中图分类号：Ｓ ８５２．６５９．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７３－４６９６（２０１１）０３－０２６７－
０６猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量
ＲＴ－
ＰＣＲ检测方法的建立高诗敏１，王敏功１，邓瑞林２，姚晓辉２，王林川１，
２＊
（１．华南农业大学，广东广州 ５１０６４２；２．广东温氏集团，广东云浮 ５２７４３９
） 摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（
ＰＲＲＳＶ）变异株和经典毒株的序列差异，分别设计了１对特异性鉴别引物和１条ＴａｑＭａｎ探针，建立了检测ＰＲＲＳＶ变异株的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明，建立的方法可鉴别诊断ＰＲＲＳＶ变异株和经典毒株，具有较高的特异性；可以检测相当于１ＴＣＩＤ５０的病毒模板，比常规ＲＴ－ＰＣＲ方法的灵敏度高１００倍；对同一样品进行４次重复试验，变异系数（ＣＶ）＜１０％，具有较好的重复性。应用建立的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ和常规ＲＴ－ＰＣＲ对１３份ＰＲＲＳ疑似病例肺组织进行平行检测，结果荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检出１１份阳性，高于常规ＲＴ－ＰＣＲ方法。本研究建立的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法能检测高致病性ＰＲＲＳＶ变异株，不仅特异性好、灵敏度高，而且快速简便，可用于变异ＰＲＲＳＶ的临床诊断和流行病学调查。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；变异株；实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ
ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ
ｓｔｒａｉｎｓＧＡＯ Ｓｈｉ－ｍｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｍｉｎ－ｇｏｎｇ１，
ＤＥＮＧ Ｒｕｉ－ｌｉｎ２，ＹＡＯ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ ２，ＷＡＮＧ Ｌｉｎ－ｃｈｕａｎ１，
２
（１．Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；２ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｗｅｎｓ，Ｙｕｎｆ
ｕ ５２７４３９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）ｖａｒｉａｎｔｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖａｒｉａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＲＲＳＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ＰＲＲＳＶ ｖａｒｉａｎｔｓ．１ＴＣＩＤ５０ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｗａｓ １００ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｕｌｄｂｅ ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｏｆ ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％ｂａｓｅｄ ｏｎ ４ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ．１３ｌｕｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ １１ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＲＲＳＶ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ｂｕｔｏｎｌｙ ９ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＲＲＳＶ ｂｙ
ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ＰＲＲＳＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＰＲＲＳＶ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ；ｖａｒｉａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ收稿日期：２０１０－０９－１５；修回日期：２０１１－０２－
２８作者简介：高诗敏（１９８５－）
，女，山西太谷人，硕士生，研究方向：动物病毒学。王敏功对本文有同等贡献。＊通讯作者，Ｔｅｌ：０２０－
８５２８１６２５中国兽医科学 ２０１１，４１（０３）：２６７－
２７２Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
猪繁殖与呼吸综合征（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）引起猪的一种高度烈性传染性疾病，又称蓝耳病，主要以母猪厌食、发热，怀孕中后期发生流产、死胎和木乃伊胎，仔猪出现呼吸道症状为特征［１］。该病于１９８７年首次在北美洲被发现，随后在世界范围内迅速传播。１９９６年我国首次报道分离出ＰＲＲＳＶ［２］，但近年来，随着我国养猪规模、饲养方式、贸易以及防制措施等方面的变化，ＰＲＲＳ的发生和流行也随之出现了一些新的特点，其中２００６年夏季在我国中南部暴发了ＰＲＲＳ疫情，并分离出ＰＲＲＳＶ变异株，２００７年ＰＲＲＳ蔓延至２６个省份，发病猪数达３０万头。ＰＲＲＳＶ已成为危害我国养猪业主要的传染病病原之一，给养猪业带来了巨大的经济损失［３－５］。
目前，用于检测ＰＲＲＳＶ的方法有多种，如病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（ＩＰＭＡ）、间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和血清中和试验（ＳＮ）、免疫胶体金技术、反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、实时荧光定量ＰＣＲ和基因探针等［６］。荧光定量ＰＣＲ方法是近年来迅速发展起来的一种分子生物学方法，具有快速、敏感、准确、定量检测微生物核酸拷贝数等优点。Ｅｇｌｉ等［７］报道了一种基于ＴａｑＭａｎ技术的实时荧光定量ＰＣＲ方法，可检测到含量为１ＴＣＩＤ５０的ＰＲＲＳＶ，较为敏感。黄娟等［８］也建立了ＰＲＲＳＶ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，对１０份ＰＲＲＳ疑似猪肺组织进行了荧光定量ＰＣＲ检测，结果与病毒分离的阳性符合率为１００％。本试验旨在针对我国ＰＲＲＳＶ出现变异株的情况，建立一种可以快速、灵敏、准确地鉴别诊断ＰＲＲＳＶ变异株与经典毒株的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法。该方法的建立对临床诊断ＰＲＲＳＶ变异株和流行病学调查具有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 毒株
猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ＧＤ－ＺＱ、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｙｕｎｆｕ０７株、猪口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）、猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株Ｃｈ－１ａ、猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）、伪狂犬病病毒（ＰＲＶ），副猪嗜血杆菌（ＨＰＳ）由笔者所在实验室提供。
１．２ 主要试剂及仪器
ＭｉｎｉＢＥＳＴ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒ．３．０、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０、ＰｒｅｍｉｘＥｘ ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）、ＤＬ２０００ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、２０ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自大连宝生物工程有限公司；Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ购自广州鼎国生物技术有限公司；Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐＳｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；染料Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＳｔａｉｎ购自ＧｏｌｄＶｉｅｗ公司；Ｍｘ３００５ＰＲｅａｌ ＴｉｍｅＰＣＲ扩增仪购自美国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司。
１．３ 引物及探针的设计与合成
根据ＧｅｎＢａｎｋ中收录的ＰＲＲＳＶ基因组序列，应用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０软件设计了１对特异性引物Ｆ：５′－ＧＧＧＡＧＴＧＴＡＣ－ＴＣＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＡＣＣ－３′、Ｒ：５－ＴＧＣＣＧＣＡＡ－ＴＣＧＧＡＴＧＡＡＡＧ－３′和１条探针Ｐ：５′－ＡＡＡＴ－ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＴ－３′，引物Ｆ、Ｒ预期扩增片段长１３２ｂｐ，用于鉴别诊断ＰＲＲＳＶ变异株和经典株；探针５′端用ＦＡＭ标记，３′端用ＴＡＭＡＲＡ标记，经ＢＬＡＳＴ鉴定引物为特异性引物，引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。
１．４ 样品的制备
１．４．１ 标准品的制备 将收获的ＰＲＲＳＶ病毒液反复冻融３次，４℃６ ０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清，将病毒液稀释成含１０５ ＴＣＩＤ５０、１０４ ＴＣＩＤ５０、１０３ＴＣＩＤ５０、１０２ ＴＣＩＤ５０、１０ＴＣＩＤ５０、１ＴＣＩＤ５０、０．１ＴＣＩＤ５０梯度浓度，分别提取病毒ＲＮＡ，用下游特异性引物反转录成ｃＤＮＡ，作为荧光定量ＰＣＲ反应的模板。１．４．２ 不同模板的制备 分别以ＰＲＲＳＶ变异株ＧＤ－ＺＱ、高致病性ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７株、ＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ经典株Ｃｈ－１ａ、ＣＳＦＶ的ｃＤＮＡ以及ＰＲＶ、ＨＰＳ的ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，反应程序：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ，反应结束后降温至１５℃。分别取５μＬ不同模板的ＰＣＲ反应产物与１μＬ ６×上样缓冲液混匀点样，１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳以检测引物的特异性。
１．５ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测体系的建立１．５．１ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应条件的优化 用以上制备的ｃＤＮＡ标准品对该ＴａｑＭａｎ模式的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应条件按Ｍｘ３００５ＰＲｅａｌ ＴｉｍｅＰＣＲ扩增仪的操作要求和Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒ－ｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）试剂盒的使用说明书进行反应，确定其最佳引物和探针的浓度及反应温度和条件。１．５．２ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ标准曲线的制作 使用制备的ｃＤＮＡ标准品制作标准曲线。标准品做１０倍梯度稀释，以１０５ ＴＣＩＤ５０、１０４ ＴＣＩＤ５０、１０３ ＴＣＩＤ５０、１０２ ＴＣＩＤ５０、１０ＴＣＩＤ５０、１ＴＣＩＤ５０浓度的病毒液作为
８
６
２中国兽医科学第４１卷
ｃＤＮＡ模板，进行荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ试验。每一浓
度ｃＤＮＡ标准品设３个重复。选取Ｃｔ值在１８～３２之间稀释度的ｃＤＮＡ制作标准曲线，以获得的Ｃｔ值为ｙ轴，对应的ｃＤＮＡ拷贝数的对数为ｘ轴，并计算标准曲线的斜率和反应的相关系数。
１．５．３ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ的敏感性试验 以
１．５．２中稀释浓度的病毒液作为ｃＤＮＡ模板，进行荧光ＲＴ－ＰＣＲ与普通ＲＴ－ＰＣＲ试验，
设定阴性对照，评价本方法的敏感性，同时比较这两种检测方法的灵敏度。
１．５．４ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ的重复性试验 以
１．５．２中稀释浓度的病毒液作为ｃＤＮＡ模板，设４管重复进行反应。根据获得的Ｃｔ值计算平均Ｃｔ值、标准差和变异系数，评价本方法的重复性。１．５．５ 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ的特异性检测 以
ＰＲＲＳＶ变异株ＧＤ－ＺＱ、高致病性ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７株、ＰＲＲＳＶ经典株Ｃｈ－
１ａ、ＦＭＤＶ、ＣＳＦＶ的ｃＤＮＡ以及ＰＲＶ、ＨＰＳ的ＤＮＡ为模板，用所建立的方法进行扩增，设定阴性对照，观察有无特异性扩增曲线，
评价本方法的特异性。１．５．６ 临床样品的检测 用所建立的方法和普通ＰＣＲ方法平行检测１３份疑似猪高热病病死猪病料中的ＰＲＲＳＶ，设定阳性对照和阴性对照，以阳性对照出现扩增曲线、阴性对照无扩增曲线为标准，比较检测结果，评价本方法的实用性。
２ 结果
２．１ 不同模板的ＲＴ－
ＰＣＲ扩增 用特异性引物对ＰＲＲＳＶ变异株ＧＤ－
ＺＱ、高致病性ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７株、ＦＭＤＶ、ＰＲＲＳＶ经典株
Ｃｈ－１ａ、ＣＳＦＶ的ｃＤＮＡ模板，ＰＲＶ、ＨＰＳ的ＤＮＡ模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果（见图１）显示，用本试验设计的引物扩增的片段与我国近期从高热症猪群中分离的毒株ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７的一致
。
图１ ＲＴ－
ＰＣＲ扩增产物的电泳结果Ｆｉｇ．１ ＲＴ－ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｌａｔｅｓＭ：２０ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＲＲＳＶ ＧＤ－ＺＱ；２：ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎ－ｆｕ０７；３－７：ＰＲＲＳＶ Ｃｈ－１ａ、ＣＳＦＶ、ＦＭＤＶ、ＰＲＶ、ＨＰＳ；８：阴性对照Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ２．２ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ反应条件的筛选 采用矩阵法优选引物和探针的最佳工作浓度。
结果表明，用１０μｍｏｌ／Ｌ引物、５μｍｏｌ／Ｌ探针对模板的检测可获得较小的Ｃｔ值（见表１）。本方法的最佳反应条件为：退火、延伸温度均为６０℃，４２个循环。
表１ 用矩阵法优选的引物和探针的最佳工作浓度
Ｔａｂｌｅ １ Ｂｅｓｔ ｗｏｒｋｉｎｇ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄ ｐ
ｒｏｂｅｓ引物浓度
／（μｍｏｌ·Ｌ－１）Ｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ不同浓度（μ
ｍｏｌ／Ｌ）探针的Ｃｔ值Ｃｔｖａｌｕｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｂｅ２ ５ １０ １５５ ３４．６１ ３０．７６ ２８．８３ ３５．２９１０ ２３．６３ ２１．５１ ２４．７３ ２３．４５１５ ２５．３７ ２４．１５ ２３．１４ ２６．６３２０
３０．４１
２６．２３
２７．２３
２８．５７
２．３ 标准曲线的建立
对扩增曲线进行分析，
生成标准曲线（见图２）和回归方程。该标准曲线的斜率为－３．４２９，截距为３９．０７，可推导出ｌｇ（ＴＣＩＤ５０）与循环阈值（Ｃｔ）
之间的线性关系表达式为Ｃｔ＝－３．４２９×ｌｇ（ＴＣＩＤ５０）＋
３９．０７，扩增效率Ｅ＝９５．７％，相关系数ｒ２
＝０．９９４。
将检测样品的扩增曲线的Ｃｔ值带入上述方程，
即可得到样品中病毒模板的相对含量
。
图２ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ的标准曲线Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｇｒａｐ
ｈ ｏｆ ｔｈｅ ＰＲＲＳＶ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ
２．４ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ的敏感性试验 敏感性试验结果显示，相当于１ＴＣＩＤ５０的病毒
模板反应孔中有荧光信号（见图３），其敏感性可达１ＴＣＩＤ５０。
用上述同样的模板进行常规ＲＴ－ＰＣＲ，电泳结果显示，常规ＲＴ－ＰＣＲ方法只能检测到相当于
１０２
ＴＣＩＤ５０的病毒模板（
见图４）。比较结果表明，本方法的检测灵敏度比常规ＲＴ－ＰＣＲ的高１００倍。
９
６２第３期 高诗敏等：
猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立
图３ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ的灵敏度检测Ｆｉｇ．３ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ｔｅｓｔ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ１：１０５ ＴＣＩＤ５０；２：１０４ ＴＣＩＤ５０；３：１０３ ＴＣＩＤ５０；４：１０２ ＴＣＩＤ５０；
５：１０ＴＣＩＤ５０；６：１ＴＣＩＤ５０；
７：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ图４ 普通ＲＴ－
ＰＣＲ的检测结果Ｆｉｇ
．４ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ－ＰＣＲＭ：２０ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１：１０５ ＴＣＩＤ５０；２：１０４ ＴＣＩＤ５０；３：１０３ＴＣＩＤ５０；４：１０２ ＴＣＩＤ５０；５：１０ＴＣＩＤ５０；６：１ＴＣＩＤ５０；７：０．１ＴＣＩＤ５０；
８：阴性对照Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ２．５ 特异性试验
用建立的方法对ＰＲＲＳＶ变异株ＧＤ－
ＺＱ、高致病性ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７株、ＰＲＲＳＶ经典株Ｃｈ－１ａ、ＦＭＤＶ、ＣＳＦＶ的ｃＤＮＡ以及ＰＲＶ、ＨＰＳ的ＤＮＡ
模板进行扩增鉴定，结果显示，ＰＲＲＳＶ变异株ＧＤ－ＺＱ、高致病性ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７株有特异性扩增曲
线，ＰＲＲＳＶ经典株Ｃｈ－１ａ、ＦＭＤＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＶ、ＨＰＳ以及阴性对照无特异性扩增曲线（
见图５），说明设计的引物和探针具有良好的特异性，能鉴别ＰＲＲＳＶ经典毒株与变异株。
２．６ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ的重复性试验 根据扩增反应的Ｃｔ值，计算变异系数（ＣＶ），结果重复性试验的ＣＶ＜１０％，
表明所建立的方法具有较好的稳定性，重复性良好（见图６）。２．７ 临床样品的检测
用建立的方法检测１
３份疑似高致病性ＰＲＲＳＶ感染猪的肺、脾以及血清样品，并与常规ＲＴ－ＰＣＲ方法进行比较，结果显示，本方法检出１１份阳性样品（见图７），而常规ＲＴ－ＰＣＲ只检出９份阳性样品
（见图８），两种检测方法所检测相同范围内的样品结果一致，本方法还检出常规ＲＴ－ＰＣＲ不能检出的阳性样品，说明建立的实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法更加准确实用
。
图５ 荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ的特异性试验Ｆｉｇ．５ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｔｅｓｔ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ１：ＰＲＲＳＶ ＧＤ－ＺＱ；２：ＰＲＲＳＶ Ｙｕｎｆｕ０７；３－７：ＰＲＲＳＶ Ｃｈ－１ａ、ＣＳＦＶ、ＦＭＤＶ、ＰＲＶ、ＨＰＳ；８：阴性对照Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ图６ 重复性检测的实时扩增结果
Ｆｉｇ．６ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ
ｔｅｓｔ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ１：１０５ ＴＣＩＤ５０；２：１０４ ＴＣＩＤ５０；３：１０３ ＴＣＩＤ５０；４：１０２
ＴＣＩＤ５０；
５：１０ＴＣＩＤ５０；
６：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ３ 讨论
猪繁殖与呼吸综合征是目前国内流行的主要猪传染病之一，被我国定为二类传染病，该病的发生给养猪业造成了巨大的经济损失，及时、快速、精确地
检测ＰＲＲＳＶ是有效防控的首要前提［９］。特别是在
ＰＲＲＳＶ发生变异后，
需要高敏感性及高特异性的检测方法。然而目前的各种检测方法在敏感性和特异性方面都不能达到特定的要求。
０
７２中国兽医科学第４１卷
图７ 临床样品的荧光定量ＲＴ－
ＰＣＲ检测结果Ｆｉｇ．７ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ
１：阳性对照；２～１２：临床病料的扩增曲线；１３：
阴性对照１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２－１２：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ；１３：Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ图８ 临床病料的ＲＴ－
ＰＣＲ检测结果Ｆｉｇ．８ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ＲＴ－ＰＣＲＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１～１３：临床病料的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物；１４：阴性对照
Ｍ：２０ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１－１３：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ；１４：Ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 本研究根据Ｇ
ｅｎＢａｎｋ中登录的ＰＲＲＳＶ变异株和经典株保守基因序列，设计合成了１对特异性引物和１条ＴａｑＭａｎ荧光探针，并对其进行了筛选鉴定。对荧光定量ＰＣＲ的反应条件进行了优化，建立了ＰＲＲＳＶ变异株荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。特异性试验结果显示，用本方法可鉴别诊断ＰＲＲＳＶ变异株和经典株，对ＦＭＤＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＶ、
ＨＰＳ等常见猪源病原无扩增曲线，说明建立的方法有较高的特异性；与常规ＲＴ－ＰＣＲ方法比较，本方法可以检测出相当于１ＴＣＩＤ５０的病毒模板，比常规ＲＴ－ＰＣＲ方法的灵敏度高１００倍。应用建立的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ和常规ＲＴ－ＰＣＲ对１３份ＰＲＲＳ疑似病例的肺、脾、血清病料进行平行检测，结果荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测出１１份阳性，高于常规ＲＴ－ＰＣＲ
方法检出的９份。表明，本试验建立的方法不仅实
现了对ｃＤＮＡ模板的定量，而且具有快速、敏感、特异和重复性好的优点，完全可以满足ＰＲＲＳＶ变异株检测的要求。
由于Ｐ
ＲＲＳ临床表现的多样性和复杂性，以及亚临床或潜伏感染猪群的存在，
对低水平的病毒进行快速准确的诊断是防制该病的关键。鉴别诊断ＰＲＲＳＶ的方法已有报道，
针对国内流行的高致病性ＰＲＲＳＶ变异株基因组的特点，
国内学者建立了高致病性ＰＲＲＳＶ ＲＴ－ＰＣＲ检测技术［４－５］。但由于
传统的ＰＣＲ检测技术是对样品的ＰＣＲ产物进行电泳，容易造成ＰＣＲ产物污染，
导致假阳性，不利于临床的正确诊断。近几年发展起来的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法将ＰＣＲ与荧光检测相结合，
与常规ＲＴ－ＰＣＲ对ＰＲＲＳＶ的检测结果进行比较，该方法有着更高的灵敏度和阳性检出率，且避免了ＥＢ对人体的危害，检测过程快捷、简便、准确，可有效应用于对ＰＲＲＳＶ变异株的鉴别检测，
已成为核酸定量检测的首选方法而得到广泛应用［
１０－
１２］。 综上所述，
本试验建立的方法能鉴别检测目前流行的美洲型ＰＲＲＳＶ变异株、国内经典的Ｃｈ－１ａ株，它不仅实现了对ｃＤＮＡ模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点。将其应
用于实践，可满足当前对ＰＲＲＳＶ检测的要求，对ＰＲＲＳ的防治和诊断鉴定具有重要意义。
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ｉｃａｌ ＰＲＲＳ ｉｎ１
７２第３期 高诗敏等：
猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立
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（责任编辑 胡弘博）
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７
２中国兽医科学第４１卷
猪呼吸道疾病综合征(PRDC)综合防制 【研究背景】近年来，猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory dis-ease complex，PRDC）在全国呈现地方流行趋势，发病率和死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。也是全球养猪业面临的重大突出问题之一，现已成为中国养猪业中以经济学意义影响最大的疾病。 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一种多因素性疾病，即猪群在亚健康状态下先后感染病毒、细菌、支原体等病原后，从而使猪呼吸系统表现出一系列综合症候群。猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的危害体现在主要发生于仔猪、保育猪和生猪育肥阶段，一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季为高发期，发病率通常在30-70%，死亡率在10-30%。特别是在13-15周龄和18- 20周龄，其较高的发病率和死亡率，治疗成本增加，以及延缓猪的生长速度、降低饲料效率和猪群整体的均匀度，出栏时间延长10- 25天等；猪场因该病导致的经济损失也最为严重。该病常用的药物有支原净、泰农、利高霉素、氟甲砜霉素、泰乐菌素、磺胺药、金霉素、恩诺沙星、阿莫西林等，这些药物理论上对发病早期的猪有一定的效果，而在临床实践上，往往是猪群发病多日、免疫力下降，而且病毒、细菌等混合感染严重，此时再用上述药物，效果不佳。 2003年以来，河南广安集团专家组在河南、山东、湖北等地的上百个规模猪场用防蓝灵 防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的进行数据研究，并制定了综合防制措施，取得了显著效果。 一、试验研究依据 1、猪呼吸道疾病综合征综合防制措施的设计思路 1.1、完善强化日常防疫措施，防止病原传播； 1.2、制定和实施猪瘟等主要疾病的免疫程序，防止并发病； 1.3、防蓝灵保健，广谱抗菌、抗病毒、提高机体免疫力，控制并发病。 2、防蓝灵的药理作用及其机制 2.1防蓝灵组方：（1）替米考星、（2）免疫强化剂、（3）特殊营养元素等。本品主要以广谱抗菌、抗病毒和增强机体免疫力以及改善猪群生产性能指标为主，综合防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）。 2.2、现代药理学表明： （1）替米考星对G+、G- 和支原体均有效，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及畜禽
猪繁殖和呼吸障碍综合征 2009年08月24日来源：本站原创我要评论(0)作者：猪场动力 概述 猪繁殖和呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”，本病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。本病是20世纪80年代末发生于养猪业发达国家的一种病毒性疾病，在世界各国引发了空前的“流产风暴”，给世界养猪业造成巨大的经济损失，现已成为规模化猪场繁殖障碍和呼吸道疾病的主要疫病之一。本病于1987年在美国首先发生，随后加拿大也报道了本病，90年代初欧洲开始流行，在我国，本病首先于1995年底在华北地区规模化猪场发生，其后短短几年时问在我国大部分养猪地区流行。本病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合征”、“猪生殖与呼吸综合征”、“蓝耳病”、“猪瘟疫”等。1991年，欧洲学者提出将本病命名为“猪繁殖与呼吸综合征”，1992年在美国的明尼苏达州召开的第一届国际研讨会正式采用该命名，也是世界动物卫生组织(OIE)正式定名。OIE将该病列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病。 病原 猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目、动脉炎病毒科(Arterividdae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。呈球形，有囊膜，直径在40～60nm之间，表面有约5nm大小的突起。核衣壳呈二十面体对称，直径为25～30nm。无血凝活性，不凝集哺乳动物或禽类红细胞。有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，即在亚中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。病毒在氯化铯中的浮密度为1.13～1.19g/mL，在蔗糖梯度中的浮密度为1.18～1.23g/mL。病毒的稳定性受pH和温度的影响比较大。在pH小于5或大于7的条件下，其感染力降低95%以上。在pH7.5的培养液中可于-20℃和-70℃长期保存，在4℃则缓慢失去感染性。干燥可很快使病毒失活。对有机溶剂十分敏感，经氯仿处理后，其感染性可下降99.99％。对常用的化学消毒剂的抵抗力不强。 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组长约15kb，含有9个开放阅读框，基因之间有部分重叠。可在猪原代肺泡巨噬细胞上增殖，猪繁殖与呼吸综合征病毒分为两个型，即以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型和以Lelystad virus(LV株)为代表的欧洲型。猪繁殖与呼吸综合征病毒具有变异性，欧洲和美洲分离毒株之间存在显著的抗原差异性，两者只有很少的交叉反应。序列分析表明北美两地区的分离株存在广泛的基因组变异，而欧洲毒株之间则呈较为保守性。不同毒株之间在毒力和致病力上有明显的差异。我国的猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株均属美洲型，迄今还没有发现欧洲型毒株，同时我国的分离毒株也存在变异现象，现已发现有缺失变异毒株的存在。
分析猪蓝耳病病毒特性，制定控制蓝耳病策略 一、在控病中难以驾驭的蓝耳病病毒特性 1．病毒的持续感染性 蓝耳病病毒（PRRSV）持续性感染是猪蓝耳病在流行病学上的一个重要特征。被感染猪产生的毒血症，相对于其他病毒感染，其病毒血症时间长达28天以上。病毒血症消失后，病毒仍可在组织中存活数月。病毒持续感染包括长时间不间断的低水平的病毒复制，带毒猪的血液、淋巴结、脾脏及肺脏等组织中病毒可存在很长时间，向外排毒达4个月之久。病毒还可通过胎盘和精液传播，其妊娠母猪产下的仔猪可长期带毒，在猪群中表现出持续性感染。PRRSV之所以在体内持续存在,是因为宿主免疫体系缺乏有效的免疫保护。 ２．抗体依赖性效应（ADE） 感染后的PRRSV在巨嗜细胞中复制，巨嗜细胞不能将病毒杀死。当病毒与抗体在巨嗜细胞上结合后，病毒更容易进入巨嗜细胞，这种作用被称为抗体依赖性效应（ADE）。产生这种现象的原因可能是PRRSV在感染早期产生的抗体，非但不具有中和病毒的能力，反而能刺激PRRSV在巨噬细胞中的复制。抗体依赖性增强现象也会降低中和抗体应答的效力，低效价的抗体会增加病毒粒子与巨噬细胞结合机会，从而导致免疫抑制和持续感染。 ３．病毒的免疫原性低 该病毒中真正有抗原作用的是E蛋白(囊膜蛋白),但量非常少。猪产生的大部分抗体是核蛋白,而核蛋白对抗原性的增加几乎没有作用。这是由于产生的有用抗体很少,无用抗体多,且抗体产生很慢造成的。 ４．病毒能逃逸免疫监视 PRRSV诱导的中和抗体产生的时间很晚，要到蓝耳病毒血症消失后或感染后30 d才能检测到中和抗体，而注射猪瘟疫苗后３－４ｄ就能出现有活性抗体。同时，PRRSV中和抗体的能力也很弱。研究发现，对于一般病毒，只需要1个活性抗体就可以中和1个病毒粒子；而对于PRRSV，需要10个活性抗体才能中和1个病毒粒子。中和抗体延缓产生是PRRSV逃逸免疫监视的主要机制，也是PRRSV感染的主要特征。 ５．细胞免疫也无大作为
病猪 猪呼吸道疾病综合症是由细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起的呼吸道疾病的总称，往往是入侵的或正常携带的病原体同环境因素相互作用的结果。主要危害断奶后的保育猪及早期生长的育肥猪，病猪的主要特征为咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，猪只体重迅速下降。 中文名：猪呼吸道疾病综合症英文名：porcine respiratory disease complex 病原学：细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起季节分布：四季 传染病：是传播途径：呼吸道传播 临床表现：咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，只体 重迅速下降 疫苗预防：是 预防措施：加强饲养管理，减少应激提高营养水平，增强猪的抗 病能力做好免疫接种工作 主要器官病变 随着规模化、集约化养生产的迅速发展，病的发生与流行也出现了许多新的特点，以保育发热、咳嗽和呼吸困难为主要症状的疾病在许多规模化场迅速蔓延，由于病因复杂，一些专家将其称为复合病因呼吸道病。 该病是由细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起的呼吸道疾病的总称，往往是入侵的或正常携带的病原体同环境因素相互作用的结果。主要危害断奶后的保育及早期生长的育肥，病的主要特征为咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，只体重迅速下降。该病一旦发生，如果仅采取单一的措施防治，效果往往不太理想。近年来，该病已成为影响养业经济效益的主要疾病，严重影响了养业的发展，给养业造成了巨大的经济损失。
猪呼吸道疾病综合症（PRDC）是猪在一定的应激环境下至少先后感染两种以上病源从而在猪的呼吸系统中表现一系列综合征群。目前猪呼吸道疾病综合征是中国养猪业中最重要以及经济学意义最大的疾病，猪场因为该病导致的经济损失也最为严重。近年来，成为世界各国养猪业疫病防治十分突出生的问题之一。猪呼吸道疾病综合症一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季发病率最高，通常在30－70%，病死率在10－30%，主要发生于保育后期和生长育肥期，特别是在13－15周龄和18－20周龄。发病率30－50%，而死亡率较低。由于发病猪体温升高，所以采食量下降，生长速度缓慢，导致出栏时间延长10－25天。 猪呼吸道疾病综合症 - 呼吸道综合症对养业的主要危害 呼吸道综合症发病期间，常出现继发感染和混合感染，造成在诊断和控制上出现混乱，使药物应用和紧急注射不见明显效果，进一步增加了对呼吸道综合症的控制难度，使发病过程延长，短则1个月，长则2～3个月才能得到基本控制。 呼吸道综合症发病期间，母可能出现流产、产死胎、弱胎等；公可能出现跛行和睾丸炎等，进一步对场生产造成影响。康复生长明显受阻，日增重降低，料重比升高，推迟上市10～30天，甚至出现突然死亡的情况，给场造成严重的经济损失。 发病群的发病率和死淘率均升高。由于呼吸道综合症主要侵袭断奶后仔，而此时群正处于母源抗体保护力下降，自身免疫没有完全建立，消化和呼吸系统的功能尚未健全，又处于断奶应激和更替时期，所以呼吸道综合症发病场的群发病率高达30%～70%，死淘率高达10%～30%。 猪呼吸道疾病综合症 - 病原体 病毒性病原体 猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪流感病毒、猪巨大细胞病毒、包涵体鼻炎病毒等。 细菌性病原体
猪蓝耳病毒 猪蓝耳病毒俗称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 猪蓝耳病毒是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食,妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎,各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病 PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，根据病毒的抗原性，基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型,即欧洲型（LV株为代表株）和美洲型（ATCC-VR2332株为代表株），两种毒株间氨基酸的同源性为78%～81% 猪蓝耳病毒来源： 该病于1987年最早发现于美国。1991年荷兰人Wensvoot等首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时称为Lelystad病毒。随后德国、美国、英国等国家和地区也分离到了该病毒。目前,该病已遍及北美洲及欧洲,在全球范围内传播。郭宝清等(1996)首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV,从而证实了本病在我国的存在。该病传播速度快,尤其在技术进步和经济发达国家,由于猪群密集、流动频繁,更易引起流行。在一个严重流行期过后,此病常为地方流行性,长期危害养猪生产,给养猪业造成巨大的经济损失 猪蓝耳病毒研究成果综述 研究表明 PRRSV感染后，猪体免疫系统参与了病毒导致的疾病发生和感染后的免疫保护作用。PRRSV感染后易引起T细胞亚群和肺泡巨噬细胞在数量与功能上的变化；急性期感染能够促进一些细菌和呼吸道病毒的继发感染；同时，E蛋白能够诱导细胞凋亡，PRRSV感染后N蛋白和M蛋白能够较早诱导机体产生抗体，但无中和作用;E蛋白产生的中和抗体有不定期的保护作用。另外，PRRSV感染后也能引起特异性细胞免疫反应。总结近年来的研究，现将PRRS的免疫学最新研究成果综述如下。 1 抗体依赖性增强作用 PRRSV一个重要免疫学特征是抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement, ADE)。有资料报道，在肺泡的巨噬细胞培养物中，加入一定滴度的PRRSV抗体，可使PRRSV 产量明显增加，甚至会提高10倍～100倍。在某些情况下，免疫产生的抗体不但不能提供保护作用，反而有助于病毒的复制。病毒中加入PRRSV抗体可使病毒在胎儿体内的复制比单独注射病毒显著增强，刚断乳仔猪呼吸道疾病的临床症状比其他较大年龄的猪严重,说明ADE在PRRS发病机制及免疫病理学中起重要作用，但目前对PRRS的发病机理仍不清楚,尽管有许多假设（包括免疫抑制）,但都缺乏足够令人信服的证据。PRRSV在体内外都表现ADE，妊娠后期的胎儿已出现主动免疫应答,但此时形成的抗体对跨胎盘感染的PRRSV的ADE效应,可能是母猪妊娠后期流产的主要原因之一。仔猪对PRRSV易感性高归咎于亚中和水平母源抗体的存在, 这些都提示PRRS致病机制可能涉及ADE。另外，ADE可能是由GP5糖蛋白诱导的。 2 T淋巴细胞与免疫相关细胞 淋巴细胞肩负着细胞免疫功能，其中包括Th细胞的辅助功能，Tc细胞的直接杀伤功能，释放细胞因子诱导激活周围细胞和组织发挥免疫效应的迟发性超敏反应及免疫调节功能。现已发现猪感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中T细胞亚群有异常变化,PRRSV自然感染猪CD2+ 和CD8+细胞数增多,CD4+细胞数量及CD4/CD8比例下降,研究还发现,感染和未感染猪的胸腺细胞亚群没有差异,这说明PRRSV不调节胸腺内T细胞的变化。猪感染PRRSV以后，肺泡巨噬细胞是该病毒的首选靶细胞，占被感染细胞的80%～94%，而使肺泡巨噬细胞的比例明显降低。Rossow等发现攻击PRRSV之后,淋巴组织(如脾动脉周围的淋巴鞘，扁桃体，肠系膜淋巴结，胸腺皮质)中的淋巴细胞减少,外周血中白细胞数降低,这些变化都会导致感染猪易继
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因 ?点击：721 ?日期：2014-06-09 09:17 ?来源：猪价格网 ? 1 PRDC临床症状差异大注意区分病型 许多有关PRDC的报道显示，体温升高、咳嗽和呼吸困难是本病的主要临床症状，但从近几年临床病例观察，许多病例不显示体温升高，而且咳嗽和呼吸困难等症状也不明显，或仅有不引人注意的浅表性呼吸增快或偶而咳嗽，但常有喷鼻、“鼻子不透气”、以至“流鼻血” 等症状。对这些猪进行剖检时，绝大多数肺部有严重以至极为严重的炎症、纤维化、硬化等病变，确诊它为PRDC是无可怀疑的，认为这属于PRDC的慢性型和隐性型，这种病型的病例远远多于急性型，这说明不少地方已成为PRDC的老疫区，并在逐渐扩大。 当前急性型的PRDC常呈爆发形式，多见于新疫区的猪群，可找出明显的激发因素或饲养管理失误因素，它发病初期具有明显的体温升高、咳嗽、发喘以及精神沉郁，采食废绝，或有腹泻、便秘现象。急性型的PRDC在病早期的皮肤常有弥漫性发红或伴有灰色瘀血、出血小斑点。部分慢性或隐性患猪皮肤呈暗红或浅灰色，被毛粗糙逆立，毛孔渗出浅红色液体并干涸结成棕黑色痂皮，附着于毛孔处。也见有极个别猪皮肤呈现苍白贫血现象。 相当数量的病猪于病的中、后期，在耳部、腹部、四肢末端、大腿后侧出现紫红、紫黑色出血斑。部分急性型病猪因治疗失误，如大剂量使用退烧药、抗病毒药和糖皮质激素等，而致体温降至常温或其以下，从而掩盖了热性病的症状，少数因药物的毒副作用发生贫血、黄疸。 在PRDC的临诊中，应特别注意体温不高，呼吸道症状不明显的病猪群，往往发生漏诊或误诊。应对此类病、死猪做剖检诊断，即可迅速得出确切诊断并分清病型，有助于及早采取相应的防控措施。近几年在某些猪群，还发现长势良好的猪，突发高度呼吸困难的同时，伴有瘫痪不能站立的情况，致死率达70%以上的情况，个别猪还有神经症状，对此类猪做剖检可确认属PRDC，但其发生瘫痪的机理有待研究，初步考虑可能与某些病原体的毒素有关。 2 患PRDC发生猝死的原因何在
猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒和圆环病毒是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常以混合感染的形式出现，直接导致猪群的高发病率和高死亡率,控制难度增大，经济损失非常严重。本文通过对一例齐齐哈尔市某猪场病猪病例进行了临床症状分析和实验室诊断，确诊该病例为繁殖与呼吸障碍综合征、圆环病毒和大肠杆菌混合感染。 猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型导致的患病猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统器官功能衰竭的一类疾病的统称。临床上的主要表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，猪呼吸疾病综合征(PRDC)、新生仔猪先天震颤(CT)。不同年龄的猪都可感染猪圆环病毒，病猪可通过鼻液、粪便等排泄物排出病毒，经口腔和呼吸道途径可传染给健康的猪。 猪蓝耳病(PRRS)称为“神秘猪病”、“猪繁殖与呼吸综合征”等，我国将其列为二类传染病。本病是一种高度接触性传染病，呈地方性流行。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。 防治：推荐药物；猪益肽,提高自身免疫力和抗病能力提高5倍-10倍 特点：本品从高免猪血清抗体中分离，冻干，包被得到的特异性血清冻干粉，其具有抗细菌，抗病毒和抗外毒素等多种活性，并具有调理，凝集和沉淀病原体，以及中和病毒的作用.能有解机体发热、炎症和疼痛。该药作用迅速，30分钟内可减轻疼痛 猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起猪的一种急性肠道传染性疾病。临床上主要表现为肠炎、肠毒血症等多种症状。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病3种。这3种疾病可造成仔猪大量死亡或生长发育不良，成为养猪业发展的严重障碍之一
猪场常见呼吸道疾病的诊断与防制 呼吸道疾病一直是困扰猪场的一类重要的病症，其病因复杂，病原多样，流行性广，防治困难，给猪场带来很大损失。影响猪呼吸道系统的主要病原有：猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪圆环病毒2型，猪伪狂犬病毒，肺炎支原体，副猪嗜血杆菌，多杀性巴氏杆菌，胸膜肺炎放线杆菌等；呼吸道疾病的控制应从猪场饲养管理，生物安全和防疫，疫苗免疫，药物预防等方面综合控制。 1．引起猪呼吸道疾病的主要病原，发病特点及诊断防治： 猪瘟病毒（CSFV）： 猪瘟引起的疾病病症包括急性型，慢性型和迟发型。急性猪瘟病猪体温高至℃，呈稽留热，畏寒打堆，腹泻后便秘，病猪鼻端，耳尖，四肢内侧，腹下，外阴等处出现出血变化。母猪可见流产，产死胎等症状。慢性猪瘟主要表现为消瘦，贫血。体温时高时低，生长发育不良，常常成为僵猪。猪瘟对呼吸系统的影响主要表现在能引起呼吸道的卡他性，纤维性和出血性炎症反应，引起免疫抑制并继发其它疾病感染。猪瘟病毒的血清型单一，绝大多数猪场进行了疫苗接种等预防措施，使得典型的猪瘟的发生率得到了有效的控制，目前猪瘟主要表现出非典型性，温和性和散发性，使得猪瘟的鉴别诊断存在一定的困难。而由于各个猪场疾病控制手段存在差异，猪瘟免疫也存在免疫耐受，抗体整齐度和滴度的不一致等，猪瘟的防控仍然存在较大的压力。 猪瘟的主要病理解剖特点有：肾脏表面出血；脾脏边缘出现出血性梗死；回肠和盲肠粘膜上有纽扣状溃疡。确诊还须借助实验室诊断，包括：免疫荧光试验、ELISA、反向间接血凝等，RT-PCR是借助于分子诊断技术对病毒核酸进行
快速诊断的方法，具有快速、敏感的特点。目前猪瘟防控主要通过疫苗免疫，有条件的猪场可以通过检测各阶段猪群的抗体水平，对免疫程序做出相应的调整。 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）： 又名蓝耳病毒，传播迅速，主要通过呼吸道感染，是目前造成猪场生产不稳定的重要病原，蓝耳病毒属于动脉炎科，是一种RNA病毒，由于病原核酸存在变异性并在不同的毒株间存在抗原漂移，使得本病的防控存在很大难度。PRRSV有两个基因型，欧洲型（LV）和美洲型（VR2332）。在我国主要流行美洲型毒株。PRRSV主要通过在猪肺泡巨噬细胞（PAM）内增殖而感染机体，引起各阶段猪群呼吸障碍，肌肉震颤，共济失调，腹式呼吸，耳部及四肢末端发紫等病症，并能引发严重的免疫抑制。在母猪引起怀孕后期母猪流产，产死胎，木乃伊胎儿，或弱仔等。 本病的原发性感染只造成轻微的肺损害，而大部分呼吸症状和病变是由原发性感染后的继发感染所致。主要病理变化为弥漫性间质性肺炎，并伴有卡他性肺炎区。实验室诊断方法包括：血清中和试验（SN）；ELISA检测抗体；病毒分离鉴定；RT-PCR方法等。防制主要通过生物安全措施，定期消毒措施，对引进的种猪进行隔离，待检测结果表明不携带病毒时方可引入基础群。目前，国内外对控制PRRS也研制出了相应的疫苗，但灭活苗激起不了机体免疫应答，弱毒苗又存在的散毒的危险，并且有事实已证明，由于病毒本身的变异性使得疫苗在防控蓝耳病所起的作用上存在很多疑问，专家学者争论不已。但至少做好生物安全措施是绝无坏处的。 猪圆环病毒2型（PCV-2）：
贵州省黔南州2013年猪蓝耳病病毒抗体水平监测犹银俊1倪兴维 1 罗齐英2王兴辉 3 李洁3董保豫1* （1 贵州省黔南州动物疫病预防控制中心贵州都匀558000 2贵州省三都县动物疫病预防控制中心贵州三都558100 3贵州省都匀市动物疫病预防控制中心贵州都匀558000） 作者简介：犹银俊（1982-），女，大学本科，兽医师，从事动物疫病诊断和检测工作。* 通讯作者：董保豫（1963-），男，大学本科，高级兽医师，从事动物疫病防控工作。 摘要：[目的]了解贵州省黔南州猪群高致病性蓝耳病毒免疫水平情况。[方法]于2013年对贵州省黔南州12县（市）1390个场（户）猪群随机采集6887份血样, 应用 ELISA 方法对全州的猪群致病性蓝耳血清抗体水平进行监测调查。[结果]调查结果表明,在受检的1390猪场（户）6887份血清中, 抗体合格数5796份, 总体合格率84.2%，其中种畜场72.1%，商品场88.7%，散养户80.4%。[结论]该调查结果表明,贵州省黔南州蓝耳抗体免疫状况较好,有效的控制了高致病性猪蓝耳病疫情。 关键词：黔南州; 猪蓝耳病; 抗体水平监测 中图分类号 S858.28 文献标识码A 高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome , PRRS)俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)变 异株引起的急性高致死性传染病。近年来，黔南州对高致病性猪蓝耳病疫苗实行了强制免疫措施，从而确保应免密度达100%，保证免疫质量，能够有效地预防和控制猪蓝耳病疫情的发生。为了解黔南州
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS） PRRS，又称猪繁殖与呼吸综合征，猪蓝耳病，猪流行性流产----呼吸综合征，是近年来发现的一种病毒性传染病，给养猪业造成很大的经济损失。本病主要引起母猪繁殖障碍，仔猪肺炎和断奶前后仔猪的死亡率增高，自1987年在美国，1990年在欧洲被发现后传播蔓延速度十分惊人，病毒分离和血清检查表明，PRRS现已传遍世界主要养猪国家。1995年，我国在北京郊区首次暴发了PRRS，1996年以来，国内一些单位进行的流行病学和血清学调查证明，我国大部分省市都已有此病，且血清阳性率都很高，但呈地方性流行特征。特别是2002年大有全国一片蓝的趋势。 针对PRRS的现状，各国都已引起高度重视，近年来在流行病学，免疫学及致病机理，实验室诊断技术，综合防制等方面开展了大量的调查研究工作，PRRS的诊断与防制尤其成为当前兽医研究的一个热点。 （--）病原 PRRSV为一有囊膜的病毒，直径50---65nm,表面相对平滑，立方形核衣壳，核心直径25—35nm。PRRSV对热敏感，这种敏感性提示用于病毒分离的血清和组织样品应保存在-20C下或4C条件下，以保护样品的感染性，用脂溶剂氯仿和乙醚处理以后，PRRSV失去活性。北美和欧洲PRRSV分离株虽然不能凝集进行实验的各种红细胞，但最
近的研究发现，部分毒株及用去污剂预处理的毒株可以表现出对一定动物红细胞的凝集性。 PRRSV具有严格的宿主特异性，最初是用猪肺泡巨噬细胞（PAM）及其它组织的巨噬细胞进行病毒的分离与鉴定的，在体外培养中，PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾细胞（vero）及其衍生的细胞系如MARC—145，CL——2621中生长。 在肺泡巨噬细胞的培养物种加入PRRSV抗体后，可使病毒的复制增强，同样在病毒中加入PRRSV抗体后，其在妊娠期胎儿体内的复制也大为增强，这种现象称为抗体依赖性增强作用（ADE）其原因可能是病毒与抗体形成免疫复合物后借助细胞表面Fc受体与PAM结合，从而促进了病毒进入细胞。ADE在PRRS的发病机理及免疫学上具有重要意义。通过母原抗体获得被动免疫的仔猪，一旦母源抗体水平降至保护水平以下PRRSV就会表现出ADE，从而增强了仔猪的易感性。这种作用对本病的防制带来困难，因为疫苗诱导的抗体可能会增强野毒株在体内的复制，而野毒株产生的抗体也可能会增强疫苗毒的复制。 2 流行病学 最初多呈急性暴发，以后转为慢性和地方性流行。传染源为病猪和带毒猪，病毒感染后157天内可以从扁桃体上分离到病毒，在妊娠后90天易感染，且成为持续性感染猪
猪繁殖与呼吸综合症抗体快速检测试剂盒 ——（胶体金法）使用说明书 【产品名称】 通用名称：猪繁殖与呼吸综合症抗体快速检测试 剂盒（胶体金法） 英文名称：Rapid Anti-PRRSV Test 汉语拼音：Zhu Fanzhi Y u Huxi Zonghezheng Kangti Kuaisu Jiance Shiji He(Jiaoti Jin Fa) 【用途】 用于检测猪血清/血浆/全血样品中猪繁殖与呼吸综合症(又称蓝耳病，Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)抗体。 【实验原理】 猪蓝耳病抗体诊断试剂盒（胶体金法），系采用胶体金免疫层析技术，检测样品（血清、血浆或全血）中蓝耳病抗体的方法。在玻璃纤维纸上预包被金标记灭活猪蓝耳病抗原（Au-Agl），在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被猪蓝耳病抗原(Ag2)和兔抗猪蓝耳病抗体。当检测样品为阳性时，样品中猪蓝耳病抗体与胶体金标记猪蓝耳病抗原（Au-Ag1）结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的猪蓝耳病抗原(Ag2)形成“Au-Ag1-猪蓝耳病抗体-Ag2-固相材料”免疫复合物而凝聚显色，游离金标记抗原则在对照线处与兔抗猪蓝耳病抗体结合而富集显色。阴性样品则仅在对照线处显色。操作简便，快速，结果直观、准确，灵敏度高，容易判定。 【试剂盒组成】 1、猪蓝耳病抗体检测卡50头份 2、说明书1份 3、一次滴管50根 【试验方法】 1、将检测卡从铝箔袋中取出，水平放置并做好标记。 2.、在检测卡的加样孔内加入2滴（70-100ul）待检血清/血浆/全血标本。 3 、20分钟内观察并记录实验结果。 【结果判定】 阳性：对照线区（C）和检测线区(T)各出现一条紫红色线。检测线(T)的颜色越深，表明猪蓝耳病抗体的滴度越高。
防蓝灵在猪呼吸道疾病综合征的应用数据研究 【研究背景】近年来，猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory dis-ease complex，PRDC）在全国呈现地方流行趋势，发病率和死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。也是全球养猪业面临的重大突出问题之一，现已成为中国养猪业中以经济学意义影响最大的疾病。 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一种多因素性疾病，即猪群在亚健康状态下先后感染病毒、细菌、支原体等病原后，从而使猪呼吸系统表现出一系列综合症候群。猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的危害体现在主要发生于仔猪、保育猪和生猪育肥阶段，一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季为高发期，发病率通常在30-70%，死亡率在10-30%。特别是在13-15周龄和18-20周龄，其较高的发病率和死亡率，治疗成本增加，以及延缓猪的生长速度、降低饲料效率和猪群整体的均匀度，出栏时间延长10-25天等；猪场因该病导致的经济损失也最为严重。该病常用的药物有支原净、泰农、利高霉素、氟甲砜霉素、泰乐菌素、磺胺药、金霉素、恩诺沙星、阿莫西林等，这些药物理论上对发病早期的猪有一定的效果，而在临床实践上，往往是猪群发病多日、免疫力下降，而且病毒、细菌等混合感染严重，此时再用上述药物，效果不佳。 2003年以来，河南广安集团专家组在河南、山东、湖北等地的上百个规模猪场用防蓝灵防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的进行数据研究，并制定了综合防制措施，取得了显著效果。 一、试验研究依据 1、猪呼吸道疾病综合征综合防制措施的设计思路 1.1、完善强化日常防疫措施，防止病原传播； 1.2、制定和实施猪瘟等主要疾病的免疫程序，防止并发病； 1.3、防蓝灵保健，广谱抗菌、抗病毒、提高机体免疫力，控制并发病。 2、防蓝灵的药理作用及其机制 2.1防蓝灵组方：（1）替米考星、（2）免疫强化剂、（3）特殊营养元素等。本品主要以广谱抗菌、抗病毒和增强机体免疫力以及改善猪群生产性能指标为主，综合防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）。 2.2、现代药理学表明： （1）替米考星对G+、G-和支原体均有效，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及畜禽支原体均有超强的抗菌活性，且内服吸收快，组织穿透力强，可选择性的聚集肺部等。
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因 核心提示： 有些养猪者常反映，“未见猪有任何症状”而发生突然死亡，也有的是 晚上饲喂时“正常”，第二天清晨发现巳死在圈舍内，上述这种情况以25～ 50kg的猪占比例较多，畜主往往怀疑为急性中毒致死。经我们剖检证实，它的 死亡原因可以确切认定是因患PRDC而致。 1 PRDC临床症状差异大注意区分病型 许多有关PRDC的报道显示，体温升高、咳嗽和呼吸困难是本病的主要临床症状，但从近几年临床病例观察，许多病例不显示体温升高，而且咳嗽和呼吸困难等症状也不明显，或仅有不引人注意的浅表性呼吸增快或偶而咳嗽，但常有喷鼻、“鼻子不透气”、以至“流鼻血”等症状。对这些猪进行剖检时，绝大多数肺部有严重以至极为严重的炎症、纤维化、硬化等病变，确诊它为PRDC是无可怀疑的，认为这属于PRDC的慢性型和隐性型，这种病型的病例远远多于急性型，这说明不少地方已成为PRDC的老疫区，并在逐渐扩大。 当前急性型的PRDC常呈爆发形式，多见于新疫区的猪群，可找出明显的激发因素或饲养管理失误因素，它发病初期具有明显的体温升高、咳嗽、发喘以及精神沉郁，采食废绝，或有腹泻、便秘现象。急性型的PRDC在病早期的皮肤常有弥漫性发红或伴有灰色瘀血、出血小斑点。部分慢性或隐性患猪皮肤呈暗红或浅灰色，被毛粗糙逆立，毛孔渗出浅红色液体并干涸结成棕黑色痂皮，附着于毛孔处。也见有极个别猪皮肤呈现苍白贫血现象。 相当数量的病猪于病的中、后期，在耳部、腹部、四肢末端、大腿后侧出现紫红、紫黑色出血斑。部分急性型病猪因治疗失误，如大剂量使用退烧药、抗病毒药
和糖皮质激素等，而致体温降至常温或其以下，从而掩盖了热性病的症状，少数因药物的毒副作用发生贫血、黄疸。 在PRDC的临诊中，应特别注意体温不高，呼吸道症状不明显的病猪群，往往发生漏诊或误诊。应对此类病、死猪做剖检诊断，即可迅速得出确切诊断并分清病型，有助于及早采取相应的防控措施。近几年在某些猪群，还发现长势良好的猪，突发高度呼吸困难的同时，伴有瘫痪不能站立的情况，致死率达70%以上的情况，个别猪还有神经症状，对此类猪做剖检可确认属PRDC，但其发生瘫痪的机理有待研究，初步考虑可能与某些病原体的毒素有关。 2 患PRDC发生猝死的原因何在 有些养猪者常反映，“未见猪有任何症状”而发生突然死亡，也有的是晚上饲喂时“正常”，第二天清晨发现巳死在圈舍内，上述这种情况以25～50kg的猪占比例较多，畜主往往怀疑为急性中毒致死。经我们剖检证实，它的死亡原因可以确切认定是因患PRDC而致。 此种死亡多发生于两种情况，一种是肺部感染的急性发作，支气管、细支气管和肺泡中被分泌物充满而致缺氧引起急性死亡，死亡猪常在鼻孔流出泡沫性分泌物，有时带有血液，这种情况多见于新发病区(群)，往往是将要爆发PRDC的信号。另种情况是发生于隐性或慢性型猪群，而且大多是由急性型转化而来，剖检可见肺间质、肺泡中有较粘稠的液体存在，以及肺体积增大，重量增加，或呈纤维化、硬化形成的“橡皮肺”，常在应激因素作用下使病情加剧而突然死亡。间质性肺水肿和弥漫性肺间质的纤维化发展过程较慢，生前症状多不明显，常常有潜在性发生的特点，生前症状往往被忽略。
猪呼吸道疾病综合征的综合防治 猪呼吸道疾病综合征（PRDC），它是一种多原因疾病，由病毒、细菌、不良的饲养管理及易感猪群等因素相互作用而引起综合征，表现为呼吸困难，体温40℃反复，四肢末端、耳尖发红，病程长，治疗不及时有较高的死亡率。 1 PRDC的特点 . 1 PRDC与呼吸道的组织结构特点及其防御性密切相关 呼吸道包括上呼吸道（鼻、咽、喉、气管）和下呼吸道（各级气管），几乎都是由软骨作支架，其结构既能保证呼吸道的畅通，又可影响进入气体的速度，有利于颗粒沉着于气管上皮黏膜；呼吸道黏膜中含丰富的血管和黏液腺，有利于吸入气体的温度和湿度的提高，黏液腺分泌出的黏液对吸入气体中的尘埃和微生物具有吸附作用，然后借助上皮细胞纤毛运动向喉的方向移动而咳出。支气管黏液含有有溶菌酶，铁蛋白、溶解素等生化物质具有杀菌性质，这些生化物质能导致吸入呼吸道的微生物生化性失调而失去感染力；在病原微生微和其它不良因素的作用下，呼吸道的免疫防御系统会受到干扰，防御功能下降，从而导致呼吸疾病的发生和扩散。如副猪嗜血杆菌可使猪发生急性化脓性鼻炎和黏液纤毛细胞消失；猪蓝耳病病毒破坏肺巨噬细胞和淋巴细胞；猪伪狂犬病病毒可造成猪呼吸系统和消化系统紊乱，干扰机体的免疫力；猪肺炎支原体破坏及麻醉呼吸道黏膜纤毛系统；猪流感病毒也能破坏呼吸道黏膜纤毛系统，从而损伤呼吸道上皮细胞；病猪发热和厌食也影响机体免疫力。 病因包括原发性感染和继发性感染疾病。 一. 原发性感染包括 1.病毒性：猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪呼吸道冠状病毒所致的。 2.细菌性：传染性胸膜肺炎和传染性萎缩性鼻炎。 3.其它：猪气喘病。 二. 继发感染疾病包括猪肺疫、猪链球菌病、猪副伤寒、猪副嗜血杆菌病等。如果在一个猪场中，发生和流行上述原发性感染疾病，同时又合并发生或继发感染，即可加重发病猪群的临床症状，造成极高的死亡率。除此而外，还有一些其它因素如猪群密度过大，不同日龄猪的混群饲养，来自不同猪或不同来源的猪只饲养在一起，不良的饲养方式，不同季节温度的巨变和猪舍温度变化过大，加之猪群因营养和疾病造成免疫力和抵抗力低下等，都可引起猪场或猪群PRDC的暴发和流行 除此之外，还有一些其它因素如猪群密度过大，不同日龄猪的混群饲养，不同猪或不同来源的猪混养，气温变化过大，加之猪群因营养和疾病造成免疫力和抵抗力低下等。 本病多爆发于6-10周龄保育猪和13-20周龄的生长育成猪，通常称18周龄墙。发病率在25-60%，发病猪的死亡率为20-90%，猪龄越小死亡率越高。病猪表现精神沉郁，采食量下降或无食欲，眼睛分泌物增多，出现结膜炎症状。急性发病体温升高，可发生突然死亡。大部分猪由急性变为慢性或在保育舍形成地方性流行，病猪生长缓慢，消瘦，死亡率、僵猪比例升高。哺乳仔猪以呼吸困难和神经症状为主，死亡率较高；如饲养管理条件较差，猪群密度过大或出现混合感染，发病率和临床表现更为严重。病猪在药物的辅助下逐渐康复，死亡率较低，上述临床症状在不同猪场表现的程度有所不同。 所有病猪均出现不同程度的肺炎。6~10周龄的保育猪剖检可见弥漫性间质性肺炎以及淋巴结的广泛肿大，肺出血、硬变和花斑样病变，个别肺有化脓灶，病猪肺部有不同程度的混合感染，有些病猪有广泛性多发性浆膜炎（胸腔、腹腔很多纤维蛋白渗出，并造成粘连），有些肺部病变与猪支原体肺炎相类似，除肺部出现病变外，小部分病猪可见肝肿大出血、淋巴结、肾、膀胱、喉头有出血点，部分猪出现末端紫色。1~3周发病的哺乳仔猪剖检可见心、肝、肺有出血性病变。