简明基因工程原理
第二章各种工具酶
1、基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的
总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的
酶类。
2、核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。
3、核酸酶的分类：
1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）、DNA酶（Dnase）和底物非专一性核酸酶；
2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclease）；
3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）和非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）
4、宿主控制限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；
5、宿主控制修饰：生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。
6、限制－修饰作用的意义：实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的
保护机制。
7、限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵
8、回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。
9、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割类型：
（1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。
10、位点偏爱（site preference）：某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。
11、星号活性（star activity）：又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点
专一性发生改变。
12、同裂酶 (isoschizomers)：有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生
同样的切割，形成同样的末端。
13、同尾酶 (isocaudamers)：来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶
14、影响限制性核酸内切酶活性的因素
1）DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等；加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶；加大反
应总体积；延长反应时间
2）DNA样品的甲基化程度
识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性，因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌株
3）酶切消化反应的温度
4）DNA的分子结构
5）溶液中离子浓度及种类
6）缓冲液的PH值
15、限制性核酸内切酶的特点
1）识别位点的DNA序列具有回文结构；
2）切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端；
3）错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；
16、限制性核酸内切酶的应用
1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断；
2）用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组；
3）建立DNA的限制酶切图谱；
4）构建基因组文库。
17、限制性酶切图谱：指限制性内切核酸酶的特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特性的反映，所以限制酶切图谱又称物理图谱。
18、DNA聚合酶
DNA聚合酶作用的特点：
（1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA；
（2）接受模板指导；
（3）需要有引物（3’羟基）的存在；
（4）不能起始合成新的DNA链；
（5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端；
（6）催化DNA的合成方向是5’—3’。
缺口平移： 5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进
19、常用的DNA聚合酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ
2、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶
3、T4 DNA聚合酶
4、T7 DNA聚合酶
5、反转录酶等。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
DNA聚合酶Ⅰ特点
活性：5’ 3’聚合低
5’ 3’外切有
3’ 5’外切低
DNA聚合酶Ⅰ的功能：
（1）聚合作用； (2) 3’-5’外切——校对作用； (3）5’-3’外切——切除修复作用；
(4）焦磷酸解作用； (5）焦磷酸交换作用
二、Klenow片段
Klenow酶（大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段）：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获
得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶
1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
活性：5’ 3’聚合低
5’ 3’外切无！
3’ 5’外切低
2.Klenow片段的应用
用途：(1) 填充和补平限制性内切酶切割后产生的凹陷的3′末端(2) 标记DNA片段的末端
(3)催化cDNA第二链的合成 (4) 用于DNA的序列分析
(5)催化与单链配对的寡核苷酸引物的延伸，合成杂交探针
三. T4 DNA聚合酶
1. T4 DNA聚合酶特点
活性：
5’ 3’聚合低
5’ 3’外切无
3’ 5’外切高！
取代反应
2. T4 DNA聚合酶活性的条件:模版、引物、原料dNTP
3. T4 DNA 聚合酶的用途：不论是凸出的5′端还是3′端，只要满足高浓度dNTPs的要求，该酶都
能将末端补平，使DNA便于与街头连接.;可用于3′端凸出DNA的末端标记;3′凹陷末端同位素标记
四. T7 DNA聚合酶
1. T7 DNA聚合酶特点
活性：
5’ 3’聚合高！
5’ 3’外切无
3’ 5’外切高
2. T7 DNA聚合酶的应用
(1）用于拷贝长段模板的引物延伸反应；(2）通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记
五、耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
1、酶活性与热稳定性
2、离子依赖性
3、忠实性
4、抑制剂
5、用途：1）用于DNA测序2）用于聚
合酶链反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增
六、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
TdT的基本用途：1)给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾2)DNA片段3’末端的同位素标记
七、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）
1、反转录酶的基本特性：DNA聚合酶活性；RNase H活性；DNA指导的DNA聚合酶活性；有些反转
录酶还有DNA内切酶活性
2、反转录酶的基本用途：
(1）将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库
(2）对具有5‘突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针
(3) 代替Klenow片段，用于DNA序列测定
20、DNA连接酶
1）定义：催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（1igase）
2）分类：用于共价连接DNA片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的DNA 连接酶：另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4 DNA连接酶。
这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+ [烟酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源辅助因子，后者ATP [腺苷三磷酸]作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。
3）作用机理：1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。
2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。
3、AMP与连接酶的赖氨酸 -氨基相连。
4、AMP随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复
合物。
5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。
4）DNA分子连接的四种形式
1. 粘性末端；
2. 平末端；
3. 平末端加尾；
4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)
(1)Digestion and Ligation
1．粘性末端连接
Problem: (自我环化作用)
解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸
2.平末端连接
粘性末端连接效率高于平末端约100倍！
解决方法：化平末端为粘性末端
3. 平末端连接---同聚物加尾法
（1）末端脱氧核苷酸转移酶
功能：5’至3’单链聚合
作用特点：单链；无模版
作用机理：
a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延
伸末端。
b: 加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现
单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。
c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。
缺点：
当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。
需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。
4. 平末端连接
---衔接物连接法与接头连接法
(1) 平末端的衔接物连接法
衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’ -末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。
(2) 平末端的接头连接法
将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。
21、S1核酸酶：单链核酸内切酶
1）定义：是一种特异性单链核苷酸外切酶，能讲解单链DNA和单链RNA，产生5‘单链核苷酸或寡
核苷酸。
2）S1核酸酶的重要用途：去除DNA片段的单链突端，使之成为平端；去除cDNA合成时形成的发夹
结构；施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物；成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子；修整渐进性删除突变的末端
22、Bal31核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：用于不同长度的删除突变克隆实验；绘制DNA限制性酶切图谱；研究超
螺旋DNA的二级结构和致畸剂引起的双链DNA螺旋结构的变化
23、碱性磷酸单酯酶
碱性磷酸单酯酶基本用途：去除载体DNA5’端磷酸化，防止载体自身环化，减低本底，提高重组率；去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记
24、T4-多聚核苷酸激酶（T4-PNP）
1）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸
2）用途：用于探针的末端同位素标记
第三章基因载体的选择与构建
一、基因克隆与基因重组
基因工程的基本过程是基因克隆，即获得含目的基因的重组体DNA的无性繁殖系。
基因重组是基因工程的核心。所谓基因重组就是在获得目的基因之后，利用限制性内切酶和其
他一些酶进行切割或修饰载体DNA的目的基因，将两者连接，使目的基因插入到可以自我复制的载
体内，再转入受体细胞，达到外源性目的基因在受体细胞内得到正确的表达。
基因重组包括①载体的选择和构建；②载体DNA与目的基因连接这样两个主要工作内容。
二、基因载体
克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞
的作用。
基因工程中的载体应具有如下一些特性：
1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的 DNA自我复制。在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳
定的复制状态和遗传特性。
2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
3）在其 DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点（最好是单一酶切位点）。这些位点位于DNA 复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。某些病毒载
体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助病毒存在时才能进行正常增殖。
4）具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。
三、载体的报告基因（标记基因）
基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿
主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这种具有标志
意义的基因称为报告基因（reporter gene），或标记基因。报告基因通常是处于另一基因下游，并可反映转录及上游基因表达水平的基因。
四、细菌质粒载体
1．质粒的概念
细菌质粒（plasmid）是基因工程中最常用的载体。质粒是细菌染色体外的小型环状双链的DNA
分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒能在细菌内独立自
主地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。有些质粒可以组合在细菌染色体中，随着
染色体复制，称为附加体（episome）。质粒广泛存在于原核细胞。
2．质粒DNA的分子特性
1）常见的三种构型及分子质量：
共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（closed circle DNA， ccDNA），有时会因单链断裂而成为开链环状DNA（open circle DNA， ocDNA）有时双链断开成线性DNA（liner DNA， IDNA）。由于
它们的空间构型不同，这三种DNA分子的电泳行为也不同。根据这一特性，常用琼脂糖凝胶电泳将
它们分开。由于质粒DNA分子构型不同，它们与溴化乙锭结合能力也有差异，造成分子密度不同，
可经氯化艳密度超离心，将三种不同构型的质粒DNA彼此之间或同染色体DNA、RNA分子区分开来。这就是氦化铯密度梯度离心分离、纯化 DNA的原理（图 6.1）。不同种类的质粒的分子最大小不一，小的2kb--3kb，大的可达数百kh。
2）能自主复制
3）对宿主生存并不是必需的
4）都有一个复制起始区和复制起点
5）有一套完整的复制调节结构
3. 质粒的复制和遗传
按质粒复制与宿主菌的相关程度，可以把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒两类。
严密型质粒的复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1～2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止。
质粒在宿主菌内通常可含10～200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。因此，通常选用松弛型质
粒作为基因工程载体，以期在质粒插入外源基因后，可在子代细菌的重组质粒中获得高产量的目的
基因。
些情况下，在大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能又是有害的，此时可使用严密型质粒来
分离、纯化多拷贝的质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因。对策：使用严密型质粒来分离、纯化多拷贝的松弛质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因，也就是用松弛型质粒与严
密型质粒杂交改良；使用温度敏感性载体。
有的质粒带有一种tra基因，该基因产物促进质粒与细菌结合。根据质粒是否带tra基因，质
粒又可分了结合型和非结合型质粒。
4．质粒的报告基因
质粒的报告基因在DNA重组工作中具有重要意义。因为质粒虽然不是细菌生长繁殖所必需的结构，但质料携带有某些遗传信息，所以质粒的存在会赋予宿主细胞一些遗传特征。
抗药性质粒（R因子）能使宿主细胞对某些抗生素或重金属的抗性；F因子决定大肠杆菌的性别，故又称性因子。F因子是一种附加体。还有一些细菌因其标志基因产生细菌毒素，有的发酵糖和产
生硫化氢，等等。有些质粒不赋予或者尚不清楚它赋予宿主细胞何种表型，称为隐性质粒。通过质
粒的标志基因的表达，可使宿主菌呈现一些可观察到的细胞生物学特征。通过质粒赋予细胞的表型
可以识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
基因工程操作中以质粒作载体时，质粒的报告基因中最有应用价值的是抗药性基因，如抗氨茉
青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素或新霉素等抗生素抗性基因。利用这些遗传标志，可用来证明
载体已经进入宿主细胞，可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中挑选出来。
α-互补：LacZ（半乳糖苷酶）有两个主要的亚基，α亚基和ω亚基，前者的DNA序列很短，后
者比较长。α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性。
所以大部分基因工程菌株的基因组上都有ω亚基的序列，但是敲除了α亚基序列，默认只表达ω亚基，不会有半乳糖苷酶活性。但是如果转化的质粒上有连续完整的α亚基序列，那么就会表
达α亚基，产生“α互补”，表现出 LacZ 活性。
LacZ 活性可以用蓝白斑筛选等办法检测，有此活性通常说明 MCS 区域没有插入需要的片断，α
亚基序列仍然保持完整、连续；反之则α亚基序列的连续性被破坏，MCS 区域已经插入东西。
蓝白斑筛选：利用β-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物(X-gal)和诱导物(1PTG)存在时，可
形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，β-半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代，所产生的重组体丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组
载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。
5. 质粒的转座子
在质粒的遗传问题中，还存在转座或易位（transposi-tion）现象。转座子，又叫易位子（tronoposon）是质粒上一段特定的DNA序列，这段序列能从所在的质粒易位至另一质粒或染色体。如抗氨苄青霉素基因（ampr）、抗四环素基因（tetr)抗卡那霉素基因（banr)等等标志基因，都是
易位子。易位子易位给另一复制子后，还可再次易位。
6．质粒的相容性
质粒的不相容性：是指两种不同的质粒不能共存于同一寄主细胞中，也就是说，如果细菌体内已存
在着一类质粒，那么它排斥互不相容的质粒进入细胞。
克服方法：寻找与构建相容质粒和穿梭质粒。
7．质粒的改造
分配结构：有一段DNA与稳定传代有关，具有是复制质粒分配到细胞分裂后子细胞中去的能力，这
段DNA叫做分配结构。
8．质粒载体的条件
理想的细菌质粒载体，除与其他类型载体相同的特点外，还应具备以下条件：
1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。
2）缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌。
3） DNA结构和功能清楚。质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点，在插入外源基因后，不影响质粒自身复制。现在的质粒一般有多克隆位点。
4）插入外源基因的重组质粒，较易导人宿主菌内复制和表达。
5）具有一个或几个报告基因，而且限制性内切酶的单切点恰好在此基因之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。
9，质粒载体的多克隆位点
现在几乎所有的基因工程载体都含有一个人工合成的密集排列的系列多克隆位点，称为载体多克隆位点，或称多接头或称限制性酶切位点库，由常用的限制性内切酶所能识别的序列组成。10．常用的质粒载体
11. 质粒DNA的提取
①细菌培养物的生长：从琼脂平板上挑取一个菌落，接种在培养基如含有适当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒。pUC系列，不必选择性扩增质粒DNA。pBR322，需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，其拷贝数持续递增。
②细菌的收获和裂解：由离心法收获细菌。裂解常用非离子或离子型去污剂、有机溶剂或碱、加热处理、酸酚法等等。
裂解（变性）抽提法常用，经济且收得率高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化，但可因操作不慎会影响纯度，操作较繁。
碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH 高达12．6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当以pH4．8的NaAC高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀而除去，因而提取到质粒DNA。
SDS是离子型表面活性剂，它的功能是：溶解细胞膜上的脂肪及与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；与蛋白质结合成为R1-O-SO3-...R2+蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，否则残留SDS会干扰用RNase去除RNA时的操作。
③质粒DNA纯化：利用质粒DNA相对较小及共价闭合环状这两个性质。具体方法有氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心、离子交层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等。
④质粒DNA保存；用RNase来去除溶液中的RNA，再用SDS与KAC处理后，质粒DNA溶于TE溶液中低温保存。
磷酸缓冲液和硼酸系统等虽然也符合细胞内环境的生理范围（pH），可作DNA保存液，但在作转化实验时，磷酸根离子与Ca2+可产生Ca3 （PO4 ）2沉淀；在DNA酶反应时，不同酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离于浓度，有的则要求低盐浓底，采用Tris－HCI（pH=8）的缓冲液，由于缓冲对是TrisH+ ／Tris，不存在金属离子的干扰，放在提取或保存DNA时，大都采用Tris－HCI缓系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
五、噬菌体载体
1.噬菌体和噬菌体载体的特点
噬菌体是寄生在细菌中的病毒，故又称细菌病毒。噬菌体由蛋白质构成的正二十面体头部和中空的尾部组成，在其头部的蛋白质外壳中含有DNA。
噬菌体的种类：λ噬菌体、单链噬菌体载体、粘性质粒载体。除含大基因的λ和T噬菌体外，
还有一组小分子丝状噬菌体，如 M13等均可改造成为重组DNA的载体。
2.λ噬菌体
λ噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大肠杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两类生长方式。其基因组分为几个不连续的区域，这对基因工程构建噬菌体载体十分有用．每个噬菌体DNA由三个
片段组成：（1）左臂， 19． 6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因， A～J的 12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中A～E5个基因与头部形成有关，G～J5个基因与尾部形成有关。（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的 S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。
噬菌体左右两臂包含了太复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于
J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。
λ噬菌体DNA的两个5‘端为12bp的单链，两端序列互补成为天然的“粘性末端”。λ噬菌体DNA进入宿主菌体后，通过两个末端互补结合而形成粘性末端位（cohesive-end site，简称cos位点）整个DNA分子环化。
3．溶菌性反应与溶源性反应
○1溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，
λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。
②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合(integrate）入细菌的染色质
DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。
4．野生型λ噬菌体的改造
置换型载体：可被外源DNA置换的λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为
置换型载体。这类载体的人 DNA具有一个限制性内切酶的两个切点，两点间为非必需基因区，可以
相应除去一部分，并被外源DNA取代。
插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类λ噬菌体载体称插入型载体。这类人噬菌体DNA已经失去了非必需区，仅保留了EcoRI的单一切点，而且这个切点又位于
报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选。
6．单链噬菌体载体和噬菌粒
单链噬菌体载体：即M13载体。M13是一种细丝状的特异性的大肠杆菌噬菌体，含有6kb～7k的单链环状DNA基因组。
噬菌粒：是带有丝状噬菌体复制起点的质粒。
7．粘性质粒载体
粘性质粒载体（也称柯斯质粒载体或粘粒，cosmid vector）本质上是含有抗性基因、单一克隆位点以及λDNAcos位点（体外包装所必需）的细菌质粒。
六、酵母细胞克隆载体与酵母人工载体
1．酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。
2．酵母附加型质粒（YEps）：是一种罕见的真核细胞质粒，一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及
酵母染色体的选择标记构成，属于自主复制型质粒。
3．酵母整合型质粒（YIps）比较简单，属于穿梭质粒、自我复制型酵母载体，它有四部分组成：1）多克隆位点2）抗氨苄青霉素基因3）大肠杆菌复制原点4）尿嘧啶原养型基因
4．酵母复制型质粒（YRps）与酵母着丝质粒（YCps）
自我复制型酵母载体因在酵母中有自我复制的能力而得名。属于这类载体的有YRp（yeast replication plasmid），YEp（yeast extrachromosomal plasmid）和 YCp（yeast centromereplasmid）
酵母复制型质粒（YRps）将自主复制序列ARS安装到YIp上，就成为YPR，是穿梭质粒，能进行自
我复制。
酵母着丝质粒（YCps）：具有着丝点的酵母着丝粒质粒YRp成为YCp
5.酵母人工染色体（YAC）
6、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC）
7、穿梭质粒：是指能在两种不同的生物中复制的载体，含有不止一个ori、能携带插入序列在不同
种类宿主细胞中繁殖在核细胞和真核细胞中都能复制和表达。
七、植物基因克隆的载体——Ti质粒
1、 Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒(tumor inducing plasmid)，简称Ti质粒。
2、对Ti质粒的改造：
?① 保留T-DNA的转移功能；
?② 取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可
再生植株；
?③ 通过简便的手段可使外源DNA插人T-DNA之中，并随着T-DNA整合到植物染色体上。
第四章目的基因的制取
一、目的基因
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被
分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。
基因分离方法：目前主要应用化学合成法、物理化学法（如密度梯度离心法、单链酶法、分子杂
交法）、鸟枪无性繁殖法、酶促合成（逆转录）法等。
获取目的基因的方法分类：直接分离法、反转录法、聚合酶链式反应法。鸟枪法、人工化学合
成法、其他方法
目的基因的性质：所希望分离或克隆的基因是来于染色体组还是来自cDNA。如果来自真核生物
的染色体组，可称为染色体组拷贝；如果来自cDNA，可称为cDNA拷贝。
二、鸟枪法
这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法（如剪切力、超声波等）或酶
化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这
些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收，称这个方法
为‘鸣枪法”或“散弹枪”实验法。
优点：速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一样的有内含子的真核基因DNA
片段
缺点：1）补平基因“缺口困难”；2）排序拼装麻烦；3）专业性差
步骤：1）组建基因文库；2）检索
三、物理化学法
1.物理化学法分离基因的基本原理：从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对、A和T配对的这一特性，以达到从生物基因组分离目的基因的目的。
2．物理化学法分离基因的主要方法
物理化学法分离基因目前主要有：①密度梯度离心法，②单链酶法，③分子杂交法。
密度梯度离心法：液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC配对的双链DNA片段密度
较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小分布开来。进而通
过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
单链酶法：碱基GC配对之间有三个氢键，比AT配对的稳定性高。当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应用单链特异的Sl核酸酶切除单链，再经氯化格
超速离心，获得无单链切口的DNA。
分子杂交法：单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这就是分子杂交的原理。利用分子杂交的基本原理（如 DNA： DNA配对或者 DNA： RNA配对）既可以分离，又可以鉴别某一基因。
四、化学合成基因
如果已知某种基因的核着酸序列，或者根据某种基因产物的氨基酸序列，仔细选择密码子，可以推导出该多肽编码基因的核着酸序列，就可以将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段
地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段（图5．l）。为了保证定向合成，需要将一个分子的5’端与另一个分子的3’端封闭保护。这种封闭可用磷酸化等方法，必要时可以酸或碱解除封闭。
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循
环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程
又有液相合成和固相合成两种形式。
DNA化学合成的用途：合成天然基因，修饰改造基因，设计新型基因，制备探针、引物、接头。
五、反转录合成DNA：即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成的方法。主要用于合成分子量较大而又不
知其序列的基因。这种方法是以目的基因的mRNA为模板，以dNTP为底物，借助逆转录酶合成与
RNA模板互补的DNA单链，即CDNA，它与RNA模板形成RNA与DNA杂交体。随后又在反转录酶的作
用下，水解掉RNA链，再在DNA聚合酶的催化下，以cDNA为模板合成双链CDNA片段，与适当的载
体结合后转入受体菌，扩增为CDNA文库。然后，采用适当的方法从CDNA文库中筛选出目的基因。
六、聚合酶链式反应
1、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
2、PCR技术的原理
在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成
的DNA引物。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环。每一次循环使特异区段的
基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍。
3、PCR技术的特点
高度的灵敏性，特异性，操作简便易行，用途广泛，
5. 引物设计
①引物长度以20～30bp 为宜，过长过短都会降低特异性，而且过长会增加成本。
②引物碱基要随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象，G+C 含量为45～55%左右。
③引物内部不应含有回文结构，两个引物之间尤其是3`端不应有互补链存在。
④引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性。
⑤引物3`末端碱基原则上要求与模板DNA 配对。
⑥引物5`末端允许有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状态，这不影响扩增特异性。
⑦引物的5`端一般加有适当限制性核酸内切酶的识别序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定
的要求。
6. PCR反应的条件及过程
(1) 具备的条件： Buffer 缓冲液
dNTP 原料
Primer 引物
DNA分子模板
Taq酶 DNA聚合酶
(2) 反应过程
变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间到互补的机会较少。
延伸：在DNA聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在条件下，5`→3`的聚合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应。
7. 影响 PCR的因素
（１）Taq DNA polymerase （２）模板的浓度（３）dNTP （４）Mg2+浓度
（５）变性的时间（６）退火的温度与时间（７）延伸的温度与时间
8. PCR技术的分类
传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列
（１）反向PCR (inverse PCR)：是用反链的互补引物来扩增两引物之外的ＤＮＡ片段。其目的是扩增一般已知目的顺序旁侧的ＤＮＡ。由于反向ＰＣＲ可用于研究与已知ＤＮＡ片段相连的未知染色体序列,因此又被称为染色体步移。
（2）逆转录PCR（RT-PCR)：以RNA为模板, 经逆转录获得与RNA互补的DNA链(即cDNA)，然后以cDNA 链为模板进行的PCR反应。
（3）定量PCR（Q-PCR）：是指用同位素或荧光标记的探针通过自显影术或检测荧光的强度来对扩增的模板进行定量的PCR法。定量PCR法分为两种：DNA-PCR定量和RNA-PCR定量。
复合PCR：复合PCR 就是在一个反应环境中,同时加入多对不同的ＰＣＲ引物,从而获得最大效率的ＰＣＲ产物。
（4）锚定PCR(Anchored PCR) ：又称cDNA末端快速克隆（RACE技术）它是指在一条未知或可变的ＤＮＡ序列末端加上一个已知的“尾巴”,再通过扩增而进行鉴定的ＰＣＲ法。也就是说,如果要扩增的ＤＮＡ序列,只有一端是已知的,而另一端是未知的,则可用锚定ＰＣＲ进行扩增。（5）不对称PCR：:是指用不等量的一对引物来产生大量的单链DNA(ssDNA)的PCR 方法
（6）套式引物ＰＣＲ(Nested Primer PCR)：它是指先后用两套引物进行扩增的ＰＣＲ技术。（7）免疫ＰＣＲ(Immuno-PCR)：是用ＤＮＡ分子作为标记物,在做一般的免疫反应的同时进行ＰＣＲ扩增和电泳分析的免疫实验。
（8）长ＰＣＲ(long PCR)：是指能扩增长度达5ｋｂ以上的ＤＮＡ片段的ＰＣＲ。
（9）热起动ＰＣＲ(Hot start PCR)：是指使ＴａｑＤＮＡ聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的ＰＣＲ，,它主要是可提高反应的特异性。
（10）标记ＰＣＲ(Labeled Primers PCR)：是指用同位素、荧光素等对引物5’端标记后而进行的ＰＣＲ。由于用不同荧光素标记引物后,其扩增产物可带有不同颜色而用肉眼直接观察,所以又称彩色ＰＣＲ。
（11）重组ＰＣＲ(Recombinant PCR)：是指把两个不相邻的ＤＮＡ片段重组在一起的ＰＣＲ法。（12）差向显示ＰＣＲ (Differential Display Reverse Transcription,DDRT-PCR)：是一种用于检测由于发育或生理因素、突变或特定基因单纯转染的反应造成基因表达图谱发生某些变化的特定状态下,上、下调节基因总数的一种方法。
（13）降落ＰＣＲ(Touch down PCR,TD-PCR)：它是用一个反应管或一小组反应管,在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应的ＰＣＲ方法。
（14）兼并引物ＰＣＲ(Degenerate Primer PCR)：是指用设计引物的方法来扩增所有已知顺序核苷酸序列的ＰＣＲ法。
七、基因文库的概念
基因文库：基因工程中，需要将某种生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的 重组体中，以备需要时随时能够应用。这种保存基因组遗传信息的材料，就称为基因文库
（gene library 或gene bank ）。
所谓目的基因的制取过程：就可理解为是从DNA 文库中“钓出”目的基因的过程。
基因文库的类别 ：
1、根据基因类型的不同，基因文库分为：基因组文库（genomic library ） 含有全部基因
cDNA 文库（cDNA library ）含有全部蛋白质编码的结构基因
2、根据基因文库的功能不同把基因文库分为克隆文库和表达文库。
克隆文库：克隆载体
表达文库：表达载体（融合蛋白和天然蛋白表达载体）
蛋白质表达文库、
3、根据载体的不同把基因文库分为质粒文库 、噬菌体文库 、黏粒文库 、人工染色体文库
基因文库的构建流程 基因组文库和cDNA 文库的比较
基因组文库的构建流程 ①
载体的选择和制备；
② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取；③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离；
④ 载体与DNA 片段的连接；
⑤ 转化或侵染宿主细胞。
cDNA 文库的构建流程
利用PCR 技术构建cDNA 文库
① 能够从极其有限的起始材料中构建cDNA 文库。
② 以总RNA 为模板合成cDNA ，无需mRNA 的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。
③ 能够提高cDNA 文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA 克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。
应用差别杂交法构建cDNA 文库：
适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA 克隆；
技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达； 可以通过这两种总mRNA （cDNA 拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA 构建的克隆库进行筛选。
应用扣除杂交法构建cDNA 文库：
不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA 的集合；
用过量的参照细胞mRNA 或cDNA 与目的细胞cDNA 或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA 杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA 或mRNA 可以标记成探针(称减法或
扣除探针)，从上述目的细胞的cDNA 文库中筛选目的克隆；
实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA ，含有的是特异表达的cDNA 克隆及其它一些低丰度mRNA 的cDNA 克隆。
第五章基因与载体连接（重组与克隆）
一、基因重组的概念
基因重组：就是利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA 和目的基因，将两者连接起来，使目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到正确表达。
基因重组是靠T4 DNA 连接酶将适当切割的DNA 即目的基因与其载体共价连接。
二、亚克隆
把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体，例如从重组的λ噬菌体克隆到质粒，
或从某种质粒克隆到另一种质粒，这种过程称为亚克隆，是分子克隆中常用的操作技术之一
三、基因重组对载体的要求
表达型载体：是能够使外源基因在宿主细胞内进行高效表达效率的载体，一般要有强启动子和正确的终止子，能够高效地高拷贝地转录目的基因并且产生稳定的mRNA。
根据目的基因产生的蛋白序列，表达载体又分为融合型表达载体与非融合型表达载体。融合型表达
载体表达融合蛋白，有切割型和非切割型两类。
强启动子组建的高表达载体一般由三类：
第一类，含λ噬菌的pL启动子的质粒。
第二类，含lac启动子的质粒
第三类，含trp启动子的质粒
四、连接前的处理
理想的酶切位点应该符合下列几个条件。
1）位于载体上特定的酶切位点要尽可能少，最好是单一酸切位点，这样才能保证目的基因和载体DNA以最高的机率正确组合。
2）在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。 3）选择的载体必需在连接重组后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变
载体DNA和目的基因DNA的连接，按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
①粘性末端连接法；②平端连接法；③同聚物加尾连接法；④人工接头连接法。
五、粘性末端连接
粘性末端连接中有：①单酶切位点的黏端连接；②双酶切片段的定向克隆；③不同限制酶切位点
的粘端连接连接。
1、单酶切位点的黏端连接：
同一限制酶切位点连接：由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只
要①酶切割产生单链突出的粘性末端（cohensive terminal）。②酶切位点附近的DNA序列不影响
连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火（anneal）时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后
在T4 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。
克服载体自身环化的方法：通过调整连接反应中外源DNA和载体DNA浓度可以限制载体DNA自
身环化。也可用用碱性磷酸酶处理酶切后的质粒载体，此酶能够水解DNA或RNA的5’末端的磷酸
基因，使原来的磷酸基因变成羟基。由于质粒载体两端都是羟基，失去了互相共价连接的能力，也
就不能自身怀化了。而未被碱性磷酸酶处理的目的基因与载体DNA之间依然具有共价连接能力，可
以形成重组分子。
2、双酶切片段的定向克隆
以两种不同的限制性核酸内切酶切割目的基因，食指产生两个不同黏端，对载体同样以这两个
限制性核酸内切酶切割，达到载体DNA和外源DNA片段本身两端为非同源的黏端，此时载体和外源DNA片段都不会发生自身化，而且只能在DNA连接酶的作用下，载体DNA和外源DNA片段已以两端
互补实现DNA定向插入。
定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子的克隆方案叫定向克隆。
定向克隆的连接方式：黏-黏连接；黏-平连接
3、不同限制酶切位点连接
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍末端（compatible end）、也可以产生末端连接。
六、平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和 HpaI切割产生的 DNA片段没有粘性末端，而是平末端（blunt end）。
T4DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。
将目的基因的黏端修饰成平端的方法：添补法和削除法，统称为平-黏端连接法。
添补法：是利用DNA聚合酶Ⅰ大片段将碱基添补到目的基因的黏性末端上。
削除法：是利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因黏性末端的单链突出部分削去，使其成为平末端。
七、人工接头连接
人工接头（linker）是人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，应用相应的内切酶切割，
就可以分别得到互补的粘性末端。
八、同聚物加尾连接（同聚寡核苷酸末端连接）
同聚物加尾连接是利用同聚物序列之间的退火作用完成的连接。是在末端转移酶（terminal transferase，也称DNA转移酶，脱氧核苷酸酶）的作用下可以在DNA片段的3’羧基端合成低聚多
核苷酸（添加同聚物造成延伸部分）。如果把所需的DNA片段接上低聚腺嘌呤核苷酸（dA），而把
载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸（dT），那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA
连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。
第六章重组DNA导人受体细胞
一、克隆与导入方法
克隆：外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆(cloning)。
基因转移：将重组子导入宿主细胞的操作步骤。
重组DNA导入受体细胞的方法，大体上可划分为：
①转化(transformation)，是将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌遗传性状发生改变的方法；
②转染(transfection)，是将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法(其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法)；
○3微注射技术(microinjection)，是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法；
④电转化法(。lectro-tranformation)
⑤微弹技术(microneblast technique也叫高速粒子轰击法microprojector或基因枪技术geneblastertechnique)；
⑥脂质体介导法(liposome mediated gene trans-fer)；
⑦其他方法，很多高效的新颖的导入方法如快速冷冻法、碳化硅纤维介导法等正在研究并达到实用
的水平。
二、受体细胞
受体细胞也叫宿主细胞。受体细胞有原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。
枯草杆菌有许多优良性质：①枯草杆菌具有芽孢形成能力，易于保存和培养；②枯草杆菌具有胞
外酶分泌—调节基因，能使基因表达产物分泌出来，从而可以明显简化表达产物的提取和加工处理；
⑧枯草杆菌是不产生内毒素的极为安全的细菌。现在已成功地在枯草杆菌中表达人的β干扰素、人的胰岛原C肽、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VP1抗原等。
三、大肠杆菌宿主菌
这是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的大肠杆菌应该具备以下性能：
1)感受态细胞(competent cell)，这是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌。
2)限制性内切酶缺陷型，即外源DNA进入受体菌不致于被降解。
3)DNA重组缺陷型，即可以保持外源DNA在受体菌内的完整性。
4)符合安全标准，即这类大肠杆菌不适于在人体内生存，不适于在非培养条件下生存，在非培养
条件下其DNA容易解体。同时，其DNA不容易转移，其质粒只能在宿主细胞中进行复制。还要便于
监视。
四、受体细菌的感受态
所谓感受态，就是细菌吸收转化因子(周围环境中的DNA分子)的生理状态。
关于细菌的感受态本质与存在的两种假说：①局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生
变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。②酶受体假说—感
受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。
制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用一定浓度的CaCl：处理对数生长期的细菌。
也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚砜、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化已胺钴处理制备感受态细胞。
转化：指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。
转染：指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。M13噬菌体DNA导入大肠杆菌是常用转染的方法。
感染：噬菌体进入宿主细菌，病毒进入素族细胞中繁殖就是感染。
五、转化反应
转化是使重组体DNA分子在热休克(heat shock)的短暂时间的内被导入受体。
由于重组DNA分子没有甲基化，为了避免重组DNA被摄入细胞后被菌体内酶的降解，必须选用限
制系统即酶缺陷型菌株。
DNA分子转化的复杂过程如下：①吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。②转入—双
链DNA分子解链。单链DNA进入受体菌，另一链降解。③自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制
成双链环状DNA。④表达—供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。
六、磷酸钙沉淀法
磷酸钙-DNA共沉淀法(calcium phosphate-DNA co-precipitation，简称磷酸沉淀法，属于转
染法，能把外源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但磷酸钙沉淀法的转染效率远远不如另一种转染法—体外包装法。
七、体外包装转染法
所谓体外包装，就是在体外将重组体DNA放置到噬菌体的蛋白质外壳里，然后通过正常的噬菌体
感染过程，将它们导入宿主细胞。将重组入噬菌体包装成噬菌体颗粒，使其能够感染细菌，并在宿
主菌体内扩增和表达外源基因。
以入噬菌体作载体进行基因克隆有以下优点：①具有很大的外源DNA包容能力，对外源基因的克
隆效率高；②有非常高的入重组子回收率，特别适用于建立基因文库；③具有正性筛选性质。
八、共转化
将外源基因与报告基因共同导人感受态真核细胞的方法，称作“共转化”(cotransfonnation)。九、电转化
电转化(electro transformation)，也有人称作高压电穿孔法(high-voltage electroproration
简称电穿孔法electro-proration)，可用于将DNA导入真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细
胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)。
电转化技术的主要优点：对于磷酸钙DNA共沉淀法以及其他技术难以转化的细胞系，电穿孔法仍
可适用。但是要决定特定细胞系的最佳转化条件必须进行大量工作。
十、基因枪法（微弹技术）
基因枪法，又叫微弹技术或粒子轰击细胞法，属于DNA包被的微注射法。这种技术把DNA包被
到金粒或钨粒中，然后把这些粒子加速推进靶细胞。基因枪的作用是用压缩气体（氦或氮）动力，
产生一种冷的气体冲击波进入轰击室，把粘有DNA的细微金粉打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细
胞质等层层构造达到细胞核，完成基因转移。
利用氦气、金粉的主要原因：密度大，穿孔易；活性小，不易毒害细胞
十一、微注射技术
微注射技术有人称为直接显微注射(direct microinjec-tion)。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的研究。
微注射技术的优点是可以不让DNA与pH值较低的内质体(endosome)等细胞区室相接触，但缺点
是它所导入的DNA的量很低，难以进行生化分析。微注射法对动物细胞外的其他细胞只是作为一种
方法，用以建立整合有目的DNA拷贝的细胞系。
十二、脂质体导入法
脂质体(liposome人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂
质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。脂质体是由脂质双分子层组成的环
形封闭囊泡，无毒、无免疫原性。
脂质体制备法有多种，但包裹基因和脂质体方法主要是REV法(Sioka等1978)和去污剂控制透析
法(Philippot等1983)两种。
十三、转化酵母菌
1、利用酵母的原生质球进行转化；
2、利用锂盐进行转化，对酵母菌转化常用醋酸锂方法。
第六章重组体的鉴定与文库筛选
第一节重组体转化子的鉴定与文库筛选
一、转化子与筛选的概念
转化子(transformant)就是掺入或导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。筛选：将重组体的转化子细胞或转染噬菌体群体从其他细胞群体中分离出来，并要鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这一个过程即为筛选(screening)或选择(selection)。
杂交探测：是一种利用能和目的基因序列互补的DNA或RNA片段为探针，通过分子杂交手段找出带有目的基因的DNA片段的实验方法。
二、筛选方法的类型
筛选方法分类：如遗传学方法、免疫学方法、分子杂交方法
从角度划分：
直接筛选(direct selection)是针对载体携带某种或某些报告基因和目的基因而设计的筛选方法，特点是直接测定基因或基因表型。
间接筛选是不要直接鉴定基因，而是利用其他方式，例如利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用，进行对重组体的筛选。
表达表型筛选法：筛选真核细胞表型，通常采用一种依赖DNA序列表达可辨认的表型产物的方法。
免疫筛选法：用抗体作探针识别和分离编码决定簇的DNA序列，能最大限度地检测任何种类DNA表达的多肽抗原决定簇；用于基因组克隆株DNA序列文库用质粒或噬菌体构建。
第二节遗传检测筛选法
一、根据载体表型特征的直接选择法
抗药性标记及其插入失活选择法：这是利用载体DNA 分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。
-半乳糖苷酶显色反应选择法
很多载体都有携带一段细菌的LazcZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α-肽，利用α互补眼里，根据蓝色还是白色的菌落，容易获得目的序列的克隆。
二、根据插入序列表型特征的直接选择法
原理：1.弥补缺陷：转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
2. 增加新性状：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
第三节物理检测法
一、凝胶电泳检测法
原理：利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。
1、凝胶阻滞实验：（EMSA）是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。
2、DNaseⅠ足迹试验：蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经
酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影
图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA
上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。
二、限制酶切分析法
原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。
三、R-环检测法
R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）定义：用外源基因的mRNA与重组载体杂交，在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
第四节核酸杂交法
原理：1. 核酸杂交：重组克隆与探针杂交；2. 检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
一、以寡核苷酸探针筛选目的基因
基因探针（probe）又称“寡核苷酸探针”，简称“探针”，就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
二、原位杂交
根据检测重组子DNA 分子的核酸杂交技术原理，提出了菌落原位杂交技术。与其他分子杂交技术不同，该
项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶解及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落。
三、Southern印迹杂交
Southern印迹试验(Southernblot)又称凝胶电泳压印杂交技术，该法利用硝酸纤维素膜或经特殊处理的滤纸或尼龙膜具有吸附DNA的功能，先作DNA片段的凝胶电泳，并将凝胶电泳中的DNA区带吸附到膜上，然后直接在膜上进行同位素标记核酸探针与被测样品之间的杂交，再通过放射自显影对杂交结果进行检测。
四、Northern印迹杂交
Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。
第五节免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交。利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
一、各种标记的免疫化学检测法：放射性抗体检测法和免疫沉淀检测法
放射性抗体检测法
1.抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式及步骤
免疫沉淀检测法：检测分泌型产物。
1. 原理：抗原——抗体凝集反应。
2. 方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
二、以单克隆抗体探针筛选目的基因
1）用抗体探针筛选质粒载体的cDNA表达文库
2）用抗体探针筛选λgtⅡ载体cDNA表达文库
3）用不同抗体探针同时克隆多个基因
三、表达载体产物免疫化学检测法
第六节 DNA-蛋白质筛选法
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。
酵母双杂交体系原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-
binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
蛋白截短试验：通过体外转录和翻译偶联的系统使突变的等位基因表达，从而可以筛选出与链中止有关突变的试验方法
第七章目的基因的表达
一、原核生物基因表达的特点：
①原核生物只有一种RNA 聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分:操纵基因(operator)、启动子(promotor)及其他有调控功能的部位。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。
④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA 合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
⑥在大肠杆菌mRNA 的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S 核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列，即SD 序列，而真核基因则缺乏此序列。
对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。
1．启动子
?启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，没有启动子，基因就不
能转录。
?启动子有两个保守区：
（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5-10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。
（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。
2．S-D序列
mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。
3．终止子
?在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的
功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。
?共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称
结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。
4．衰减子
?衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。
?在原核生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽
链合成的起始点，同RNA分子的5’P末端间的距离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前的不转译的mRNA区段，叫做前导序列。
二、原核生物的转录调控
三、原核生物基因的转录后调控
四、真核生物基因表达的调控
五、基因工程中的基因表达
1、制约目的基因表达的因素
外源基因在受体细胞内表达与否以及表达水平受到很多因素的制约，其中主要有：①外源基因是否插入在正确的阅读框架；②目的基因的有效转录(如启动子的作用)；○3mRNA的有效翻译(如S-D 序列等作用)；④转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程，
2、阅读框架
阅读框架是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。
3、启动子与转录的影响
所谓启动子，是指一段DNA序列，它能指导RNA聚合酶连接在DNA模板上，并开始合成mRNA。
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
名词解释——水处理篇 1．生化需氧量（Bio-Chemical Oxygen Demand，简称BOD），表示在有氧条件下（20℃），由于微生物（主要是）的活动，可降解有机物被微生物降解所需的氧量，常以BOD表示，5d生化需氧量BOD5和20d 生化需氧量BOD20。 2．化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，简称COD），在酸性条件下，以强氧化剂（我国法定用重铬酸钾）将有机物氧化为CO2和H2O所消耗的氧量，以COD cr 表示。如采用高锰酸钾为氧化剂，则写作COD Mn,由于高锰酸钾氧化作用较弱，测出的耗氧量值较低，故又称耗氧量，以OC表示。 3．总需氧量（Total Oxygen Demand，简称TOD），有机物主要组成元素是C、H、O、N、S等，被氧化后，分别产生CO2、H2O 、NO2和SO2，所消耗的氧量称为总需氧量。TOD 以燃烧法测定，仅需几分钟。 4．总有机碳（Total Oxygen Carbon，简称TOC），总有机碳TOC是目前在国内外使用的表示污水被有机物污染的综合指标，它所显示的污水中有机物的总含碳量。 5．富营养化（Eutrophication）在缓慢流动的湖泊、水库、内海等水域，由于生物营养元素的增多，促进了藻类等浮游生物的繁殖。大量繁殖的藻类会在水面形成密集的“水花” 或“红潮”。藻类的死亡和腐化又会引起水中溶解氧的大量减少，使水质恶化，鱼类死亡，严重时会使水体消亡，这一过程称之为富营养化。 6．水体自净（Water Self-Purification）：污染物在进入天然水体后，通过物理、化学和生物因素的共同作用，使污染物的总量减少或浓度降低，层受污染的天然水体部分地或完全地恢复原状，这种现象称为水体自净。按其作用机制可分为物理净化、化学净化和生物净化。 7．氧垂曲线（Dissolved Oxygen Sag Curves），有机污染物排入水中后，经微生物降解而大量消耗水中溶解氧，使河水亏氧；另一方面，空气中的氧通过河流水面不断地溶入水中，又会使溶解氧得到恢复。所以耗氧与复氧同时存在，污水排入河水后，DO曲线呈悬索状下垂，故称氧垂曲线。 8．水质评价（Water Quality Assessment），是根据监测取得的大量水质资料，对水体水质所作出的综合性定量评价。其目的是：对不同地区各个时期水质的变化趋势进行分析； 分析对工农业和生态系统的影响；分析对人体健康的影响。水质评价包括现状评价和预测评价，所用方法主要有综合指数法和水质质量系数法。
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．碱裂解提取溶液I中的葡萄糖的作用________________、_______________、______________________________。 5．同一质粒不同构型在电泳过程中迁移速率为。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。7．第一个分离的限制性切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性切核酸酶是_____________。 8．限制性切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。11．EGTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。 15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．琼脂糖凝胶的分辨力与胶浓度的关系是。 19．如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为________________。20．影响限制性切酶活性的因素________________、________________、________________、________________。 21．连接反应的实用温度为________________。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。
一、选择题 1、为使得好氧反应器正常运行，污水中所含的营养物质应比例适当，其所需要的主要营养物质比例为BOD5:N:P=【】。 A.10：5：1； B.1:5:10； C.100:5:1； D.1:5:100。 2、根据曝气池内混合液的流态，活性污泥法分为【】两种类型。 A.好氧与厌氧； B.推流和完全混合式； C.活性污泥和生物膜法； D.多投水法和生物吸附法 3、一般情况下，污水的可生化性取决于【】 A、BOD5/COD的值 B、BOD5/TP的值 C、DO/BOD5的值 D、DO/COD的值 4、污泥回流的目的主要是保持曝气池中一定【】 A、溶解氧 B、MLSS C、温度 D、pH 5、在生物滤池中，为保证微生物群生长发育正常，溶解氧应保持在一定的水平，一般以【】为宜 A、1-2mg/L B、2-4mg/L C 4-6mg/L D 6-8mg/L 6、好氧微生物生长的适宜pH范围是【】 A、4.5-6.5 B、6.5-8.5 C、8.5-10．5 D、10.5-12.5 7、城市污水厂，初次沉淀池中COD的去除率一般在【】之间 A、10%-20% B、20%-40% C、40%-60% D、60%-80% 8、某工业废水的BOD5/COD为0.5，初步判断它的可生化性为【】 A较好B可以C较难 D 不易 9、生物膜法产泥量一般比活性污泥的【】 A多 B少C一样多Ｄ不确定 10、下列四种污水中的含氮化合物，【】很不稳定，很容易在微生物的作用下，分解为其他三种。 A.有机氮； B.氨氮； C.亚硝酸盐氮； D.硝酸盐氮
11、城市污水处理厂污泥的主要成分是【】。 A.无机物； B.简单有机物； C.有机物； D.砂砾 12、污泥中温消化控制的温度范围为【】。 A. 20℃~ 25℃； B. 25℃~ 30℃； C. 30℃~ 37℃； D. 40℃~ 45℃ 13、传统活性污泥法的曝气时间为【】。 A.4~6h； B.6~8h； C.16~24h； D.8~10h； 14、厌氧消化池中的微生物种类主要属于【】 A.好氧菌； B.厌氧菌； C.兼性菌； D.厌氧菌和兼性菌 15、下列不属于污水二级处理工艺的是【】 A.SBR； B.氧化沟； C.A2/O； D.混凝沉淀 16、环境保护“三同时”制度是【】。 A.同时审批、同时施工、同时投产 B.同时设计、同时施工、同时投产 C.同时设计、同时改造、同时投产 D.同时审批、同时改造、同时投产 17、斜板沉淀池【】。 A不宜作为二次沉淀池 B.不宜作为初次沉淀池 C.适宜已建污水处理厂扩大处理时采用 D.适宜作为初次和二次沉淀池 18、一般活性污泥系统选择在【】阶段工作。 A 适应期 B 对数期 C 平衡期（稳定期） D 衰亡期 19、污泥沉降比是一定量的曝气池混合液静止【】后，沉淀污泥与混合液的体积比。 A 10分钟 B 30分钟 C 60分钟 D 100分钟 20、活性污泥净化废水主要阶段【】。 A 粘附 B 有机物分解和有机物合成 C 吸附 D 有机物分解 21、国内外普遍采用的BOD培养时间是【】天。 A 5 B 20 C 1 D 30 22、如果二沉池大量翻泥说明【】大量繁殖。 A 好氧菌 B 厌氧菌 C 活性污泥 D 有机物 23、曝气池有臭味说明【】。 A 进水pH值过低 B 丝状菌大量繁殖 C 曝气池供养不足 D 曝气池供养充足
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
污水水质指标 目录 作用及意义 污水所含的污染物质千差万别，可用分析和检测的方法对污水中的污染物质做出定性、定量的检测以反映污水的水质。国家对水质的分析和检测制定有许多标准，其指标可分为物理、化学、生物三大类。 一、物理性指标 （1）温度 许多工业排出的废水都有较高的温度，这些废水排入水体使其水温升高，引起水体的热污染。水温升高影响水生生物的生存和对水资源的利用。氧气在水中的溶解度随水温的升高而减小，这样，一方面水中溶解氧减少，另一方面水温升高加速耗氧反应，最终导致水体缺氧或水质恶化。 （2）色度 色度是一项感官性指标。一般纯净的天然水是清澈透明的，即无色的。但带有金属化合物或有机化合物等有色污染物的污水呈各种颜色。将有色污水用蒸馏水稀释后与参比水样对比，一直稀释到二水样色差一样，此时污水的稀释倍数即为其色度。 （3）嗅和味 嗅和味同色度一样也是感官性指标，可定性反映某种污染物的多寡。天然水是无嗅无味的。当水体受到污染后会产生异样的气味。水的异臭来源于还原性硫和氮的化合物、挥发性有机物和氯气等污染物质。不同盐分会给水带来不同的异味。如氯化钠带咸味，硫酸镁带苦味，硫酸钙略带甜味等。 （3）固体物质 水中所有残渣的总和称为总固体（TS），总固体包括溶解物质（DS）和悬浮固体物质（SS）。水样经过过滤后，滤液蒸干所得的固体即为溶解性固体（DS），滤渣脱水烘干后即是悬浮固体（SS）。固体残渣根据挥发性能可分为挥发性固体（VS）和固定性固体（FS）。将固体在600℃的温度下灼烧，挥发掉的量即是挥发性固体（VS），灼烧残渣则是固定性固体（FS）。溶解性固体表示盐类的含量，悬浮固体表示水中不溶解的固态物质的量，挥发性固体反映固体中有机成分的量。 水体含盐量多将影响生物细胞的渗透压和生物的正常生长。悬浮固体将可能造成水道淤塞。挥发性固体是水体有机污染的重要来源。
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
污水处理中常用的专业术语 1、排水工程：收集、输送、处理、再生处置污水和雨水的工程。 2、排水系统：收集输送、处理、再生处置污水和雨水的设施以一定方式组合成的总体。 3、排水制度：在一个地区内收集和输送城市污水和雨水的方式。他有合流制和分流制两种。 A.合流制：同一管渠系统收集和输送城市污水雨水的排水方式。 B.分流制：用种不同管渠系统分别收集和输送各种城市污水和雨水的排水方式。 4、排水设施：排水工程中的管道、构筑物和设备等的统称。 5、城镇污水：城镇中排放各种污水和废水的统称，它由综合生活污水、工业废水和渗地下水三部分组成。在合流制排水系统中、还包括被截的雨水。 A.城镇污水系统：收集、输送、处理、再生和处置城镇污水的设施以一定方式组成的总体。 B.城镇污水污泥：城镇污水系统中产生的污泥。 C.旱流污水：合流制排水系统晴天时输送的污水。 D.生活污水：居民生活活动所产生的污水。主要是厕所、洗涤和洗澡产生的污水。 E.综合生活污水：由居民生活污水和公共建筑污水组成。 F.工业废水：工业生产过程中产生的废水。 G.入渗地下水：通过管渠和附属构筑物破损处进入排水管渠的地下水。
6、总变化系数：最高日最高时污水量与平均时污水量的比例。 7、径流系数：一定汇水面积内地面径流水理与降雨量比值。 8、排水泵站：污水泵站、雨水泵站和合流污水泵站系统。 9、一级处理：污水只进行沉淀和生物处理的工艺。 一级处理就是去除污水中的漂浮物或部分悬浮物状态的污染物，调节PH值、减轻污水腐化过和后续工艺的负荷。一级处理又称物理处理或机械处理，常用的方法有筛滤法、重力沉降法、浮力上浮法、预气法等。污水经一级处理后，能去除悬浮固体（suspended solid，简称SS）50%~60%、BOD5（biochemical oxy-gen demand,生物需氧量BOD）20%~30%。污水经过一级处理还不能达到排放标准。 10、二级处理：污水进行沉淀和生物处理。 二级处理又称生化处理，一级处理是二级处理的预处理，二级处理能大幅度的去除污水中呈胶体和溶解状的有机污染物，BOD处理可达90%以上，BOD降低至20~30mg/L，污水得到净化，达到国家规定的排放标准。 11、三级处理：三级处理又称深度处理，三级处理是为进一步去除二级处理未能去除的污染物，其中包括微生物以及未能降解的有机物或磷、氧等可溶解性无机物。完善的三级处理由除磷、脱氮、去除有机物、病毒和病原菌、细小悬浮物等单元过程组成。根据三级处理出水具体去向，其处理流程和组成单元可以不同。 12、活性污泥法：污水处理的一种方法。该法是在人工条件下，对污水中的各类微生物群体进行连续混合和培养，形成悬浮状态的活性污
名词解释 生物技术、RAPD、酶单位、载体、质粒、基因工程，退火，基因组文库，cDNA文库，PCR，转化，DNA甲基化，RFLP，ISSR，植物基因工程，感受态细胞，受体细胞，工具酶、YAC、探针、AFLP、基因芯片、质粒、基因治疗、基因打靶、基因疗法、原位杂交、分子标记、核酸分子杂交 选择题（单选和多选） 1、第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 2、Ⅱ型限制性内切核酸酶( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 3、在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA 4、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是( ) (a)OCDNA>SCDNA>LDNA (b)SCDNA>LDNA>OCDNA (c)LDNA>OCDNA>SCDNA (d)SCDNA>OCDNA>LDNA 5、黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体( ) (a)它具有COS位点，因而可进行体外包装(b)它具有质粒DNA的复制特性 (c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应 6、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为( ) (a)染色体DNA断成了碎片(b)染色体DNA分子量大，而不能释放 (c)染色体变性后来不及复性(d)染色体未同蛋白质分开而沉淀 7、根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中 ( )属cDNA文库 (a) YAC文库(b) MAC文库(c) 扣减文库(d) BAC文库 8、关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确( ) (a)具有可诱导性(b)具有可转移性 (c)细菌生长的任何时期都可以出现(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的 9、在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( ) (a)诱导宿主的α肽的合成(b)诱导宿主的ω肽的合成 (c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂 10、基因工程发展史上理论上的三个重要发现是（）
水处理常用术语 RO 纯水系统水处理制剂 RO pure water system water treatment preparation 采用具有良好的协同处理效应的复合制剂，能有效防止水垢、微生物粘体的形成、提高系统的脱盐率、产水量；延长RO膜的使用寿命。 Adopt the compound preparation having fine coordination treatment effect , can have an effect to prevent scale , the microorganism from gluing body's formation , improve systematic desalination rate , produce a water yield; Prolong RO film life time. Risr-RO386 专用阻垢剂 Risr-RO386 special use hinders the dirty agent Risr-RO387 专用清洗剂 Risr-RO387 special use washes an agent 循环冷却水处理 Circulation chilled water system 保证冷却水塔、冷水机台等设备处于最佳的运行状态，有效的控制微生物菌群、抑制水垢的产生、预防管道设备的腐蚀。达到降低能耗、延长设备的使用寿命的目的。专案制定水处理方案，采用专业的复合水处理制剂及完善的技术服务体系。 Guarantee cooling water tower , cold water machine the platform waits for equipment to be in optimum operation state , effective the group controlling the microorganism bacterium , the creation restraining scale , the corrosion taking precautions against pipeline equipment's. Achieve the life time reducing energy consumption , prolonging equipment's purpose. Special case for investigation works
基因工程原理复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章 DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ● 1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ● 2．真核生物中转录和翻译分开进行； ● 3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ● 4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能
第一章 1.1水质与水质指标 一单选题 1、污水呈酸碱性，一般都用_____表示。 A．pH值 B．COD C．SS D．TOC 2、引起富营养化的物质是_____。 A．硫化物、氮 B．氮、磷 C．磷、有机物 D．有机物、硫化物 3、生化需氧量指标的测定，水温对生物氧化反应速度有很大影响，一般以_____为标准。 A．常温 B．10℃ C．30℃ D．20℃ 4、城市污水一般是以_____物质为其主要去除对象的。 A.BOD B.DO C.SS D.TS 5、污水的物理处理法主要是利用物理作用分离污水中主要呈_____污染物质。 A.漂浮固体状态 B.悬浮固体状态 C.挥发性固体状态 D.有机状态 6.生活污水的pH一般呈_____。 A.中性 B.微碱性 C.中性、微酸性 D.中性、微碱性 7、污水最后出路有三种，下面_____不在其中。 A．排放水体 B．灌溉农田 C．重复使用 D．自然蒸发 8．COD是指_____。 A．生物化学需氧量 B．化学需氧量 C．总需氧量 D．高锰酸钾需氧量 9、测定水中微量有机物的含量，通常用C 指标来说明。 A.B0D5 B.COD C.TOC D.DO 10.水中无机物含量测定，通常用C 指标来说明。 A.0、C B.DO C.SS D.BOD5 11.B005指标是反映污水中，B 污染物的浓度。 A.无机物 B.有机物 C.固体物 D.胶体物 12.二级处理的主要处理对象是处理 D 有机污染物。 A.悬浮状态 B.胶体状态 C.溶解状态 D.胶体，溶解状态 13.二级城市污水处理，要求BOD5去除 C 。 A.50％左右 B.80％左右 C.90％左右 D.100％ 14.生活污水中的杂质以C 为最多。 A.无机物 B.SS C.有机物 D.有毒物质 15.生物化学需氧量表示污水及水体被 D 污染的程度。 A.悬浮物 B.挥发性固体 C. 无机物 D.有机物 16.排放水体是污水的自然归宿，水体对污水有一定的稀释与净化能力，排放水体也称为污水的 A 处理法。 A.稀释 B.沉淀 C. 生物 D.好氧 17.水体如严重被污染，水中含有大量的有机污染物，DO的含量为D 。 A.0.1 B.0.5 C.0.3 D.0 18．一般衡量污水可生化的程度为BOD／COD为 C 。 A．小于0．1 B．小于0．3 C．大于0．3 D．0．5—0．6 19.关于氧垂曲线，说法不正确的是（A）
化学水处理 1、地表水；是指存在于地壳表面,暴露于大气的水,是河流、冰川、湖泊、沼泽四种水体的总称,亦称“陆地水”。 2、地下水；是贮存于包气带（包气带是指位于地球表面以下、潜水面以上的地质介质）以下地层空隙,包括岩石孔隙、裂隙和溶洞之中的水.地下水存在于地壳岩石裂缝或土壤空隙中。 3、原水；是指采集于自然界，包括并不仅限于地下水，水库水等自然界中能见到的水源的水，未经过任何人工的净化处理。 4、PH；表示溶液酸碱度的数值，pH=-lg[H+]即所含氢离子浓度的常用对数的负值。 5、总碱度；水中能与强酸发生中和作用的物质的总量。这类物质包括强碱、弱碱、强碱弱酸盐等。 6，酚酞碱度；就是用酚酞作指示剂所测得的碱度（滴定终点pH＝8.2～8.4）。 7、甲基橙碱度；就是以甲基橙作指示剂所测得的碱度（滴定终点pH＝3.1～4.4）。 8、总酸度；酸度指水中能与强碱发生中和作用的物质的总量，包括无机酸、有机酸、强酸弱碱盐等。 9、总硬度；在一般天然水中，主要是Ca2+和Mg2+，其它离子含量很少，通常以水中Ca2+和Mg2+的总含量称为水的总硬度。 10、暂时硬度；由于水中含有Ca(HCO3)2和Mg(HCO3)2而形成的硬度，经煮沸后可把硬度去掉，这种硬度称为碳酸盐硬度，亦称暂时硬度。 11、永久硬度；由于水中含CaSO4（CaCl2）和MgSO4（MgCl2）等盐类物质而形成的硬度，经煮沸后也不能去除，这种硬度称为非碳酸盐硬度，亦称永久硬度。 12、溶解物；以简单分子或离子的形式在水（或其它溶剂的）溶液中存在,粒子大小通常只有零点几到几个纳米,肉眼不可见,也无丁达尔现象.用光学显微镜无法看到 13、胶体；若干分子或离子结合在一起的粒子团,大小通常在几十纳米至几十微米,肉眼不可见,但会发生丁达尔现象.小的胶体粒子无法用光学显微镜看到,大的可以看到.
基因工程原理 1、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（20分） 重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转 化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养， 获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 2、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？ （2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？ （20分） (1)其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低， 及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 (2)出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。 3、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样研究该基因的功能？请提出具体的 研究方案。（20分） 基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP 等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)
污水处理中常用的专业术语 一、水质指标 1、COD-化学需氧量（chemical oxygen demand ） 在规定条件下，用氧化剂处理水样时，在水祥中溶解性或悬浮性物质消耗的该氧化剂的量。计算时折合为氧的质量浓度。 2、BOD-生物需氧量（biochemical oxygen demand ） 在特定条件下，水中的有机物和无机物进行生物氧化时所消耗溶解氧的质量浓度 3、TN-总氮 有机氮、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐的总和。 4、TP-总磷 正磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐、聚合磷酸盐和有机磷酸盐的磷含量之和。 5、SS-总悬浮物 水中总的悬浮物含量。 二、污水处理方法 1、污水处理 污水处理是指用物理、化学或生物方法，或几种方法配合使用以去除废水中的有害物质。 排放到污水处理厂的污水及工业废水可利用各种分离和转化技术进行无害化处理，如下：
生物法 利用微生物的代谢作用，使废水中的有 机污染物氧化降解成无害物质的方法， 又叫生物化学处理法，是处理有机废水 最重要的方法 活性污泥、生物滤池、 生活转盘、氧化塘、厌 气消化等 2、废水的生物处理法： 是基于微生物通过的作用将复杂的有机物转化为简单的物质，把有毒的物质转化为无毒的物质的方法。根据在处理过程中起作用的微生物对氧气的不同要求，生物处理可分为好氧生物处理和厌氧生物处理两种。 3、好氧生物处理： 是在有氧气的情况下借好氧化细茵的作用来进行的。细菌通过自身的生命活动——氧化、还原、合成等过程，把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物获得生长和活动所需能量，而把另一部分有机物转化为生物所需的营养物质，使自身生长繁殖。 4、厌氧生物处理： 是在无氧气的情况下，借厌氧微生物的作用来进行。厌氧细菌在把有机物降解的同时，需从CO2、NO3－、PO43－等中取得氧元素以维持自身对氧元素的物质需要，因而其降解产物为CH4、H2S、NH3等。 三、污水处理工艺 （一）污水生化（生物）处理法分类
0、基因工程的技术基础和理论基础 1）理论基础： 40年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，明确了物质基础 50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递 60年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。 2）技术基础： 60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，用于DNA分离和检测 60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割 70年代中期，实现DNA分子的核苷酸序列分析技术 80年代实现体外重组DNA并进入宿主细胞 1、基因工程研究的主要内容或步骤 ①从生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； ②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组DNA分子； ③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要物质。 2、三位一体的基因概念 ①基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。 ②基因是染色体上的实体 ③基因象链珠(bead)一样，孤立地呈线状地排列在染色体上 基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。 3、一位一体的基因概念 基因是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。 4、顺反子假说 1个顺反子决定1条多肽链。能产生1条多肽链的是1个顺反子，Cistron是基因的同义词。在一个顺反子内，有若干个突变单位：突变子(muton)。在一个顺反子内，有若干个交换单位：交换子（recon）。 5、全同等位基因 在同一基因座位(locus)中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因(homoallele)。 6、非全同等位基因 在同一基因座位（locus）中，不同突变位点（site）发生突变所形成的等位基因(heteroallele)。 7、重叠基因的概念及其生物学意义 概念： 大多数由一条DNA序列组成的基因，仅有编码一种蛋白质的功能(尽管基因在两端有非编码区，并且在编码区内有内含子)。但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。 生物学意义： a)原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因信息)； b)提高蛋白质的疏水性,以增强生物体自然选择的适应性。