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生化大实验报告

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生化实验报告[键入文档副标题]

实验一多酚氧化酶(PPO)的分离与提取

一、实验目的

1、本实验以马铃薯为主要的实验材料,通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

2、通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用,以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验原理

多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶,位于质体、微体内,参与植物抗体的调节,属于末端氧化酶的一种。在植物体受到机械损伤和病毒感染后,PPO催化酚与氧氧化成醌,使组织形成褐变,对PPO弄得的测定便是通

过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。

在蛋白质水溶液中,加入少量的中性盐,如硫酸铵、氯化钠等,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶;而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程,该现象称为盐析。蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性,可以依据此分离蛋白,硫酸铵分级便依据此原理,首先在蛋白质溶解度最高时,离心取上清,去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白,之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶,去除尚未析出的杂蛋白,从而达到纯化目的蛋白的目的。多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高,而在75%

硫酸铵溶液中沉淀量最高,由此可分离提取多酚氧化酶。但使用硫酸铵分级,分离后的产物中会有铵根离子残留,如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时,残留的铵根离子会造成测定时高于实际值,同时该样品之后会用于离子交换层析纯化,所以需要去除其中的离子,故需要透析去除其中铵根离子。

多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行,在此PH值下,磷酸缓冲液的缓冲能力最强,故选择使用其作为缓冲液,其中加入的EDTA为螯合剂,聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌,本身为固体颗粒,不需要溶解。

三、仪器与试剂:

(1)马铃薯200g

(2)试剂:

溶液A:0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%的聚乙烯比咯烷酮)

固体硫酸铵

溶液B:0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,0.005M 氯化镁)

实验器械与仪器设备:

烧杯,玻璃棒,量筒,天平,高速冷冻离心机,离心杯,透析袋,植物组织匀浆器,过滤纱布。

四、实验步骤:

1、将马铃薯切削块,按照1g:1ml的比例加入0.03M磷酸缓冲液,放入植物组织匀浆器,将马铃薯充分粉碎使PPO从细胞中释放出来。

2、将处理过的溶液用四层纱布过滤,去除溶液中的大颗粒固性物质,装离心瓶配平后,12000转离心10min。

3、离心后取上清液162ml,查表知欲得到0℃硫酸铵40%饱和度需要加入无水硫酸铵29.92g,称量加入溶液中,用玻璃棒轻轻搅拌,避免因为机械剪切导致蛋白变性,0℃静置一小时。

4、静置一小时后,装离心瓶,调平后离心机12000转离心10min,弃沉淀得上清液192ml,查表知欲得0℃硫酸铵75%饱和度需要再加无水硫酸铵35.90g,称量后加入,用玻璃棒轻轻搅拌,0℃静置2小时沉淀。

5、将透析前样品抽500ul作为粗酶样品。

6、两小时后,装离心瓶,调平后12000转离心10min,弃上清液,沉淀加10ml溶液B复溶,装透析袋绑好透析过夜。

实验二离子交换柱层析纯化多酚氧化酶(PPO)及

活性测定

一、实验目的

1、本实验拟通过离子交换层析分离纯化PPO的操作,掌握该层析的基本原理、运用及操作技术。

2、通过纯化PPO检验之前提取PPO的实验是否成功。

3、通过本实验学习并掌握传统的蛋白质活性及浓度测定的方法、原理及相关仪器设备的操作。

二、实验原理

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为3部分;高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合, 形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交

换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用, 称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为;

阳离子交换反应: ( R—X - ) Y + + A + ( R—X - ) A + + Y +

阴离子交换反应: ( R—X + ) Y - + A - ( R—X + ) A - + Y -

R代表离子交换剂的高分子聚合物基质, X - 和X + 分别代表阳离子交

换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y + 和Y - 分别

代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子, A + 和A - 分别代表溶液中的离子基团。

当A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其他一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电

荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。

PPO是通过DE52弱碱性阴离子交换剂分离纯化的,过程大体为:阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大到顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目的。

分离过程中的蛋白质浓度是通过考马斯亮蓝技术测定的,考马斯亮蓝法( Bradford法)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色,该染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A5 95 n m,与蛋白质浓度成正比。

PPO催化各种酚与氧气氧化为醌,以邻苯二酚为底物,在0.2 M磷酸氢二钠-0.1 M 柠檬酸缓冲液pH=8.5的反应体系中,PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌,在分光光度计410 nm处使反应体系的OD值发生变化,通过OD值上升的度数变化确定PPO的酶活力大小。

三、仪器与试剂:

试剂:0.02M Tris-HCl 缓冲液PH7.4(内含0.001M EDTA),考马斯亮蓝试剂,柠檬酸缓冲液,邻苯二酚,氯化钠;聚乙二醇;DEAE-纤维素DE52;

设备:试管与试管架、烧杯、玻璃棒、滴管等、层析柱,PH试纸,恒流泵,梯度混合仪,核酸蛋白检测仪,GL-20C高速冷冻离心机,酶标板、分光光度计、分析天平、容量瓶、移液管和试管等。

四、实验步骤

(1)将经过透析的PPO蛋白粗酶溶液放入50ml离心管中12000转4℃离心10min,取上清液备用,以此确保无固性物质,防止其破坏胶体。

(2)将层析柱洗净,并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水,将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中,匀速添加防止出现多个柱面,直到柱面到达8cm左右时停止。

(3)装好的层析柱上端连接恒流泵,下端用一烧杯承液,恒流泵首先连接缓冲液,利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来,约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值,直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

(4)将粗酶液上柱,用微量移液器缓慢加入,加样过程中连续,保证液面在柱面上1cm处,防止液体低于柱材破碎,共上样10ml。

(5)用含氯化钠(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCl缓冲液PH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。

(6)每5ml一个试管收集并进行编号,首先收集4管,编号1-4,为杂蛋白,之后收集16管样品,编号5-20,为可能含有PPO的样品。

(7)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul考马斯亮蓝溶液,室温下静置2min,测其OD595值并进行记录,该数据说明其中粗蛋白含量。

(8)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min,测其OD410值并进行记录,该数据说明其中多酚氧化酶的含量。

(9)对上一实验中的粗酶提取物样品重复第(7)(8)两步,测其粗蛋白含量及比活力。

(10)0-100 μg/ml标准曲线的绘制:准确吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白标准液,分别放入10ml的试管中,加5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,将溶液混匀,2min后在分光光度计594nm处测定其吸光值,空白以去离子水或蒸馏水代替。吸光值为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。

(11)样品中蛋白浓度的测定:要求待测样品中的蛋白浓度范围为

1-1000μg/ml之间,若浓度过高,需要对其进行适当的稀释,再用制作标准曲线的方法对样品进行测定,测定的0.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白浓度。

五、结果及分析

粗酶提取物比活力:OD410=0.192

纯化倍数=纯化后比活力/粗酶比活力:0.201/0.192=1.047

结果分析:

图1-1 多酚氧化酶(PPO)离子交换柱纯化结果

多酚氧化酶(PPO)通过离子交换柱纯化的结果如图1-1,横坐标为洗脱体积,对应1-20号试管,共总洗脱体积为100ml。纵坐标为OD值,其中蓝色OD595Z 折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化,数值高低表示其中粗蛋白含量多少;红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化,数值高低表示其中酶比活力的高低。所有OD值除0值外,均在0.1-0.8之间,无异常值,无需稀释后在测定。

考马斯亮蓝测定结果中,2号试管即5-10ml的OD595值最高为0.605,为杂蛋白中蛋白含量最高的。而在含有目的蛋白的5-20号试管中,13号试管OD595值最高为0.386,;4-7管OD595最低为0,该OD值说明的是其中的粗蛋白含量,其中共有5个蛋白峰,分别为2号,10号,13号,15号,17号管,其中2号管为杂蛋白峰。杂蛋白洗脱为1-4号试管,通过折线图可观察到,在4号管处,OD595值为0,并在之后5-7管仍然为0,可认为大部分杂蛋白榆次已经几乎洗脱,柠檬酸缓冲液结果也证明了这一观点。

柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中,从10号试管开始出现不为0,此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积,为45-50ml,其浓度一直处于增加状态,直至17号试管处,此处有峰值为0.201,之后酶活性下降明显,与20号试管处其值仅为0.3,可认为PPO以全部洗脱,故PPO洗脱体积共50ml。

纯化倍数为1.047,相较于纯化之前,纯化效果不明显,这与预期的纯化结果相差较多。出现纯化效果不好的原因较多,主要原因可能存在于三个方面:①在多酚氧化酶提取过程中存在问题。可能搅拌时措施不当导致了蛋白质变性,并且有时会碰到烧杯壁,搅拌溶解过程出现的很多气泡都说明很可能是这一步导致了最后纯化倍数偏低。因为全班检测结果均不是很良好,甚至部分组纯化倍数低于1,由此怀疑可能是透析袋存在问题,因孔径太大导致目的蛋白流出,导致纯化倍数降低,这可能是因为原本透析袋口径就过大或在处理过程中导致用力挤压或拉伸导致透析袋孔径变大。②可能是在离子交换柱分离过程中操作不当,灌柱的过程中,柱面高度或许不够高,上柱过程中柱面上方的液体体积过多,导致柱体过密,分离效果不好。③测定OD值时出现问题,在使用时,仪器读数变化极大,每次测定时很不稳定,甚至有20孔全部没有读数的情况出现,可能是使用

人数过多,时间过长,导致仪器温度升高,测定值不准导致的。以上三个方面均有可能导致纯化倍数过低,但是无法确认是某一方面单独导致,还是综合因素引起纯化倍数过低,只能在下次实验进行过程中多加注意,避免类似问题再次发生。

实验三分子筛层析纯化多酚氧化酶(PPO)一、实验目的

通过分子筛纯化多酚氧化酶(PPO),学习分子筛纯化原理,了解分子筛层析纯化步骤。

二、实验原理

分子筛层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分子筛层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒内部具有立体网状结构形成许多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出;而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。这样样品经过分子筛层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。

三、仪器与试剂:

试剂:0.02M Tris-HCl 缓冲液PH7.4(内含0.001M EDTA)配置是X10倍浓缩液1000ml;葡萄糖凝胶SePHadex G-200、兰葡萄糖、考马斯亮蓝试剂、柠檬酸缓冲液,邻苯二酚。

设备:试管与试管架、烧杯、玻璃棒、微量移液器、层析柱、PH试纸、恒流泵、核酸蛋白检测仪,GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A大容量低俗冷冻离心机、酶标板。

四、实验步骤

(1)将二中的OD410值最高的17号试管与5ml一中离心后的粗酶提取物混合后离心5分钟,取上清液加入兰葡萄糖,搅拌使其完全溶解后备用。

(2)将层析柱洗净,并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水,将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中,匀速添加防止出现多个柱面,直到柱面到距层析柱柱口1.5-2cm左右时停止。

(3)装好的层析柱上端连接恒流泵,下端用一烧杯承液,恒流泵首先连接缓冲液,利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来,约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值,直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

(4)用1000ul微量移液器将(1)中加入兰葡萄糖后的样品加入层析柱中,

加样过程连续,保证不因为人为因素导致样品分层。

(5)每5ml一个试管收集并进行编号,共收集20管,并记录蓝色于何时开始出现,何时结束

(6)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul考马斯亮蓝溶液,室温下静置2min,测其OD595值并进行记录,该数据说明其中粗蛋白含量。

(7)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min,测其OD410值并进行记录,该数据说明其中多酚氧化酶的含量。

五、结果及分析

蓝色于第5管中出现,于第14管中消失,即于20ml开始出现,于70ml时消失。

纯化倍数:纯化后比活力/纯化后比活力=0.227/0.192=1.18

结果分析:

图1-2多酚氧化酶(PPO)分子筛层析纯化结果

(1)多酚氧化酶(PPO)通过分子筛层析纯化的结果如图1-2,横坐标为洗脱体积,对应1-20号试管,共总洗脱体积为100ml。纵坐标为OD值,其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化,数值高低表示其中粗蛋白含量多少;红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化,数值高低表示其中酶比活力的高低。无高于,0.8的数值,无需稀释后在测定,低于0.1的数值,认为其含量过低,近似于0处理。

(2)考马斯亮蓝测定结果中,6号试管即25-30ml的OD595值最高为0.356,其中粗蛋白含量最高蛋白含量最高的。1-4管与15-20管OD595最低为0,这与蓝色出现与消失的试管号相符,该折线图有其中共有2个蛋白峰,分别为6号,1-号管,蛋白峰和峰值明显低于离子交换层析结果,纯化结果较好。

(3)柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中,从6号试管开始出现不为0,此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积,为45-50ml,其浓度一直处于增加状态,直至10号试管处,此处有峰值为0.227,为酶峰,之后一直下降,与14号管处完全消失。此比活力为0,227高于之前的0.201,纯化效果较上一步好。

(4)纯化倍数为1.18,相较于纯化之前,纯化效果不明显,但较离子交换层析结果有一定这与预期的纯化结果相差较多。该步奏出现纯化效果不好的原因主要问题应存在于两个方面,其一是离子交换层析柱中的多酚氧化酶活性本身就不是很高,分子筛纯化后,提升幅度有限;其二,仪器问题可能仍然会干扰本不实验中的蛋白质以上两个方面综合起来,导致纯化倍数过低,在下次实验进行过程中会多加注意,避免类似问题再次发生。

实验四胰酶分离提取

一、实验目的

1.本实验拟通过从猪胰脏中之美胰酶结晶实验,掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。

2.为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

二、实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2 +的存在下,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的相对分子质量约为24000,其等电点约为PH值为8.9,胰蛋白酶的相对分子质量与其酶原接近( 23300),其等电点约为PH值为10.8,最适PH值为7.6~8.0,在PH值为3时最稳定,低于此PH值时,胰蛋白酶易变性,在PH 值>5 时易自溶。Ca2 +离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子、有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块茎(如土豆、白薯、芋头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时,一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来,然后再根据等电点的沉淀原理,调节PH值以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析出。经溶解后,以极少量活性胰蛋白酶激活,使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活),被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白。

三、仪器与试剂:

(1)冻猪胰脏

(2)PH2.5乙酸酸化水、2.5mol/LH2SO4 、5mol/LNaOH、硫酸铵、氯化钙、2mol/LNaOH、0.8mol/L,PH值为9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8 mol/L硼酸溶液,加80ml0.2mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH计检查校正、0.4mol/L PH值为9 .0硼酸缓冲液( 稀释1 倍即可)、0.2mol/LPH值为8.0硼酸缓冲液:取70ml0 .2 mol/L 硼酸溶液,加30ml0.5mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH值计校正)、2 mol/LHCl、0.01mol/LHCl、BAEE-0.15mol/L、PH值为8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化钙)。

(3)恒温水浴锅、离心机、组织粉碎机、PH试纸、烧杯、离心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。

四、实验步骤:

(1)将冷冻的猪胰脏在冰水冲洗下剥离其上的脂肪与结缔组织,减少杂蛋白含量。

(2)将洗净的胰脏放入组织粉碎机后加2倍体积的冷却的PH2.5-3.0的乙酸酸化水后进行粉碎。

(3)检测提取液中PH,若高于3.0则用10%乙酸调节之后再4℃过夜。

(4)将过夜后的样品用四次纱布过滤

(5)将滤液在12000r/min下离心十分钟,取上清液

(6)在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度,静置两小时

(7)将溶液装离心瓶12000r/min离心十分钟,弃上清液

(8)将沉淀用10ml去离子水复溶后装透析袋透析过夜备用

实验五卵清蛋白分离提取

一、实验目的

通过对鸡卵粘蛋白的分离提取,掌握蛋白质分离提取的主要技术和操作,以及相关仪器设备的操作。

二、实验原理

鸡卵黏蛋白存在于鸡蛋清中,对以担保有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵黏蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1,故此可以用鸡卵黏蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。

鸡卵黏蛋白是糖蛋白,分子量为28000,但糖成分上有差别。有四种不同组分,等电点的范围为PH3.9-4.5,280nm的消光系数为:A=4.13(1%,1cm)。同时鸡卵黏蛋白在中性或酸性溶液中,在25-30℃较高温度下或高浓度的脲中都很稳定,而且本身耐机械剪切,可以根据此设计卵清蛋白提取实验。

三、仪器与试剂:

(1)新鲜鸡蛋两只

(2)10%TCA(用固体NaOH调PH至1.05~1.10,需50ml)、5M HCL、5M NaOH、冷丙酮、BAEE-0.15mol/L、PH值为8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化钙)

(3)恒温水浴锅、离心机、PH试纸、烧杯、离心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。

四、实验步骤:

(1)取蛋清50ml,至于烧杯中,外用温水浴25-30摄氏度,在不断搅拌条件下,缓慢加入等体积三氯乙酸-丙酮(1V:2V),会立即出现大量白色絮状沉淀,加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4℃放置过夜。

(2)过夜后样品用四层纱布过滤,去除部分杂质。

(3)将滤液中加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白,4℃静置2h。

(4)将静置后的溶液装离心瓶12000R/min离心10分钟,取沉淀。

(5)将沉淀溶于10ml去离子水,复溶后装透析袋过夜透析备用。

实验六亲和层析纯化胰酶

一、实验目的

1. 去除混杂的与胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶,如胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和弹性蛋白酶。

2.通过将胰蛋白酶抑制剂——鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作,以了解亲和层析的基本原理,掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。

二、实验原理

亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性(分子间通过某些次级键结合,如范德华力,疏水力,氢键等,在一定条件下又可解离)。如:酶和底物(包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物)的结合。特异性的抗体-抗原(包括病毒、细胞)、激素与其受体、载体蛋白,基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合,植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。

在实际工作中,只要把被识别的分子,称为配基(ligand ),在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上( matrix,如SePHarose4B ) 制成亲和吸附剂,然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子,这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留,只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后,再改变洗脱条件,使结合在配基上的物质解离下来。

本实验为了纯化胰蛋白酶,采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵黏蛋白作为配基制成亲和吸附剂,从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵黏蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂,对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用,但不抑制糜蛋白酶。在PH值为7~8的缓冲溶液中卵黏蛋白与胰蛋白酶牢固地结合,而在PH值为2~3时,又能被解离下来。

因此,采用鸡卵黏蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白的胰蛋白酶制品,比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10~20 倍以上。

三、仪器与试剂:

试剂:2.5g干重的葡聚糖凝胶SePHadex G-75、0.05M NaI04溶液50ml、纯化的鸡卵黏蛋白87.5mg、5%K2CO3、0.27GKBH4(溶于20ml水)、0.1M Tris-HCl PH7.5(含0.5M KCl,0,05M CaCl2)200ml、粗胰蛋白酶液约50ml、0.1M甲酸钠-0.5M KCl PH2.5 100ml、考马斯亮蓝。

仪器:试管与试管架、烧杯、玻璃棒、微量移液器、层析柱、PH试纸、恒流泵核酸蛋白检测仪,GL-20C 高速冷冻离心机、DL-7A大容量低俗冷冻离心机、酶标板。

四、实验步骤:

(1)将葡聚糖凝胶Sephadex G-75溶胀洗涤数次。

(2)缓慢搅拌,加入0.05M NaIO4溶液50ml,搅拌30min。

(3)蒸馏水洗涤数次,抽干备用。

(4)将二中制备的鸡卵黏蛋白,加入(3)中活化的葡聚糖凝胶。

(5)加入5%K2CO3后,调PH至7.5-9.0,缓慢搅拌2h。

(6)将0,27g KBH4溶于20ml水,缓慢搅拌并加入(5)中再静置过夜备用。

(7)将层析柱洗净,并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水,将静置后的(6)溶液轻轻倒入层析柱中,匀速添加防止出现多个柱面,直到柱面到达8cm左右时停止。

(8)装好的层析柱上端连接恒流泵,下端用一烧杯承液,恒流泵首先连接缓冲液,利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来,约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值,直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。

(9)将一中透析后的溶液装离心瓶离心后,取上清液缓慢加入灌好的层析柱中

(10)上样结束后恒流泵上端接PH7.5缓冲液洗杂蛋白,用试管接杂蛋白样,每管5ml,共取样6管,编号1-6,总体积30ml。

(11)6管杂蛋白洗脱完成后恒流泵上端接PH2.5缓冲液解吸附,洗脱胰蛋白酶,用试管承接滤液,每管5ml,共采样15管。

五、结果及分析

结果分析:

图2-1 胰蛋白酶亲和层析考马斯亮蓝粗蛋白含量折线图

猪胰蛋白亲和层析结果如图2-1所示,图折线为加入考马斯亮蓝后的OD595值,为其中蛋白含量,所有值均小于0.8,不需要稀释后再测定。从图中可知有共有3个蛋白峰,分布为1号试管,3号试管和11号试管,其中1号试管与3号试管是用PH7.5缓冲液进行洗涤的,此时胰蛋白酶与固定相以共价键结合,不会洗脱,股此时试管中应为杂蛋白,曲线整体为下降趋势,于6号试管处有杂蛋白最低值,此时OD595值为0.044,可近似认为杂蛋白已经被洗脱。7-21号试管是用PH2.5解吸附后收集的,其内主要蛋白质来源是之前被固定相吸附的胰蛋白酶,由于之前杂蛋白洗脱程度良好,可认为其中几乎没有杂蛋白,故11号试管为胰蛋白酶蛋白峰,峰值为0.367,之后一直下降,于20号试管处OD值为0,认为所有胰蛋白酶全部洗脱,总洗脱体积为65ml。

因为胰蛋白酶来源是猪胰脏,故其为未激活胰蛋白酶,同时实验过程中未进行激活步骤,故无法确定其中的酶活性,也无法分析纯化倍数。

实验七SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质

纯度

一、实验目的

1.对多酚氧化酶的纯度进行鉴定以及进行分子量的测定。

2.通过本实验,学习掌握SDS-PAGE测定蛋白质纯度以及分子量的鉴定方法。

二、实验原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺加入去污剂SDS,因为大多数的蛋白质能与SDS按一定比例结合,使各种蛋白质的SDS-蛋白质复合物带上相同密度的负电荷,它的电量大大超过了蛋白质分子原有的,因而消除了蛋白质原有的电荷差别,使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量,而与所带电荷无关,在一定条件下,蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

三、仪器与试剂:

1、实验一中多酚氧化酶粗酶、透析后、离子交换柱纯化后、分子筛纯化后样本,实验二中胰酶粗酶、透析后、亲和层析样本,实验三中DNA、质粒、λDNA样本。

2、丙稀酰胺(Acr母液):30%Acr (Acr/Bis),10%的SDS溶液,10%的过硫酸铵溶液,四甲基乙二胺(TEMED),1.5M Tris,PH8.8,1.0M Tris,PH6.8,10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS,加水溶解定容至1000ml,pH8.3,0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油,巯基乙醇及溴酚兰,0.15%考马斯亮蓝R250,溶于脱色液,50%的甲醇,7%的冰醋酸的水溶液,标准分子量蛋白。

3、电泳仪,垂直电泳槽,微量移液器

四、实验步骤

1、用两块电泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏胶),垂直放置。

2、将配制好的分离胶溶液,倒入,滴加入无离子水,待凝胶聚集后,倒出无离子水,用吸水纸吸干,倒入浓缩胶,再插入梳子。

3、分别向样品离心管中,按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液,再沸水浴中加热3-5min,取出待用。

4、用微量注射器分别吸20ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。

5、点样结束后,调节电泳仪电流到10mA(2-3mA/em),保持电流稳定不变,进行电泳。

6、当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时,停止电泳。

7、电泳完毕后,取出凝胶板,浸入染色液中,在37℃温箱中保温过夜。

8、倒掉染色液,24h后,即可看到清晰的蛋白质条带。

实验八western-blotting

一、实验目的

1.鉴定蛋白质表达的情况。

2.通过本实验系统掌握western-blotting鉴定蛋白表达情况的原理、操作及结果分析。

二、实验原理

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

三、仪器与试剂:

试剂:匀浆缓冲液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇0.2ml;ddH2O 2.8ml;转膜缓冲液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml;0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;

Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml;膜染色液:考马斯亮兰0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中;显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺0.1ml;H202 1.0μl。

仪器:烧杯,硝酸纤维薄膜,

四、实验步骤

(一)SDS-PAGE实验见之前的。

(二)电转

1. 剪6块3mm滤纸和一块NC膜。

2. 将剪好的3mm滤纸和一块NC膜在转移液中浸泡3-5min。

3.按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中,在塑料支架上放一块海绵。

4.将3块3mm滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另3块滤纸和海绵放上。

5.用塑料支架夹尽上述各层,放入电转槽中,NC膜一侧向正极。

6.接通电源电压40V,电流0.17-0.2A,转移1.5-6小时。

7.转移结束后,取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿做好标记,切下其中一个孔对应的膜的一半,用氨基黑或考马斯亮蓝染色,检查转移效果。

8.将其余的NC膜放在一张干净的3mm滤纸上,室温干燥30-60min。

9.NC膜的封闭:

将经电转并干燥的NC膜放于一瓶皿上,加入封闭液室温下轻轻摇荡2-3小时。

10.将第一抗体用封闭液稀释,稀释度由预实验确定。

11.将B中封闭好的NC膜,放入塑料袋中,加入一抗,加入量为0.1ml一抗/cm2NC膜,赶尽塑料袋内所有气泡,封口机封口,4℃下轻轻震荡2小时。

12.洗膜:反应结束,将塑料袋剪开,弃去废液,用PBS洗三次,每次10min,将膜从PBS溶液中转至150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中室温下轻轻震荡10分钟。

13.将二抗用二抗封闭液稀释,稀释度为1:200-1:2000。

将膜放入一塑料袋中,加入二抗溶液,加入量一般为0.1ml二抗溶液/cm2NC 膜,封闭塑料袋,

14.剪开塑料袋,取出NC膜,在150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH=7.5)溶液中冲洗1-5次,每次10分钟。

15.将膜放入显色液中,室温下轻轻摇动。

16.带条带出现后(约显色1-3分钟),立刻用水洗膜,然后用TE终止。

实验九酶联免疫分析技术

一、实验目的

通过ELISA实验操作鉴定胰酶并确定其浓度,掌握ELISA实验操作步骤和基本原理。

二、实验原理

1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,称为酶联免疫吸附试验)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上,并保持其免疫活性。测定时,将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色,进行定性或定量测定。最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合,用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验,俗称ELISA(enzyme linked immunosorbant assay)。

众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可导致大量的催化过程,所以极为敏感。免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后,既不改变抗体成抗原的免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜相电子显微镜观察,也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在,从而证明发生了相应的免疫反应。所以,这是一种特异而敏感的技术,可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术,其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应,后加入酶标抗体与免疫复合物结合,用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分,最后加入酶反应底物,根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

根据检测目的和操作步骤不同,有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。

三、仪器与试剂:

1、实验二亲和层析纯化后胰酶样品。

2、胰酶抗体,AP标记二抗,包被液PH9.6碳酸盐包被缓冲液: 3.03g Na2CO3, 6.0g NaHCO3, 溶解于900ml双蒸水中,检测并调整pH至9.6,定容至1L;PBS:1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl ,溶于500mL 蒸馏水中,调整pH至7.4;封闭液:溶于PBS的1% BSA,血清,脱脂牛奶,酪蛋白或明胶等。洗涤液:PBS或是TBST(Tris-HCl,pH7.4 + 0.05% 吐温20);抗体或抗原稀释液:1×封闭液;终止液:根据实验检测系统可采用不同的终止液。

3、酶标板、微量加样器、带盖搪瓷盘、37℃培养箱、酶标仪、小试管等。

四、实验步骤

1、采用十字交叉连续稀释分析法确定抗原浓度,抗原浓度一般为0.2 to 10

μg/ml,最好不要超过20μg/ml。

2、将50μl用碳酸盐包被缓冲液稀释的抗原加入96孔酶标板中,用塑料膜板将孔板覆盖后置于室温2小时或4度过夜。

3、弃去包被液用洗涤液洗涤3次,轻拍孔板使洗涤液甩干。

4、每孔中加入200μl封闭液(1%BSA或5%脱脂牛奶等),盖上膜板,室温封闭至少2小时或4度过夜。

5、封闭后用PBS洗涤两次。抗体孵育

6、每孔加入稀释好的抗体100μl,室温孵育2小时或4度过夜。

7、孵育后用洗涤液洗涤四次。

8、每孔加入100μl的底物溶液,待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上测定相应波长吸光度值。

实验十染色体DNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握提取染色体DNA的原理及方法,并为下一步实验做准备。

二、实验原理

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作,如不能有效的完成DNA提取方面的工作,那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。本实验中通过裂解液裂解细胞,有机溶剂反复抽提。使DNA进入水相与担保成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化DNA。

三、仪器与试剂:

1.材料:大肠杆菌

2.试剂:细胞裂解液(100mM Tris-HCL、5mM EDTA、500mM NaCl、1.25% SDS、PH 7.5);饱和酚;氯仿;70%酒精

四、实验步骤

1、取培养菌液加入10ml裂解液,加入1ml酚,等体积氯仿,在65℃下水浴半小时。

2、水浴后12000r/min离心15min,取上清液。

3、在上清中加入等体积氯仿,轻轻摇动,在此12000r/min离心15min,取上清液。

4、在上清液中加入2体积无水乙醇(-20℃)与0.1体积3M乙酸钠(PH5.2),室温下静置10min。

5、12000r/min离心15min,取沉淀。

6、用70%乙醇洗三次沉淀,之后12000r/min离心10min。

7、将沉淀真空干燥后,复溶于2ml去离子水水中。

8、加RNaes摇匀后,在65℃中水浴30min。

9、加等体积酚,酚/氯仿,氯仿各一次,12000r/min离心15min。

10、取上清液,加入无水乙醇,3M乙酸钠(PH5.2),12000r/min离心15min。

11、去沉淀,重复(6)步后干燥复溶-20℃保存。

五、结果及分析

分析:DNA提取物电泳结果如图3-1所示,可以清晰看到呈梯状的明显亮带,上样口物干净,整体条带清晰,说明蛋白质去除干净,无杂质残留,DNA 提取效果良好,可用作下一步实验原料使用。

实验十一质粒DNA的提取与纯化

一、实验目的

通过本实验,掌握大肠杆菌质粒提取原理和方法,为之后实验准备材料二、实验原理

细菌质粒多为一些双联、环状的DNA分子,其大小范围从1KB-200以上KB不等,他们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋予菌体一些特殊的表型,这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。由于有些质粒与DNA分子量较小特别是与自身遗传有关的DNA分子绩效,可携带外援基因量较大,且转移性强、拷贝数高(松弛型质粒)、还带有选择性标记,因此质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。质粒DNA的提取可以说是以不同的方法,但基本步骤多为散步,第一细菌培养和质粒的扩增,第二细菌菌体的裂解,第三质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同,决定了质粒DNA提取方法的差异,目前菌体裂解方法主要是煮沸法,SDS法,碱解法,Triton-溶菌酶法等。质粒DNA的纯化方法主要是梯度离心法,柱层析法等,但由于目前所用质粒复制量极大,小量常规制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段分离、常规亚克隆及探针等方面的工作需要,因此在实际工作中,除非有极特殊的要求,很少有人进行质粒DNA的梯度离心及柱层析纯化。

三、仪器与试剂:

(1)培养用大肠杆菌菌体

(2)超净工作台、培养箱、摇床、高速冷冻离心机、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、取仪器一套、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、电泳仪、水平电泳槽。

(3)Solution I (50nM葡萄糖,25mM Tris-HCl PH=8.0,10mM EDTA PH=8.0,高压灭菌,4℃保存)、Solution II(0.2M NaOH,1%SDS,现配现用)、Solution III (5N KAC PH 4.8高压灭菌,4℃保存)、3M NaAC PH 5.2 高压灭菌,4℃保存、氨苄青霉素25mg/ml、溶菌酶8mg/ml、氯仿/酚、异丙醇、

四、实验步骤:

1、20ml培养菌体37℃20rpm 过夜。

2、取出菌液后4℃,5000r/min离心10min。

3、取沉淀用预冷的TES缓冲液洗涤,4℃,5000r/min离心10min。

4、取沉淀加入1ml Solution I,冰浴10min。

5、重新悬浮,加入150ul溶菌酶木业,室温5min。

6、加入1.2ml Solution II,冰浴5min。

7、加入0、9ml预冷乙酸钾,混匀,4℃,12000r/min,离心10min。

8、取上清液,加入1.5ml异丙醇,-20摄氏度,冷藏15min。

9、4℃,12000r/min,离心10min。

10、取沉淀悬于200ulTE缓冲液中,加入40ul,3M NaAC。

11、酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后4℃,12000r/min,离心10min。

去沉淀后冷冻干燥,再悬浮于50ulTE中备用。

五、结果及分析

分析:质粒提取结果如图3-2所示,其中同一泳道内的三个条带分层明显,符合质粒的电泳图,造成这一现象,是因为质粒的三种不懂构象导致的电场中的迁移速度有差异,最终迁移距离发生变化,图3-2中条带清晰,无杂带,说明质粒DNA提取效果良好,该实验结果可用作下一步实验使用。

生物化学实验报告 2011

孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业:学号:姓名:分数:实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540 nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料小麦面粉(1000 g) 2.主要仪器 (1)具塞玻璃刻度试管:20 mL×11 (2)滤纸(3)烧杯:100 mL×2 (4)三角瓶:100 mL×1 (5)容量瓶:100 mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2 mL×2; 10 mL×1 (7)恒温水浴锅(8)煤气炉(9)漏斗(10)天平(11)分光光度计 3.试剂 (1)1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100 mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。 (2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000 mL 容量瓶中,加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL,再加入45 g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000 mL。 (3)碘-碘化钾溶液:称取5 g碘和10 g碘化钾,溶于100 mL蒸馏水中。 (4)酚酞指示剂:称取0.1 g酚酞,溶于250 mL 70%乙醇中。 (5)6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。(分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL) 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师:年月日

生物化学实验报告

一、实验目的: 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项; 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色定糖的原理和方法; 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理; 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法; 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法; 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术: 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术: 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术: 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术: 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术: 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型

3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理: 1、蔗糖酶的提取: ①酵母菌的基本特征: 单细胞,椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm,宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法: (1)机械(匀浆)法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器(50mL)Teflon:聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机(0.5-1L) 将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机(XL) 高压下的细胞通过阀门流出时,细胞内外压力同时降低,但由于细胞膜的作用,胞外压力瞬间降至常压,而胞内压力相比之下降低较慢,从而在细胞内外形成压力差,使细胞膜破裂。 优点:快速,产热小,对蛋白损伤小,破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 (2)超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。(3)反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。设备简单、效率不高,时间长,注意蛋白酶! (4)化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。

生物化学实验报告册

生物化学实验报告册 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入

水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。 实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,提高分析、综合、概括问题的能力,同时也是学习撰写研究论文的过程。 1.实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2.实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写,作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3.每项内容的基本要求 实验原理:简明扼要地写出实验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料:应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪

浙江大学生物化学丙实验报告1

实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶的提取 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、巩固理论知识,学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容: 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法(研磨)将酵母细胞破碎,把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有:盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活,为了能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯 操作中要始终保持酶的活性,如在低温下操作等,这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂

1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3~4人) 2、实验试剂 石英砂,95%乙醇(-20℃),20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平(称量干酵母粉);研砵(每组一套);50ml高速离心管(4支/组、4孔50ml离心管架一个/组);托盘天平(离心管平衡用);高速冷冻离心机;恒温水浴箱(50℃);量筒(50ml)、微量移液枪(1000ul)及枪头或移液管(1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管(留样品Ⅰ、Ⅱ用)及离心管架;制冰机;-20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹(干磨法) ①称量:称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨):至尽可能成细粉末状(约15min) ③加液+研磨:量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液,分2次加研磨10min, 使呈糊状液体; ④离心:将糊状液体转移到2支50ml离心管中,两支离心管平衡后(托盘天平上),离心10min (条件:4℃、12000r/min) ⑤收集+测量:收集上清液并量出体积V1(样品I),另留1ml上清液(样品I )放置-20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理:将上步抽提液(样品I),迅速放入50℃恒温水浴,保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却:保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心:将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中,平衡后,离心10min。 (条件:4℃,12000r/min) ④收集+测量:收集上清液并量出体积V2(样品Ⅱ),另留1ml上清液(样品Ⅱ)放置-20℃冰箱保存(用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂(乙醇)沉淀 ①冰浴:将热处理后的上清液加入相同体积的-20℃的95%乙醇,冰浴中温和搅动混匀,

生化实验报告模版

生物化学实验报告 姓名:郭玥 学号: 3120100021 专业年级: 2012级护理本科 组别:第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】 实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别, 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可 使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷 大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定) 实验步骤: (一)盐析+凝胶柱层析除盐:

高级生物化学与分子生物学综合实验报告优选资料p

5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速操作。 6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。 7. 在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入样品处理液,在100℃加热5min以使蛋白质变性。 8. 浓缩胶聚合完全后(30-60 min),小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 二、上样电泳 1. 按预定顺序加样,加样量通常为10~25μL。 电泳检测样品至少包括:蛋白Marker、上样液(原液)、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。 2. 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后,把电压提高到15 V/ cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm,然后关闭电源。 3. 从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色 染色时间:现温度下不少于2h。 脱色需3~10小时,期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录,应尽快对凝胶进行拍照。 四、实验结果与讨论 1、质粒的提取、酶切电泳图谱 1 2 M 图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱 1:酶切后的质粒2:质粒M :Marker 1、2:质粒4、5:酶切后质粒 观察结果:通过对比第三组和第四组电泳图谱,可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面,并且质粒泳道条带比较多;电泳条带模糊,呈凹凸形状,拖尾现象比较严重,不能很明显地观察结果。 原因分析:

生物化学实验报告:蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

生物化学实验报告:蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗

入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是Vo,Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得;Vi可g×Wr求得。因此,对一层析柱胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。

生物化学实验六——酵母RNA的提取与含量测定 山东大学实验报告

实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者:张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多,DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在260nm 左右,且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比(浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比),利用此性质,可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右),测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收,对核酸测定有一定的干扰作用,最大吸收峰在280nm处,原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度,再测280nm处的吸光度,通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸(pH1-14)烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇(5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀)RNA标准蛋白溶液(200μg/ml)

1.RNA的提取 (1)称取4g干酵母粉,放入200ml锥形瓶中,加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀,在沸水浴中煮沸30min中并冷却; (2)冷却后,把液体倒入离心管中,在4000r/min的条件下离心15min; (3)离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml,边加边搅拌,静置5min左右,再4000r/min的条件下离心5min; (4)离心后保留沉淀,用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀,每次洗后在3000r/min的条件下离心5min; (5)离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次,每次用3000r/min离心5min; (6)离心结束后,收集沉淀与滤纸上,称重备用。 2.RNA样液的配制 (1)取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中,加入5mlNaOH溶液,搅拌,溶解,调成糊状。 (2)再加入蒸馏水40ml,搅拌混匀,调PH至7.0后,放入100ml容量瓶中定容。 (3)再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 (1)取洁净的试管,依次标号为1-10、A、B、C后,按照下表分别往各试管中加所需液体,并用磁力搅拌器混匀。 (2)混匀后以0号试管为参比液,在260nm下测各试管的吸光度A,并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线,并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用,使用前一定要将两离心液(包括外壳)在天平上调平,对称放置在离 心机上,防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用,要先预热10分钟,往比色皿中到液体只需到三分之二即可, 防止液体溢出腐蚀仪器,爱护仪器。

生化大实验实验报告

生化大实验 实验报告 姓名: 学号: 专业: 班级: 实验班级: 单位: 指导老师:

实验1 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、实验原理: 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌,它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶,位于质体、微体,可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节,属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成为醌,使组织形成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用,所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外,多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联,起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同,通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出,且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的: 通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关的仪器设备的正确使用的方法,以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂: 1.材料:马铃薯(两小组共称200g) 2.试剂:0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制是配x10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵; 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0(含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,0.005M MgCl2) 3.设备:试管与试管架;烧杯、玻璃棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋;过滤纱布;植物组织匀浆机;pH计和pH试纸;高速冷冻离心机; 四、操作步骤: 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块,加入300ml缓冲液A,两者按1:1(W/V)比例匀浆1min; 2.用两层纱布将所得的浆液过滤; 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min; 4.上清液两组平分,每组150ml,加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min; 5.取上清液定容至150ml,加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min,倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min; 6.将所得溶液倒入透析袋中,用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析: 实验所得的初酶液颜色为浅黄色,颜色浅,主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少,从而最大程度的保留了PPO的活性;经过一个夜晚的透析,得到了澄清的略带黄色的液体,这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论: 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速,防止酚类充分暴露在空气中被氧化; 2.实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净;

大学生物化学实验

生物化学实验安排 实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,此反应称为双缩脲反应,双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 3.苯环的黄色反应 Tyr + 浓硝酸黄色 Trp Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应: 检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时,产生分层现象,界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。 5. 偶氮反应

偶氮化合物都含有-N=N-这样结构,通常作为染料。 6. 醋酸铅反应 ()↓ --→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管,加乳蛋白溶液(蛋清:水= 1:9)约1ml 和10%NaOH 约2ml ,摇匀,再加1%CuSO4溶液2滴,随加随摇。观察现象,记录。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) (1)取2支试管分别加入蛋白质溶液(蛋清:水= 1:9)和甘氨酸溶液1ml ,再各加0.5ml0.1%茚三酮,混匀,沸水浴中加热1-2分钟,观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。 (2)在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液,风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察是否有紫红色斑点的出现。 3. 苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。鸡蛋清溶液(蛋清:水= 1:9) 4. 乙醛酸的反应: 向3个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。蛋白质溶液(蛋清:水= 1:20)

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

生物化学实验报告

生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活性测定一.实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二.实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白,是唯一以自由基为底物 的酶,具有清除自由基的功能酶,在酶分子上共价连接金属辅 基,因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到,是一种蓝色含铜蛋白,之后, 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力,因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基(O2-)的金属酶,它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用,因而在医药(如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3)、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业(SOD灵芝菌5 等)等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应:2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同,可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体,呈 蓝绿色;Mn-SOD呈紫红色;Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法:邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定,酶活性单 位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色,与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围,溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比,可 用比色法测定,测定围1-1000μg。 三.实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材

生化实验报告资料

生物化学实验报告 姓名:吴瑞 学号: 3120016004 专业年级: 2012级临床医学(妇幼保健) 组别:第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

浙江大学生物化学丙实验报告.

. 实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法; 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作; 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA 的提取 ②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒: 质粒是一种染色体(核质体)外的寄生性的自主复制子,存在于细菌等细胞中,为双链闭环的DNA 分子,大小在1-200kb 之间,具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息,但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞(细菌)基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移,因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤: a 细菌培养使质粒大量扩增; b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ; c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质,分离和纯化质粒DNA 。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA : 在EDTA 存在下,经过SDS 处理使细胞膜裂解,从而使菌体充分裂解,利用在碱性条件下(NaOH ), 使核质体DNA 与质粒DNA 的变性;加入乙酸钾,在中性条件下,核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异,质粒DNA 很快得以复性,而细菌核质体DNA 分子难以复性,核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上专业: 农业资源与环境 姓名: 李佳怡 学号: 3130100246 日期: 2015.6.9 地点: 生物实验中心310 装 订 线

浙江大学生物化学丙实验报告1

专业:农业资源与环境 姓名:李佳怡 ____________ 学号:_J6 _______________ 日期: __________________ 地点:生物实验中心310课程名称:生物化学实验(丙) 实验名称:蔗糖酶的提取 一、实验目的和要求(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 七、实验结果与分析(必填) .指导老师:方祥年 成绩:_ _同组学生姓名:金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、 巩固理论知识,学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 订 1、实验内容: 线 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ① 酵母细胞破碎 液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法 固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法(研磨)将酵母细胞破碎,把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。 ② 蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有:盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活,为了能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯 操作中要始终保持酶的活性,如在低温下操作等,这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告 细 胞 破碎 的 常 用 方 法

三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3?4人) 2、实验试剂 石英砂,95%乙醇(-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平(称量干酵母粉):研碎(每组一套):50ml高速离心管(4支/组、4孔50ml离心管架一个/组);托盘天平(离心管平衡用):高速冷冻离心机:恒温水浴箱(50°C);量筒(50ml)、微量移液枪(lOOOu 1)及枪头或移液管(1ml)、玻棒、滴管等;离心管(留样品I、II用)及离心管架:制冰机:一20°C冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹(干磨法) ①称量:称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨):至尽可能成细粉末状(约15min) ③加液+研磨:呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液,分2次加研磨lOmin, 使呈糊状液体; ④离心:将糊状液体转移到2支50ml离心管中,两支离心管平衡后(托盘天平上),离心lOmin (条件:4°C、12000r/min) ⑤收集+测量:收集上淸液并量出体积VI (样品I),另留1ml上淸液(样品I )放置一20°C冰箱保存 用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理:将上步抽提液(样品I),迅速放入50°C恒温水浴,保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却:保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心:将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中,平衡后,离心10min a (条件:4°C, 12000r/min) ④收集+测量:收集上淸液并量出体积V2 (样品II),另留1ml上淸液(样品II )放宜一20°C冰箱保存(用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂(乙醇)沉淀 ①冰浴:将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇,冰浴中温和搅动混匀,

浙江大学生物化学丙实验报告

. 实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理; 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术; 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理 (1)实验原理 1、离子交换层析: 以离子交换剂为固定相,液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中,不同的蛋白质所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时,使某一种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 基质 基质 — + — + 可逆交换 可逆交换 溶液中的离子 (交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) 阳离 阴离子交

由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中,粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷,因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测) 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),能催化非还原性双糖(蔗糖)裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用 3.5-二硝基水杨酸法,其原理是 3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热(100℃)被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比,由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 (2)实验内容 1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ; 2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂); ②20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液;

浙江大学生物化学丙实验报告3、4

实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 ①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; ②掌握分光光度法制作标准曲线,准确测定未知样品的蛋白质含量; ③掌握分光光度计的使用方法。 2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法; ②学习酶的比活力的计算。 二、实验内容和原理 1、Folin-酚测定法 Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成,在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用,生成紫红色络合物;乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成,在碱性条件下,铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基(酚基)和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂(乙试剂)产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物),其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定,适于测定蛋白质含量0.05~0.5g/L 。 优点: 简单、迅速、灵敏度高;反应较稳定。 缺点: 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此,每水解1mol 蔗糖,就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉试剂比色法,斐林试剂法等。 专业: 农业资源与环境 姓名: 李佳怡 学号: 3130100246 日期: 2015.5. 26 地点: 生物实验中心310 装 订 线

细菌的生理生化反应实验报告

细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理,掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶,能分解培养基蛋白胨中的色氨酸,产生吲哚, 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应,形成红色的玫瑰吲哚,为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸,2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应,生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多,使发 酵液的pH下降到以下,当加入甲基红试剂后,时发酵液变红色,为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源,产酸产气,则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种:大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗 糖)、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器:酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 (一)V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。

2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物,分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中,加入与培养液等量的V-P试剂,充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 (二)甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中,分别加入2-3滴甲基红指示剂,立即观察培养液的颜色变化(三)吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面,此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 (四)糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 (一)V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———

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