、89bp是S4的优势T-RFs (47.4%、38.0%).S4的其余T-RFs的相对丰度都很低(小于1%).多样性指数见表3.甲烷氧化细菌的多样性指数在S1、S2较高(除丰富度指数S4高于S2外),在S3、S4较低;S2的均匀度指数略高于S1,样点S3、S4均匀度指数均低于S1、S2.
可以看出,反硝化细菌和甲烷氧化细菌在样点S1、S2的多样性和均匀性均高于S3、S4,而样点S3、S4优势种类更明显,群落结构相对单一.
表3甲烷氧化菌的多样性指数
Table 3 Diversity indexes of the methanotrophs at
different plots
样点丰富度
指数
Shannon-Weiner
指数
辛普森
指数
均匀性
指数
S1 25 4.02 0.90 0.87
S2 18 3.85 0.91 0.92
S3 6 1.88 0.68 0.73
S4 22 2.02 0.63 0.45 2.2干涸湖泊湿地功能微生物群落结构的相似性分析
2.2.1反硝化细菌群落结构的相似性 Bray-Curtis相似系数矩阵及等级聚类结果如表4和图2所示,对于反硝化细菌,样点S1和S2之间相似系数最大,S1和S4之间相似系数最小;S3和S4间相似系数大于S3和S2间相似系数.结合前面的分析可知,S1与S2之间反硝化细菌群落相似度较高;S2与S3之间相似系数很小,并且与S2相比,S3反硝化细菌群落优势种类发生明显变化,群落结构间断性明显.样点S3更趋近于S4,说明
S3反硝化细菌群落开始向草原反硝化细菌群落演化.草原土壤样点S4与湖底土壤样点S1相比二者差异最大.
2.2.2甲烷氧化细菌群落结构的相似性结果如表5和图3所示,对于甲烷氧化菌,样点S1和
S2之间相似系数最大,样点S2与S3、S3与S4之间相似系数相近且很小.与反硝化细菌类似,甲烷氧化菌在S1和S2之间群落相似度高,群落分布连续性较强,S1的很多T-RFs在S2均有分布,并且相对丰度提高,部分种类在S2消失.对于样点S3,存在于S1、S2的种类大部分消失,且S3与S4无共有的优势T-RFs,说明样点S3甲烷氧化细菌群落既不同于S2也不同于S4.
表4样点间反硝化细菌群落的Bray-Curtis相似性矩阵Table 4 Bray-Curtis similarity matrix of the denitrifying
bacteria between different plots
样点S1 S2 S3 S4
S1 44.54 18.68 18.67 S2 44.54 24.55 27.48 S3 18.68 24.55 29.17 S4 18.67 27.48 29.17
表5样点间甲烷氧化菌群落的Bray-Curtis相似性矩阵Table 5 Bray-Curtis similarity matrix of the
methanotrophs between different plots
样点S1 S2 S3 S4
S1 60.64 40.28 26.36
S2 60.64 21.91 15.61
S3 40.28 21.91 21.40
S4 26.36 15.61 21.40
综上可知,由样点S1到S4反硝化细菌和甲烷氧化细菌样点间群落相似度逐渐降低,说明这两个菌群经历了由适应水生环境向适应陆生环境的演变,处于动态演替中.
7期
白玉涛等：内蒙古高原干涸湖泊反硝化及甲烷氧化细菌的群落分析 1297
S1 S2S3
S4100
80 60 40 20 相似性
图2 各样点反硝化细菌群落的等级聚类分析 Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of the
denitrifying bacteria from different plots
S4 S3
S1
S2
100
80 60 40 20 相似性
图3 各样点甲烷氧化细菌群落的等级聚类分析 Fig.3 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of the
methanotrophs from different plots
2.3 环境因子对群落结构的影响
2.3.1 对反硝化细菌的影响 CCA 分析结果如图4所示.第一排序轴、第二排序轴、第三排序轴(未在图中显示)解释度分别为43%、35%、22%.与第一轴相关性高的为基础呼吸(-0.9772)、pH 值(-0.9374)、生物量碳(0.9335)和生物量氮(0.9723).与第二轴相关性高的为有机质(0.9277)、铵态氮(0.7764);与第三轴相关性高的为水分(-0.872).S1、S2与第三轴相关性较高(-0.79、0.85),S3、S4与第二轴相关性较高(-0.71、0.87).第一轴与4个样点相关值分别为-0.61、-0.50、0.69、0.48.
样点S1反硝化细菌多样性最高、均匀性好,主要原因是土壤含水量和硝酸盐含量高,部分细菌为生存而进行硝酸盐呼吸:以硝酸盐、亚硝酸盐、NO 等代替氧作为电子受体,同时降解有机物,为自身提供量.在样点S1中74bp 、87bp 、290bp 和425bp 为优势T -RFs,而在样点S2中相对丰度很低或消失,原因在于样点S2土壤含水量较S1大幅降低,一些适应高水分环境的反硝化细菌不能在样点S2很好发展,导致多样性和均匀性低于
样点S1.样点S3有机质含量较其他3个样点最低,很多反硝化细菌因缺乏可利用有机物而不能生存;样点S4为草原土壤,有机质含量高,来源丰富,土壤pH 值中性偏碱,形成了不同于湖底样点的反硝化细菌群落.285bp 和355bp 在S1、S2中不存在,在S4中相对丰度达到12.2%和30.1%,是草原样点S4反硝化细菌的代表.
-0.60.8 -1.0
1.0
54bp 56bp 68bp 70bp
72bp 74bp 76bp 85bp
87bp 90bp 94bp 128bp 143bp 145bp 148bp 202bp 205bp 209bp 236bp
251bp 256bp
262bp 266bp 285bp 288bp 290bp 316bp 318bp 320bp 322bp 324bp 342bp 352bp 355bp
406bp 416bp 418bp
425bp 427bp 432bp 435bp 448bp 450bp 453bp 123
4 Axis 1
Axis 2
图4 反硝化细菌群落与环境因子的典型对应分析
(CCA)
Fig.4 Canonical correspondence analysis biplot of the denitrifying bacterial communities in relation to the
environmental factors by T -RFLP
SOM,土壤有机质;SWC,土壤含水量;SMBC,微生物生物量碳;SMBN,微生物生物量氮;NH 4+-N,铵态氮;NO 3-
-N,硝态氮;BR,基础呼吸;
PR,潜在呼吸(诱导呼吸),下同
土壤呼吸是描述土壤微生物群落总体活性
的生物指标,微生物生物量碳氮是描述土壤微生物总体量的指标,二者能敏感地反映出土壤质量和环境变化[18].从CCA 结果看,土壤pH 值与基础呼吸强度相关值为0.98,表明土壤pH 值对土壤微生物群落总体活性有影响.样点S1、S2土壤碱
1298 中国环境科学 32卷
性较强,微生物基础呼吸(BR)较高,微生物生物量碳(SMBC)较低,呼吸商(BR/SMBC)高,生物能量的利用效率低,显示微生物整体处于环境胁迫效应下[18].在样点S3、S4,土壤中性偏碱,微生物总体表现为基础呼吸低,生物量碳高,呼吸商低,表明总体微生物群落在此环境中是受益的[18].样点S1没有明显突出的优势反硝化细菌,说明过高的pH值对反硝化细菌产生普遍影响,优势种类难以得到很好发展.从样点S2到S4,土壤pH值逐渐降低,影响逐渐变小.
2.3.2对甲烷氧化细菌的影响PCA分析结果如图5所示.第一排序轴、第二排序轴、第三排序轴(未在图中显示)解释度分别为0.613,0.328, 0.059,与第一排序轴相关性高的为铵态氮(0.9717),诱导呼吸的强度(-0.8692),与第二排序轴相关性高的为微生物生物量氮(0.7109),基础呼吸(-0.7434),与第三排序轴相关性高的为土壤含水量(0.8848)、硝态氮(0.8522).
1.0
-1.0
Axis 1
图5 甲烷氧化菌群落与环境因子的主成分分析
Fig.5 principal component analysis biplot of the
methanotrophs in relation to the environmental
factors by T-RFLP
样点S1最接近第三轴(0.9437),影响其群落分布的主要因子是土壤含水量(0.9694)、硝态氮(0.9564),说明S1的甲烷氧化菌适应高含水量和高硝态氮含量的土壤环境.样点S2最接近第二轴(-0.7374)和第三轴(-0.6190),影响其群落分布的主要因子是C/N比(0.9271).与S1相比,S2的C/N 比明显升高,对土壤微生物的活动能力有一定的限制作用,使有机质和有机氮分解矿化速度减慢[19].但高C/N比有易于土壤对CH4的吸收[20].样点S3最接近第二轴(0.8271),影响其群落分布的主要因子是有机质(-0.7859).在样点S3土壤微生物的诱导呼吸强度与基础呼吸强度差值很大,可见原因是土壤中可利用的碳源匮乏,导致微生物基础呼吸强度较弱,向土壤中加入易分解的有机物(如葡萄糖)进行诱导,微生物的呼吸量能迅速增加[18].与反硝化细菌相似,样点S3土壤低有机质含量限制了甲烷氧化菌的生存,造成该点甲烷氧化菌的多样性最低.样点S4最接近第一轴(0.9781),影响甲烷氧化细菌群落的主要因子是铵态氮(0.9926)、诱导呼吸的强度(-0.9282)和基础呼吸的强度(-0.7226).高浓度的NH4+会对大部分甲烷氧化菌氧化CH4产生抑制作用,所以该样点甲烷氧化细菌多样性很低.比较典型的是95bp 代表的甲烷氧化菌在S1、S2、S3均为优势T-RFs,但在S4中消失,原因就是NH4+对其抑制强烈.样点S1、S2土壤铵态氮含量低是甲烷氧化菌多样性高于S4的原因之一.
3讨论
Wallenstein等[21]认为土壤反硝化细菌群落结构最终由可利用C源、pH值、以及水分/氧含量决定,但是目前的研究还很难分别解释单个因子对群落的影响.Liu等[22]发现硝酸盐浓度和氧含量是影响反硝化细菌群落的重要因素.就本研究来看,干涸湖底土壤环境特殊,高含水量高硝酸盐含量是造成湖底反硝化细菌群落多样性高的最主要原因.高pH值对微生物总体活性产生胁迫,同样对反硝化细菌产生抑制.目前大多数研究认为反硝化速率发生的最佳pH值为中性偏碱,约在7.0~8.0,低pH值会对N2O还原酶产生抑制[23-25].pH值过高亚硝酸还原酶受到抑制[26],反
7期白玉涛等：内蒙古高原干涸湖泊反硝化及甲烷氧化细菌的群落分析 1299
硝化速率下降.
异养反硝化细菌进行反硝化作用时以有机碳源作为电子供体,所以土壤中可利用有机碳源的量是影响反硝化细菌群落的又一重要因素[27].样点S3有机质含量最低,原因是S3较S1、S2土壤退水时间早,微生物有氧分解更强烈,可利用有机碳源消耗更多,限制了异养反硝化细菌的反硝化活动.与湖底样点S1相比,草原样点S4土壤有机质来源不同,营养成分存在差别,这可能是影响S4反硝化细菌群落的主因.
土壤中主要存在两类甲烷氧化菌,这两类甲烷氧化菌在自然湿地中的生态位各不相同[28-31]. 土壤含水量是影响CH4氧化的重要因素,过高的含水量阻碍了CH4和O2的扩散,限制甲烷氧化菌的活动[29].本研究中样点S1土壤含水量很高,造成低氧环境,该点甲烷氧化菌适宜生长在低氧、高甲烷浓度的生境[31],对CH4的亲和力较低,其临界浓度较高,主要存在于湿地和稻田土壤中,以土壤内部产生的高浓度CH4为底物[30];样点S4土壤中的甲烷氧化菌较适宜生长在高氧、低甲烷浓度以及富营养的环境[28],对CH4的亲和力较高,主要存在于旱地土壤中[29],其氧化CH4的临界浓度通常小于大气CH4的浓度,靠消耗大气CH4为生[30].随着湖泊的退水干涸,从S2到S3土壤含水量明显降低,主要存在于湿地中的甲烷氧化菌逐渐消失并被主要存在于旱地土壤中甲烷氧化菌替代.在样点S3,大部分甲烷氧化菌消失,而适宜较干旱土壤的甲烷氧化菌尚未大量入侵,是造成多样性偏低的原因之一.
NH4+是土壤CH4氧化的主要抑制剂.大量研究表明,NH4+对甲烷氧化细菌的抑制是普遍存在的[32],由于NH4+和CH4竞争甲烷氧化酶系统相同的位点,抑制作用很可能涉及到酶基质的竞争或减少甲烷氧化酶的有效性[33-34],还可能源于过量NH4+对酶合成或对甲烷氧化细菌生长的抑制[34].在本研究中,82bp、89bp T-RFs代表的甲烷氧化细菌在样点S4中为优势菌,可能对NH4+不敏感.一些研究者发现在云杉林[35]、泥炭土[35]中NH4+对土壤CH4氧化没有抑制,证明存在对NH4+不敏感的甲烷氧化细菌.NO3-对甲烷氧化细菌的抑制作用不明显,有报道称有的甲烷氧化细菌能够利用NO3-[4],本研究中存在于S1的部分甲烷氧化细菌在S2消失,可能就是该类甲烷氧化细菌.
此外,甲烷氧化细菌群落的变化与pH值关系不明显.根据Bender等[36]的研究,可能是因为生活在土壤微小团粒中的甲烷氧化细菌可在其周围形成pH值或O2的梯度.土壤的pH值并不能完全反映微生物活动所处的环境条件.无论土壤pH值为多少,细胞内的pH值应接近中性,并能在酶水平上调控各种比率[37].这可能是甲烷氧化细菌对pH值变化不敏感的重要原因.
好氧甲烷氧化细菌在氧化甲烷时产生的一系列中间产物:甲醇、甲醛、甲酸盐以及甲烷氧化的中间体,能够被异养反硝化细菌利用,作为还原硝酸盐的电子供体(好氧甲烷氧化耦合反硝化, AME-D),同时消耗氧为反硝化造成缺氧环境[4,38],所以甲烷氧化对反硝化有促进作用,并且较低的C/N比有益于AME-D过程[38].样点S1不仅土壤含水量高,C/N比也较其他样点低,该样点应该存在较强的AME-D作用.
从土壤微生物整体来看,随着湖泊湿地退水干涸,原本处于水生环境下的微生物群落逐渐过渡到陆生环境,因环境变动受到胁迫,需要消耗更多有机能源维持生存,表现为样点S1、S2微生物基础呼吸较高,微生物生物量碳较低,呼吸商高,生物能量的利用效率低.这一过程会加剧CO2等温室气体的排放.
4结论
4.1 从湖泊湿地样点S1到样点S3,反硝化细菌和甲烷氧化细菌的多样性逐渐由高变低;两个菌群的群落结构组成从复杂多变到单一集中;湖泊样点S1到S3湿地土壤环境不稳定,对反硝化细菌和甲烷氧化细菌群落有扰动;草原对照样点S4土壤环境相对稳定,优势种类较为明显.
4.2环境因子中对两个菌群分布有重要影响的因素为土壤含水量和有机质:从样点S1到S3随着土壤含水量和有机质逐渐降低,反硝化细菌和甲烷氧化细菌群落处于陆向演替中.高pH值使土壤微生物群落总体受到胁迫,对反硝化细菌有
1300 中国环境科学 32卷
一定的抑制,而对甲烷氧化细菌未见抑制.高铵态氮对甲烷氧化过程有抑制作用,从而降低了甲烷氧化细菌的多样性.
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作者简介：白玉涛(1986-),男,内蒙古大学生命科学学院硕士研究生,主要从事环境微生物方向研究.
2012年7月1日将强制执行最新饮用水标准
生活饮用水卫生标准是从保护人群身体健康和保证人类生活质量出发,对饮用水中与人群健康的各种因素(物理、化学和生物),以法律形式作的量值规定,以及为实现量值所作的有关行为规范的规定,经国家有关部门批准,以一定形式发布的法定卫生标准.2006年底,卫生部会同各有关部门完成了对1985年版《生活饮用水卫生标准》的修订工作,并正式颁布了新版《生活饮用水卫生标准》,规定自2012年7月1日起全面实施.
新国标特点:一是加强了对水质有机物、微生物和水质消毒等方面的要求,新标准中的饮用水水质指标由原标准的35项增至106项.二是统一了城镇和农村饮用水卫生标准.三是基本实现了饮用水标准与国际接轨.
新标准水质项目和指标值的选择,充分考虑了我国实际情况,并参考了世界卫生组织的《饮用水水质准则》,参考了欧盟、美国、俄罗斯和日本等国饮用水标准.
1985年出台的《生活饮用水卫生标准》里,饮用水浑浊度的指标是“3~5”,新《标准》则将之提高到“1~3”,也就是说,公众最直观能感受到的,是水色将更为清亮.
在新《标准》增加的71项水质指标里,微生物学指标由2项增至6项,增加了对蓝氏贾第虫、隐孢子虫等易引起腹痛等肠道疾病、一般消毒方法很难全部杀死的微生物检测.饮用水消毒剂由1项增至4项,毒理学指标中无机化合物由10项增至22项,增加了对净化水质时产生二氯乙酸等卤代有机物质、存于水中藻类植物微囊藻毒素等的检测.有机化合物由5项增至53项,感官性状和一般理化指标由15项增加至21项.并且,还对原标准35项指标中的8项进行了修订.
同时,鉴于加氯消毒方式对水质安全的负面影响,新《标准》还在水处理工艺上重新考虑安全加氯对供水安全的影响,增加了与此相关的检测项目.新《标准》适用于各类集中式供水的生活饮用水,也适用于分散式供水的生活饮用水.
摘自《中国环境报》
2012-05-22
MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌 1实验原理 最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。 特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。 氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。 硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。 这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。 反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。 2实验材料 2.1样品 （1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，
产甲烷菌的研究进展 XXX 生物工程一班生命科学学院xxx大学150080 摘要：甲烷菌是一个古老的原生菌。随亨格特（Hungate）无氧分离技术发展以来，人们对甲烷菌的研究逐渐深入。从产甲烷菌生存环境分离、筛选出新的产甲烷菌种。20世纪90年代对甲烷菌的探讨、研究比较多，近10年的研究比较少。简述了产甲烷菌的发展历史及分类。产甲烷菌是重要的环境微生物,是古细菌的一种，在自然界的破素循环中起重要作用。迄今已有种产甲烷菌基因组测序完成。基因组信息使人们对产甲烷菌的细胞结构、进化、代谢及环境适应性有了更深的理解。 关键词：微生物，产甲烷菌，分类。 Research progress of methanogenic bacteria Zhengzongqiao The first class of Biotechnology, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin, 150080 Abstract: methanogens is an ancient native bacteria. With the Since Heng Gete (Hungate) anaerobic separation technology development, people gradually in-depth study of methanogens. Living environment separated from the methane-producing bacteria filter out new methane-producing bacteria. Of methanogens in the 1990s, research more, nearly 10 years of study is relatively small. The brief history of the development of the methanogenic bacteria and classification. Methane-producing bacteria is an important environmental microorganisms, is a kind of archaebacteria, play an important role in the hormone cycle of the nature of the broken. So far has been a kind of methane-producing bacteria genome sequencing is completed. Genomic information to make The Methanogens the cell structure, evolution, have a deeper understanding of metabolic and environmental adaptability. Keywords: microorganisms, methane-producing bacteria。 1.产甲烷菌的介绍 产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌,它们生活在各种自然环境下,甚至在一些极端环境中。产甲烷菌是厌氧发酵过程的最后一个成员,甲烷的生物合成是自然界碳素循环的关键链条。由于产甲烷菌在有机废弃物处理、沼气发酵、动物瘤胃中有机物分解利用等过程中的重要作用,同时甲烷是导致全球变暖的第二大温室气体,因此产甲烷菌和甲烷产生机理的研究备受关注。特别是近几年对产甲烷菌基因组的研究,使人们从全基因组的角度、进化的角度对甲烷生物的合成机理、甲烷菌的生活习性、结构特点等方面获得更深刻的理解。产甲烷菌的分类：Schnellen第一个从消化污泥中分离纯化得到。19 74年Bryant首次提出了产甲烷菌(M讼tha n昭甘n)一词,将其与以甲烷为能量来源的嗜甲烷菌(MethanotrDPh,)区分开来。到目前为止,分离鉴定的产甲烷菌已有2 00多种。它们存在于沼泽、湖泊、海洋沉积物及瘤胃动物的胃液等自然生态系统中,也存在于废水处理、堆肥和污泥消化等非自然的生态系统中。从分类学上讲,产甲烷菌属于古细菌的水生古细菌门(EUrya rchaeo-ta),
反硝化作用与反硝化菌2020 一、反硝化作用： 反硝化作用一般指在缺氧条件下，反硝化菌将（硝化反应过程中产生的）硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气的过程。 在反硝化过程中，有机物作为电子供体，硝酸盐为电子受体，在电子传递过程中，有机物失去电子被氧化，硝酸盐得到电子被还原，实现在反硝化过程对硝态氮和COD的脱除。理论上，1g硝态氮的全程反硝化需要硝化2.86g有机碳源（以BOD计）。对生化处理中反硝化进水，可以考察其可生化性（BOD/COD）和含量（BOD/TN比例），以判断有机物碳源是否适宜并足够系统用于反硝化脱氮。 影响污水生物脱氮过程中反硝化作用的主要因素包括：溶解氧、pH值、温度、有机碳源的种类和浓度，以及水背景情况等。 一般认为，系统中溶解氧保持在0.15mg/L 以下时反硝化才能正常进行。反硝化作用最适宜的pH为6.5-7.5,反硝化作用也是产碱过程，可以在一定程度上对冲硝化作用中消耗的一部分碱度。理论上，全程硝化过程可产生3.57g碱度（以CaCO 3 计）。在温度方面，实际中反硝化一般应控制在15-30 ℃。 二、参与反硝化作用的细菌 反硝化菌主要参与硝态氮及亚硝态氮还原过程，是生化系统中硝酸盐氮去除的主要功能菌。参与反硝化作用的细菌主要有以下几类： 1、反硝化细菌(Denitrifying bacteria) 这是一类兼性厌氧微生物，当水环境中有分子态氧时，氧化分解有机物，利用分子态氧作为最终电子受体。当溶解氧(DO)低于0.15mg/L，即缺氧状态，反硝化细菌可用硝酸盐、氮化物等作为末端电子受体，以有机碳源为氢供体，将硝 酸盐还原为NO、N 2O或N 2 。反硝化作用既可脱除污水中的硝态氮（总氮也自然降 低），又可一定程度维持水环境pH稳定性，还可以降低COD。这类反硝化菌中，有的能还原硝酸盐和亚硝酸盐，有的只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 2、好氧反硝化细菌 有些细菌能营有氧呼吸，同时实现反硝化作用。从污水中，最早分离的好氧
《微生物学》课程论文 论文题目：产甲烷杆菌的研究和其利用前景工艺学学院：生命与地理科学学院 专业：生物科学 班级：S10A 学号：20101911131 姓名：刘韬 成绩：
目录 1 产甲烷菌的分类................................................................................................................................ - 2 - 2.产甲烷菌的生态多样性.................................................................................................................... - 2 - 3．生长繁殖特别缓慢.......................................................................................................................... - 3 - 4.产甲烷菌代谢途径............................................................................................................................ - 3 - 5.甲烷合成的途径................................................................................................................................ - 3 - 6.沼气池中产甲烷杆菌和不产甲烷菌的关系.................................................................................... - 4 - 6.1不产甲烷细菌为产甲烷菌提供生长基质和产甲烷所需的底物 ......................................... - 4 - 6.2不产甲烷细菌为产甲烷菌创造适宜的厌氧环境................................................................. - 4 - 6.3不产甲烷细菌为产甲烷菌清除有毒物质............................................................................. - 4 - 6.4产甲烷菌为不产甲烷细菌生化反应解除反馈抑制............................................................. - 4 - 6.5共同维持沼气发酵环境中的适宜pH值............................................................................... - 5 - 6.6不产甲烷细菌构建了产甲烷菌的“古环境” ....................................................................... - 5 - 7.产甲烷杆菌的应用前景.................................................................................................................... - 5 - 7.1废水处理................................................................................................................................. - 5 - 7.2酿酒工业上的应用................................................................................................................. - 5 - 7.3产甲烷菌在煤层气开发中的应用......................................................................................... - 6 - 8. 结语................................................................................................................................................ - 6 - 参考文献................................................................................................................................................ - 6 -
■K硝化池 反硝化池主要是去除废水中的氨氮，同时降解废水中其他的污染物质。 反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N）或一氧化二 氮（NO）的过程。微生物和植物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO —NH+f有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。另一用途是利用N02和NO 为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（2）,称为反硝化作用或脱氮作用：NO —NO-NT。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： GH2Q+12NO—6HO+6C312NO+能量 CHCOOH+8N e6H2O+1OC04N+8OF+ 能量 少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。可进行以下反应： 5S+6KNO2HX 3N2+K2SO+4KHSO ■硝化池 这里的硝化主要是指生化处理工艺段的好养段，将氨氮氧化成亚硝酸氮或者 硝态氮的过程。由于污水氨氮较高。 该反应历程为： 亚硝化反 应］' （2-6） 硝化反 N~O2~-h-02 (2-7)
总反应 亚硝酸菌有亚硝酸单胞菌属、 亚硝酸螺杆菌属和亚硝酸球菌属。 硝酸菌有硝 酸杆菌属、硝酸球菌属。亚硝酸菌和硝酸菌统称为硝化菌。 发生硝化反应时细菌 分别从氧化NH -N 和NO 「-N 的过程中获得能量，碳源来自无机碳化合物，如 CO 3 一、HCO 、CO 等。假定细胞的组成为 GH 7NO ，则硝化菌合成的化学计量关系可表 示为： 亚硝化反 15CQ TlONO/ +3C 5H ?NO a +22H + +4巴0 硝化反 + NH. +10NO ； T + (2-10) 工艺中采用了两段硝化工艺设施。最大限度上降低生化手段降低氨氮的浓度, 同时减少其他污染物的浓度。 同时废水中的其他污染物质在两段反硝化 +硝化的过程中得到有效降解。 血 3 +202——NO,+ 屮 + (2-8) (2-9)
产甲烷菌 胡俊英 222010328210116 动医二班 摘要：产甲烷菌（Methanogenus），是专性厌氧菌，属于古菌域，广域古菌界，宽广古生菌门。1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中将其归属于1科、3属、9种。截至1992年已发展为3目、7科、19属、70种。截至2009年已发展为4目、12科、31属。 1979年，Balch和Wolfe通过16S rRNA测序将产甲烷菌发展为3目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7属14种。 1993年，Boone将甲烷八叠球菌科上升为一个目，建立了火热产甲烷菌目，至此产甲烷菌发展为5目10科25属59种。 2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，至此产甲烷菌发展为3纲，5目，10科，26属，78种。 产甲烷菌属于古菌域（Archaea），广域古菌界（Euryarchaeon），宽广古生菌门（Euryarchaeota）。 关键词：产甲烷细菌，厌氧分离技术，产甲烷作用 产甲烷菌（Methanogenus），是专性厌氧菌，属于古菌域，广域古菌界，宽广古生菌门。1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中将其归属于1科、3属、9种。截至1992年已发展为3目、7科、19属、70种。截至2009年已发展为4目、12科、31属。 1979年，Balch和Wolfe通过16S rRNA测序将产甲烷菌发展为3目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7属14种。 1993年，Boone将甲烷八叠球菌科上升为一个目，建立了火热产甲烷菌目，至此产甲烷菌发展为5目10科25属59种。 2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，至此产甲烷菌发展为3纲，5目，10科，26属，78种。 产甲烷菌属于古菌域（Archaea），广域古菌界（Euryarchaeon），宽广古生菌门（Euryarchaeota）。 已知产甲烷细菌约有10多种，主要有产甲烷杆菌、甲烷八叠球菌、产甲烷螺菌和瘤胃甲烷杆菌等。 这类细菌常见于沼泽、池溏污泥中，在食草动物的盲肠、瘤胃中也有大量的产甲烷细菌，常随粪便排出，所以在沼气池中可用塘泥和牲畜粪便接种。我国农村不少地区已建起了许多小型沼气池，利用沼气做饭、照明，既解决了燃料困难， 又减少了环境污染。 分布在污泥、泥沼和哺乳动物消化道等的代谢产物为甲烷（甲烷发酵）的细菌。马氏甲烷球菌（Methanococcus）、甲烷甲烷八叠球菌（Me thano-sarcina）、反刍甲烷杆菌（Methanobacterium）等都是不生孢子的专性厌氧细菌。在核蛋白体RNA碱顺序、细胞壁成分及脂质种类方面与一般细菌有不同处
甲烷氧化菌 国内外研究现状 国外对甲烷厌氧氧化的研究开始得较早。自1976年WiHiam Reeburgh在海洋沉积物中发现甲烷厌氧氧化作用开始，至今已有30多年。近几年来，荷兰Nijmegen Radboud大学微生物学系对甲烷厌氧氧化的研究相对较多。该课题组通过研究证实了多种环境中甲烷厌氧氧化的存在，尤其是在湿地幢和泥火山等1等极端环境中。且通过分子生物学方法，从中检测出了甲烷厌氧氧化菌，并对其进行了生理生态分析，证实了甲烷厌氧氧化并非只能在硫酸盐存在时才能发生，甲烷厌氧氧化可与脱硝作用耦合，不仅消耗了甲烷，同时降低了环境中氮的含量一J。虽然有研究者在实验室培养出具有甲烷厌氧氧化活性的混培物，并对个别甲烷厌氧氧化菌进行了分离鉴定，但是如何缩短甲烷厌氧氧化活性培养时间、探明甲烷厌氧氧化的生物学机制、运用甲烷厌氧氧化工艺还有待继续研究。 国内对甲烷厌氧氧化的研究相对较少。2005年，浙江大学生命科学院吕镇梅、闵航等研究了在不同环境条件下水田土壤甲烷好氧氧化活性和甲烷厌氧氧化活性，并以此计算水田土壤甲烷厌氧氧化对整个甲烷氧化的贡献率旧瑚】。此外，2006年，中国科学院广州地球化学研究所吴白军、周怀阳等以珠江河口淇澳岛一桂山岛一南海沉积物为研究对象，揭示了该区域沉积物甲烷厌氧氧化(AOM)过程的发生．并利用沉积物有机质的变化初步探讨AOM作用的影响因素汹瑚川。所有这些研究均未涉及到甲烷厌氧氧化活性的培养、生物学机制的研究等
问题。 甲烷厌氧氧化茵的分布 根据微生物的形态、代谢途径、膜结构、主要磷脂酸成分等系列特征，可将甲烷氧化细菌分为两类：即I型甲烷氧化细菌和Ⅱ型甲烷氧化细菌，它们分属于变形菌纲(Proteobacteria)的1亚纲和d亚纲。I型和Ⅱ型甲烷氧化菌在环境中的分布并不相同：I型甲烷氧化菌适合生长于低甲烷浓度的环境，在允许氧化菌陕速生长的环境中占优势；而Ⅱ型菌在高浓度甲烷、低氧气浓度条件下和贫营养环境下能存活得更好，从而有较广泛的分布【10l。一般所说的甲烷厌氧氧化菌属于Ⅱ型菌。虽然有机质含量多的基质可能会有利于Ⅱ型菌的生长，但甲烷、氧气、硫酸盐和结合态氮的浓度才是环境中甲烷厌氧氧化分布的决定性因素【11卅21。运用富集培养和现代分子生物学手段，研究人员已经从农KIt”】、森林‘141、草地‘151、垃圾填埋厂‘16巾】、沼泽‘1引、地下水㈣、海洋‘剐等多种环境的土壤、沉积物或水样中检测到了甲烷厌氧氧化菌的存在。2005年，荷兰Nijmegen Radboud大学MareStrous与合作者以淹没在水中的泥炭藓属苔藓为研究对象，发现了甲烷厌氧氧化过程的存在。泥炭藓 在泥炭沼中是优势植物，它与部分内部寄生的甲烷厌氧氧化细菌共生消耗甲烷。用13C．CH4培养这些细菌，可在原位快速地将甲烷氧化成二氧化碳，最终被泥炭藓固定，经检测13C-CH。结合到了植物固醇中，说明甲烷是泥炭藓主要的碳源和能源忙¨。现存的甲烷厌氧
厌氧消化中的产甲烷菌研究进展 公维佳，李文哲＊，刘建禹 （东北农业大学工程学院，黑龙江哈尔滨１５００３０） 摘要：在厌氧消化过程中，通过控制产甲烷菌的活动可显著提高厌氧消化效率。文章介绍了厌氧消化中产 甲烷菌的生理生化特征及代谢途径，综述了微量元素、硫酸盐、ｐＨ值、氧化还原电位等显著影响因子对产甲烷菌活动和甲烷产量的影响。 关键词：厌氧消化；产甲烷菌；显著影响因子中图分类号：Ｘ７０３ 文献标识码：Ａ 收稿日期：２００５－１２－１２ 基金项目：国家自然科学基金项目（５０３７６００９）；黑龙江省科技攻关（ＧＣ０３Ａ３０４） 作者简介：公维佳（１９８１－），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物质能源。 ＊通讯作者 目前能源与环境已成为影响人类社会可持续发展的重大问题，厌氧消化技术在能源生产和环境保护等方面具有突出的优势而倍受青睐。沼气发酵是自然界极为普遍而典型的厌氧消化反应，各种各样的有机物通过沼气发酵，不断地被分解代谢产生沼气，从而构成了自然界物质和能量循环的重要环节。厌氧消化是极为复杂的生物过程，在参与反应的众多微生物中，产甲烷菌的优劣和密度是影响厌氧消化效率和甲烷产量的重要因素，因此对产甲烷菌特征以及影响因子的研究成为重点。本文试图对这些研究进行综合性的分析总结，为今后的研究提供参考。 １产甲烷菌概述 产甲烷菌的研究开始于１８９９年，当时俄国的 微生物学家奥姆良斯基（Ｏｍｅｌｉａｎｓｋｉ）将厌氧分解纤维素的微生物分为两类，一类是产氢的细菌，后来称产氢、产乙酸菌；另一类是产甲烷菌，后来称奥氏甲烷杆菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｉ１１ｕｓｏｍｅｌａｕｓｋｉｉ）。１９０１年Ｓｏｈｚｇｅｎ对产甲烷菌的特征及对物质的转化进一步作了详细的研究。１９３６年Ｂａｒｋｅｒ对奥氏甲烷菌又作了分离研究。但这些研究，由于厌氧分离甲烷菌的技术尚不完备，均未取得大的进展。直到１９５０年 Ｈｕｎｇａｔｅ第一次创造了无氧分离技术才使甲烷菌的研究得到了迅速的发展［１］。 产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧消化转化成甲烷和二氧化碳的古细菌，它是严格厌氧菌，属于水生古细菌门（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）。它们生活在各种自然环境下，如反刍动物的瘤胃、人类的消化系统、稻田、湖泊或海底沉积物、热油层和盐池，以及污泥消化和沼气反应器等人为环境中［２］。产甲烷菌是厌氧消化过程的最后一个成员，甲烷的生物合成是自然界碳素循环的关键链条。 由于产甲烷菌是严格的厌氧菌，对其研究需要较高的技术手段，所以，在２０世纪７０年代中期以前，产甲烷菌新种发现的不多，据《伯杰细菌鉴定手册》第八版记载，产甲烷菌只有一个科，即甲烷杆菌科，分三个属，有９个种。但是，随着其研究手段的飞速发展，和人们对产甲烷菌的关注，越来越多的产甲烷菌被人们发现，到目前为止，从系统发育来看，甲烷菌分成５个目，分别为甲烷杆菌目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、甲烷球菌目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、甲烷八叠球菌目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、甲烷微菌目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ） 和甲烷超高温菌目（Ｍｅｔｈａｎｏｐ－ｙｒａｌｅｓ） ［２］ 。Ｓｃｈｎｅｌｌｅｎ第一个从消化污泥中分离纯化得到甲酸甲烷杆菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｍｉｃｉｕｍ）和巴氏甲烷八叠球菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉ），到目前为止，分离鉴定的产甲烷菌已有２００多种［３］。 ２产甲烷菌生理生化特征 在Ｈｕｎｇａｔｅ［４］厌氧分离培养纯化产甲烷菌的技 ２００６年１２月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００６ 文章编号 １００５－９３６９（２００６）０６－０８３８－０４ 第３７卷第６期东北农业大学学报３７（６）：８３８￣８４１
海洋中的甲烷氧化现象 Emily J. Beal Christopher H. House Vicoria J. Orphan 甲烷缺氧氧化菌有助于调节地球的气候，并且在地球形成早期，可能是微生物生态系统中的一个重要组成部分。通常认为缺氧甲烷氧化作用（AOM）由硫酸盐的含量控制，尽管其他电子受体能提供更多的化学势能。加利福尼亚州伊尔河盆地(ERB)的沉积物不断向上释放甲烷，我们发现在这些海洋沉积物中的微生物能利用锰（水钠锰矿）和铁（水合铁氧化物）氧化甲烷，这表明海洋的缺氧甲烷氧化作用不仅仅与硫酸盐含量有关，而是与多种氧化剂具有直接或间接的关系。河流源源不断地向海洋输入大量的铁、锰元素，因此，与铁、锰相关的缺氧甲烷氧化作用具有重要的全球化意义。 淡水体系中，在硫酸盐缺失的情况下，硝酸盐或亚硝酸盐也能使缺氧甲烷氧化作用进行。相关试验结果表明，向缺氧状态的底泥或消化污泥中投加锰（M n O2）或铁（FeCl2和FeCl3）会提高甲烷氧化的速率。但是，却没有在硫酸盐缺失的情况下海洋底泥发生缺氧甲烷氧化作用的直接证明。沉积物孔隙水的相关地球化学研究发现，在发生缺氧甲烷氧化作用的底泥中铁和锰元素被还原，而海洋沉积物中缺氧甲烷氧化的最大发生速率往往不与硫酸盐的最大还原速率相伴发生。在Franciscan Complex经抬升的伊尔河盆地沉积物中，由甲烷引起的碳酸盐13C衰竭与碳酸锰(MnCO 3 )之间存在着很强的相关性。此外，在黑海与甲烷渗漏相关的碳酸盐中也存在着锰和其它金属富集的现象。 在海洋体系的缺氧甲烷氧化过程中，水钠锰矿和水合铁氧化物可以作为电子受体。大量的锰（～19 Tg/a）和铁（～730 Tg/a）由河流源源不断地进入海洋。铁就是以这种方式先进入发源于美国加州北部海岸的伊尔河，再通过沉积物释放进入伊尔河盆地。如果全球范围的高价铁和高价锰都用来氧化甲烷的话，那么将占缺氧甲烷氧化总量的1/4。就算海洋中输入通量中的小部分的铁、锰参与缺氧甲烷氧化，也将会对甲烷总量产生较大的影响，因为铁、锰元素在被沉积物深埋之前都可以进行100~300次的氧化与还原反应。 伊尔河盆地沉积物的甲烷释放试验由甲烷、带13C示踪原子的甲烷、二氧化碳和人工配置的无硫酸盐海水进行。在提供硫酸盐、水钠锰矿、氢氧化三铁、水合铁氧化物、硝酸盐、硝酸盐+硫酸盐以及无电子受体（对照）的实验体系中，分别进行3组平行试验。水钠锰矿和水合铁氧化物实验体系分别进行了预处理，以保证体系内没有硫酸盐的存在。在甲烷缺氧氧化的过程中，13C示踪原子由甲烷转变成二氧化碳，因此在实验过程中我们通过测定二氧化碳中13C的浓度变化来考察缺氧甲烷氧化过程，再将δ13CO2的产生量转化成甲烷被氧化的量。 在提供硫酸盐、水钠锰矿或水合铁氧化物电子受体的实验体系测定二氧化碳中13C的富集情况，结果表明在没有硫酸盐的情况下水钠锰矿或水合铁氧化物仍然能使缺氧甲烷氧化得以进行。在各实验体系中均对硫酸盐含量进行监测，以保证添加水钠锰矿或水合铁氧化物实验体系中保持无硫酸盐状态（硫酸盐含量小于30μm）。对水钠锰矿或水合铁氧化物实验体系进行高压灭菌处理，实验过程中二氧化碳和甲烷之间没有发生非生物因素的同位素交换，同时也没有非生物因素的硫酸盐产物。在仅有硝酸盐和硝酸盐、硫酸盐共存的实验体系中，缺氧甲烷氧化过程受到了抑制。同样，存在氢氧化三铁的实验中也没有观察到缺氧甲烷氧化的发生。 以往的研究文献表明，与水合铁氧化物相比，黑海底泥中的微生物能更有效地利用水钠锰矿。在实验过程中，我们发现由水钠锰矿控制的缺氧甲烷氧化反应速率快于由水合铁氧化物控制的缺氧甲烷氧化反应速率。水钠锰矿或水合铁氧化物控制的缺氧甲烷氧化速率均小于硫酸盐控制的缺氧甲烷氧化速率，尽管两者能产生较高的化学势能。原因可能在于水钠锰矿和水合铁氧化物都是固体，其利用率均低于溶解态的硫酸盐。尽管水钠锰矿和水合铁氧化物对甲烷的缺氧氧化速率较低，却对甲烷的地球化学循环起着举足轻重 - 42 -
产甲烷菌有何特点？ 甲烷菌的特点是：一、生长非常缓慢，如甲烷八叠球菌在乙酸上生长时其倍增时间为1至2天，甲烷菌丝倍增时间为4至9天;二、严格厌氧，对氧气和氧化剂非常敏感，在有空气的条件下就不能生存或死亡;三、只能利用少数简单的化合物作为营养;四、它们要求在中性偏碱和适宜温度环境条件;五、代谢活动主要终产物是甲烷和二氧化碳为主要成分的沼气。 甲烷菌 1．是专性严格厌氧菌 甲烷细菌都是专性严格厌氧菌，对氧非常敏感，遇氧后会立即受到抑制，不能生长、繁殖，有的还会死亡。 2．生长繁殖特别缓慢 甲烷细菌生长很缓慢，在人工培养条件下需经过十几天甚至几十天才能长出菌落。据麦卡蒂（McCarty）介绍，有的甲烷细菌需要培养七八十天才能长出菌落，在自然条件下甚至更长。菌落也相当小，特别是甲烷八叠球菌菌落更小，如果不仔细观察很容易遗漏。菌落一般圆形、透明、边缘整齐，在荧光显微镜下发出强的荧光。甲烷细菌生长缓慢的原因，是它可利用的底物很少，只能利用很简单的物质，如CO2、H2、甲酸、乙酸和甲基胺等。这些简单物质必须由其它发酵性细菌，把复杂有机物分解后提供给甲烷细菌，所以甲烷细菌一定要等到其它细菌都大量生长后才能生长。同时甲烷细菌世代时间也长，有的细菌20分钟繁殖一代，甲烷细菌需几天乃至几十天才能繁殖一代。 3．都是原核生物 能形成甲烷的细菌都是原核生物，目前尚未发现真核生物能形成甲烷。甲烷细菌有球形、杆形、螺旋形，有的呈八叠球状，还有的能联成长链状。 4．培养分离比较困难 因为甲烷细菌要求严格厌氧条件，一般培养方法很难达到厌氧，培养分离往往失败。又因为甲烷细菌和伴生菌生活在一起，菌体大小形态都十分相似，在一般光学显微镜下不好判明。美国著名微生物学家——Hungate 50年代培养分离甲烷细菌获得成功。以后世界上有很多研究者对甲烷细菌进行了培养分离工作，并对Hungate分离方法进行了改良，能很容易地把甲烷细菌培养分离出来。 甲烷细菌在自然界中分布极为广泛，在与氧气隔绝的环境都有甲烷细菌生长，海底沉积物，河湖淤泥，沼泽地，水稻田以及人和动物的肠道，反刍动物瘤胃，甚至在植物体内都有甲烷细菌存在。 沼气发酵液中甲烷细菌的数量可用MPN法计数，测定接种的试管中有无甲烷存在，作为计数的数量指标。甲烷细菌数量与甲烷含量成正比，发酵装置运行越好，甲烷细菌数量越多。作者曾于1991年计数了东北制药总厂用UASB（上流式厌氧污泥床）处理制药废水消化液中甲烷细菌数量为4.2×105个·ml-1。 另一方面产甲烷细菌利用乙酸、氢和二氧化碳合成甲烷，也消耗了酸和二氧化碳，甲烷细菌及其伴生菌共同作用使pH稳定在一个适宜范围内，不会使发酵液中的pH出现对沼气发酵不利的情况。但当发酵条件控制不好，如温度，进料负荷，原料中的C：N、pH等可能会出现酸化或液料过碱；前者较为多见，这样会严重影响甲烷细菌的活动，甚至使发酵中断。 产甲烷作用
■反硝化池 反硝化池主要是去除废水中的氨氮，同时降解废水中其他的污染物质。 反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。微生物和植物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO3-→NH4+→有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。另一用途是利用NO2-和NO3-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（N2），称为反硝化作用或脱氮作用：NO3-→NO2-→N2↑。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示：C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量 CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量 少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。可进行以下反应：5S+6KNO3+2H2O→3N2+K2SO4+4KHSO4 ■硝化池 这里的硝化主要是指生化处理工艺段的好养段，将氨氮氧化成亚硝酸氮或者硝态氮的过程。由于污水氨氮较高。 该反应历程为： 亚硝化反应 (2-6) 硝化反应 (2-7) 总反应式 (2-8)
亚硝酸菌有亚硝酸单胞菌属、亚硝酸螺杆菌属和亚硝酸球菌属。硝酸菌有硝酸杆菌属、硝酸球菌属。亚硝酸菌和硝酸菌统称为硝化菌。发生硝化反应时细菌分别从氧化NH3-N和NO2－-N的过程中获得能量，碳源来自无机碳化合物，如CO32－、HCO－、CO2等。假定细胞的组成为C5H7NO2，则硝化菌合成的化学计量关系可表示为： 亚硝化反应 (2-9) 硝化反应 (2-10) 工艺中采用了两段硝化工艺设施。最大限度上降低生化手段降低氨氮的浓度，同时减少其他污染物的浓度。 同时废水中的其他污染物质在两段反硝化+硝化的过程中得到有效降解。
产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。 摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。 一、实验原理 (一) 产甲烷菌 厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。 (二) 产甲烷菌的发现历史 自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。 (三) 定义、性质及分布 产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。它生长的氧化还原电位约为-0.33V，最适生长温度为35—40度，最适pH为6.0-7.2。例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。 产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。 (四) 产甲烷菌的培养
产甲烷菌 产甲烷菌（Methanogenus），是专性厌氧菌，1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中将其归属于1科、3属、9种。截至1992年已发展为3目、7科、19属、70种。 人们对产甲烷菌的认识约有150年的历史。人们对产甲烷菌有极大的兴趣是在于产甲烷菌对天然气的形成，在自然界与水解菌和产酸菌等协同作用，使有机物甲烷化，产生有经济价值的生物能物质——甲烷。 产甲烷菌的细胞结构 产甲烷菌的细胞结构：细胞封套（包括细胞壁、表面层、鞘和荚膜）、细胞质膜、原生质和核质。 产甲烷菌有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，它们的细胞壁结构和化学组分有所不同。也是与真细菌的区别点。 细胞封套有四种： 1.大多数G+产甲烷菌的细胞壁在结构上与G+真细菌相似，细胞壁有一层和三层的，单层的厚度为10～20nm，如甲烷杆菌属与甲烷短杆菌属。巴氏甲烷八叠球菌的细胞壁只有一层，厚约200nm。它们化学成分与G+真细菌的不同，不含细胞壁（即不含二胺基庚二酸或细胞酸）而是假细胞壁质或是未化的异多糖。三层的细胞壁壁厚为20～30nm，有内层、中层和外层。外层在细胞分裂横隔形成时消失，如瘤胃甲烷短杆菌。 2.G+的炽热高温甲烷菌的细胞壁外有一层六角形的蛋白质亚基即S层覆盖。 3.G-产甲烷菌不具有球囊多聚物或外膜。只有一层六角形或四角形的，由蛋白质亚基或糖蛋白亚基组成的S层。 4.甲烷螺菌的细胞质膜外只有一层由蛋白纤维组成的鞘包裹几个细胞。其厚度为10nm。 产甲烷菌的生理特性 1.营养特性：甲烷细菌的能源和碳源物质主要有5种，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。
2.特殊辅酶：F420：是黄素单核甘酸的类似物，分子量为630的低分子量荧光化合物。它是甲烷细菌持有的辅酶，在形成甲烷过程中起着重要作用。 其特点：(1)当用420nm波长的紫外光照射时，能产生自发蓝绿荧光，这一现象可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）中性或碱性条件下易被好氧光解，并使酶失活。 CoM:2-硫基乙烷磺酸. 其特点：（1）它是甲烷细菌独有的辅酶，可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）它在甲烷形成过程中，起着转移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效应.。即促进CO2还原为CH4的效应。 3.环境条件：氧化还原电位：参与中温消化的甲烷细菌要求环境中应维持的氧化还原电位应低于一350mV；对参与高温消化的甲烷细菌则应低于-500~-600mV。 温度：低温菌的适应范围为20~25°C，中温菌为30~45°C，高温菌为45~75°C。 PH：大多数中温甲烷细菌的最适pH值范围约在6.8~7.2之间。 毒物：凡对厌氧处理过程起抑制或毒害作用的物质，都可称为毒物。 产甲烷菌的培养方法 产甲烷菌是专性厌氧菌，它分离和培养等的操作均需要在特殊环境和用特殊的技术进行。一般要求不高的可用在液面加石蜡或液体石蜡的液体深层培养法、抽真空的培养法、在封闭培养管中放入焦性没食子酸和碳酸钾除去氧的培养方法（Berker）、Hungate的厌氧滚管法、Hungate的厌氧液体培养法、Balch的厌氧液体培养增压法等。目前最好的是厌氧手套箱，它由四部分组成： 1.附有手套的密闭透明薄膜箱 2.附有两个可开启的可抽真空的金属空气隔离箱 3.真空泵 4.氢和高纯氮的供应系统 利用厌氧手套箱可做许多工作，如：分装厌氧培养基，倒制平板，离心厌氧微生物收集菌体，对氧敏感的酶和辅酶的分离纯化，进行电泳、厌氧性生物化学反应和遗传学研究等。
硝化与反硝化去除氨氮的 原理 Prepared on 22 November 2020
硝化与反硝化去除氨氮操作 一、硝化与反硝化的作用机理： 1、硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌，亚硝化菌将废水中的NH3转化为亚硝酸盐，硝化菌将亚硝酸盐转化为硝酸盐，称为硝化作用。硝化作用必须通过这两类菌的共同作用才能完成。 2、反硝化菌将硝酸盐转化为N2、NO、N2O，称为反硝化作用。 3、硝化细菌必须在好氧条件下作用。 4、反硝化菌必须在无氧或缺氧的条件下进行。 二、作用方程式： 硝化反应： 2NH3＋3O2――（亚硝化菌）――2HNO2＋2H2O＋能量（氨的氧化） 2HNO2＋O2――（硝化菌）――2HNO3＋能量（亚硝酸的氧化） 反硝化反应： NO3— +CH3OH —— N2 + CO2+H2O+ OH—（以甲醇作为C源） 三、操作： 1、将购买的硝化菌投加到曝气池5、6#，亚硝化菌投加到曝气池1、 2、 3、4#，反硝化菌投加到厌氧池。 2、控制指标： 生物硝化 ①PH值：控制在— ②温度：25—30℃ ③溶氧：2—4mg/L
④污泥停留时间：必须大于硝化菌的最小世代时间，一般应大于2小时生物反硝化： ①PH值：控制在— ②温度：25—30℃ ③溶氧：L ⑤机碳源：BOD5/TN＞（3—5）过低需补加碳源
生物脱氮机理 污水生物脱氮的基本原理就是在将有机氮转化为氨态氮的基础上，先利用好氧段经硝化作用，由硝化细菌和亚硝化细菌的协同作用，将氨氮通过硝化作用转化为亚硝态氮、硝态氮，即，将转化为和。在缺氧条件下通过反硝化作用将硝氮转化为氮气，即，将（经反亚硝化）和（经反硝化）还原为氮气，溢出水面释放到大气，参与自然界氮的循环。水中含氮物质大量减少，降低出水的潜在危险性，达到从废水中脱氮的目的。 ○1硝化——短程硝化： 硝化——全程硝化（亚硝化+硝化）： ○2反硝化——反硝化脱氮： 反硝化——厌氧氨氧化脱氮： 反硝化——厌氧氨反硫化脱氮： 废水中氮的去除还包括靠微生物的同化作用将氮转化为细胞原生质成分。主要过程如下：氨化作用是有机氮在氨化菌的作用下转化为氨氮。硝化作用是在硝化菌的作用下进一步转化为硝酸盐氮。其中亚硝酸菌和硝酸菌为好氧自养菌，以无机碳化合物为碳源，从或的氧化反应中获取能量。其中硝化的最佳温度在纯培养中为25-35℃，在土壤中为30-40℃，最佳pH值偏碱性。反硝化作用是反硝化菌（大多数是异养型兼性厌氧菌， DO
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