目录
目录
第一章 基因克隆
1.操作流程---------------------------------------------------- 1
2.方法-------------------------------------------------------- 1
2.1 设计引物 ------------------------------------------- 1
2.2 PCR------------------------------------------------- 1
2.3 割胶回收目的片段------------------------------------ 2
2.4 连接------------------------------------------------ 3
2.5 感受态细胞制备及转化-------------------------------- 3
2.6 接菌------------------------------------------------ 4
2.7 阳性克隆鉴定---------------------------------------- 5
2.8 质粒抽提-------------------------------------------- 5
2.9 测序------------------------------------------------ 6
3.基因克隆的编码---------------------------------------------- 6 第二章 酵母双杂交筛选
1.操作流程---------------------------------------------------- 7
2.方法-------------------------------------------------------- 7
2.1 诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190------------------------- 7
2.2 含Bait基因质粒的Y190保种 ------------------------- 8
2.3 Bait 基因的自激活检测 ------------------------------ 9
2.4 诱饵基因筛库--------------------------------------- 10
2.5 抽提酵母质粒--------------------------------------- 13
2.6 酵母质粒的扩增------------------------------------- 14
2.7 Prey质粒与Bait质粒共转Y190----------------------- 16 第三章 细胞培养和转染
1.细胞培养--------------------------------------------------- 17
2.细胞转染--------------------------------------------------- 17
2.1 脂质体介导的贴壁细胞转染法------------------------- 17
2.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法------------------------- 18
3.相关试剂--------------------------------------------------- 19 第四章 免疫共沉淀
1.操作流程--------------------------------------------------- 20
2.方法------------------------------------------------------- 20
2.1 收获细胞------------------------------------------- 20
2.2 Protein G beads 悬液的制备------------------------- 20
2.3 Preclear ------------------------------------------ 21
2.4 免疫共沉淀----------------------------------------- 21
3.试剂------------------------------------------------------- 22
生命经纬网站https://www.doczj.com/doc/972207948.html,/——关注生命科学与交叉学科研究
1
第五章 Western Blot
1.操作流程--------------------------------------------------- 23
2.方法------------------------------------------------------- 23
2.1 电泳----------------------------------------------- 23
2.2 转膜----------------------------------------------- 23
2.3 杂交----------------------------------------------- 24
2.4 显色----------------------------------------------- 24
2.5 膜的 strip----------------------------------------- 24
3.试剂------------------------------------------------------- 25第六章 报告基因检测系统
1.NF-kB 报告基因检测系统------------------------------------- 26
1.1 细胞培养------------------------------------------- 26
1.2 转染----------------------------------------------- 27
1.3 细胞收获及处理------------------------------------- 28
1.4 luciferase 分析------------------------------------ 28
1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 28
2.p53报告基因检测系统---------------------------------------- 29
2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 29
2.2 转染----------------------------------------------- 29
2.3 细胞收获及处理------------------------------------- 30
2.4 luciferase 分析------------------------------------ 30
2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 31
3.NFAT报告基因检测系统--------------------------------------- 31
3.1 细胞培养------------------------------------------- 31
3.2 电击转化------------------------------------------- 31
3.3 铺板加药------------------------------------------- 32
3.4 细胞收获及处理------------------------------------- 33
3.5 Luciferase 检测------------------------------------ 33
3.6 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 33
4.Western-blot----------------------------------------------- 33
5.注释------------------------------------------------------- 35
5.1 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 35
5.2 各系统的control------------------------------------ 36
5.3 Lumat LB P507仪器操作步骤-------------------------- 36 第七章 流式细胞分析分选术
1.96孔板样本处理--------------------------------------------- 41
1.1 操作流程------------------------------------------- 41
1.2 方法----------------------------------------------- 41
1.3 注释----------------------------------------------- 28
2.Cell Cycle Assay------------------------------------------- 42
2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 42
2.3 细胞分板------------------------------------------- 43
2.4 加药刺激------------------------------------------- 43
2.5 细胞收获及处理------------------------------------- 44
2.6 上机样本制备--------------------------------------- 44
2.7 上机----------------------------------------------- 44
2.8 相关试剂的配制------------------------------------- 44
3.FACS analysis on Apoptosis -------------------------------- 45
3.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 45
3.2 转染----------------------------------------------- 46
3.3 细胞收获------------------------------------------- 47
3.4 上机样本制备--------------------------------------- 47
3.5 上机----------------------------------------------- 47
4.CD69检测-------------------------------------------------- 48
4.1 细胞培养------------------------------------------- 48
4.2 电击转化------------------------------------------- 48
4.3 铺板加药------------------------------------------- 49
4.4 细胞收获及处理------------------------------------- 49
4.5 样本制备------------------------------------------- 50
4.6 上机----------------------------------------------- 51
4.7 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 51
5.细胞分选--------------------------------------------------- 52
5.1 分选细胞样本处理----------------------------------- 52
5.2 分选细胞的上机操作程序----------------------------- 53
5.3 相关试剂的配制------------------------------------- 53 第八章 siRNA技术
1.方法------------------------------------------------------- 54
2.注释------------------------------------------------------- 54
2.1 不同培养体积贴壁细胞用 RNAfect 转染时的初始条件---- 55
2.2 在24孔平板中优化RNAfect转染效果的方法------------ 55
2.3 在24孔平板中优化 RNAfect转染效果的方法------------ 55第九章 杆状病毒表达系统
1.操作流程--------------------------------------------------- 56
2.方法------------------------------------------------------- 56
2.1 共转染--------------------------------------------- 56
2.2 病毒扩增------------------------------------------- 57
2.3 滴度与plaque纯化---------------------------------- 58
2.4 小规模表达带有 His标签的目的基因------------------ 59
3.昆虫细胞Sf9的培养条件------------------------------------- 59
3.1 培养基--------------------------------------------- 59
3.2 培养方式------------------------------------------- 60
2.3 细胞的冻存和解冻----------------------------------- 60
第十章 蛋白的表达和纯化
1.基因表达载体构建------------------------------------------- 62
1.1 操作流程------------------------------------------- 62
1.2 方法----------------------------------------------- 62
2.蛋白纯化--------------------------------------------------- 64
2.1 重组蛋白的提取------------------------------------- 64
2.2 金属鳌合层析(IMAC)--------------------------------- 65
2.3 谷胱苷肽配体亲合层析(GAF)-------------------------- 66
2.4 离子交换层析(IEC)---------------------------------- 66
2.5 凝胶过滤(GF)--------------------------------------- 67
3.蛋白浓度测定----------------------------------------------- 68 第十一章 RNA技术
1.组织Total RNA提取------------------------------------------69
1.1 组织取材和保存------------------------------------- 69
1.2 组织的破碎和匀浆----------------------------------- 69
1.3 总RNA的抽提--------------------------------------- 70
2.荧光定量PCR (Q-PCR)---------------------------------------- 71
2.1 Q－PCR反应体系------------------------------------- 71
2.2 Q－PCR反应程序------------------------------------- 71 第十二章 抗体的制备和纯化
1.多克隆抗体的制备------------------------------------------- 72
2.单克隆抗体的制备------------------------------------------- 72
2.1 免疫动物------------------------------------------- 72
2.2 细胞融合------------------------------------------- 73
2.3 细胞筛选------------------------------------------- 74
2.4 细胞克隆------------------------------------------- 75
2.5 细胞扩增------------------------------------------- 75
2.6 细胞冻存------------------------------------------- 75
2.7 腹水制备------------------------------------------- 76
2.8 腹水的纯化----------------------------------------- 76
2.9 杂交瘤鉴定----------------------------------------- 76
3.Peptide-KLH的偶联及-SH偶联率测定方法---------------------- 76
3.1 Peptide-KLH偶联------------------------------------ 76
3.2 -SH偶联率测定------------------------------------- 77
3.3 Cys标准曲线制作----------------------------------- 77
3.4 -SH偶联率换算公式--------------------------------- 78
3.5 透析及分装保存-------------------------------------- 78 第十三章 病理实验基本技术
1.基本技术--------------------------------------------------- 79
2.常规制片--------------------------------------------------- 79
2.1 操作流程------------------------------------------- 79
2.2 方 法---------------------------------------------- 79
3.免疫组织化学----------------------------------------------- 81
4.免疫细胞化学----------------------------------------------- 82
5.组织微阵列------------------------------------------------- 82
6.常规溶液配制----------------------------------------------- 82
第一章 基因克隆
1.操作流程
收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体连接，取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴定(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆信息输入数据库——>质粒实物保存
2.方法
2.1设计引物
引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer和reverse primer的Tm 为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。
forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC
reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC
2.2PCR
2.2.1 PCR反应体系
模扳(100ng/ul质粒) 2.00μl
4dNTP(10mM) 1.00μl
10×PCR Buffer 5.00μl
MgCl2(25mM) 5.00μl
5’Primer (10-12uM) 4.00μl
3’Primer (10-12uM) 4.00μl
5M甜菜碱 10.00μl
Pfu (5U/ul) 0.50μl
ddH20 18.50μl
生命经纬网站https://www.doczj.com/doc/972207948.html,/——关注生命科学与交叉学科研究
1
总计 50.00μl
2.2.2 PCR 反应程序
1)从cDNA 文库克隆基因
Stage1 Stage2 Stage3
1 Cycle 30Cycle 1 Cycle
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃
4℃ 2min 30sec 30 sec
Xmin(2
min/Kb)
10min 1min
注：Pfu 酶最适延伸温度为68℃。
2)从含目的基因质粒中克隆
Stage1 Stage2 Stage3
1 Cycle 22Cycle 1 Cycle 95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃
4℃ 2min 30sec 30 sec Xmin(2min/Kb)
10min 1min
2.3 割胶回收目的片段
(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)
1) 1%Agarose 胶电泳将目的DNA 片段用干净的手术刀割下，放入1.5ml 离心管
2) 称重后，在1.5ml 离心管中加入3倍胶体积的buffer QG(100mg 加300ul)
3) 50℃水浴中放置10min(至胶完全溶解)，每2-3分钟混匀一次(溶胶液应于
buffer QG 颜色相同)
4) 加入1倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻。
5) 将样品转移入柱子中(柱子的最大容量为800uL)，然后13000rpm*1min 离心
6) 取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中
7) 加入0.75mL buffer PE至柱子，室温放置2-5min，然后13000rpm*1min离心
8) 取下柱子，弃流出液，再次13000rpm*1min离心
9) 将柱子放置在一支新的1.5mL离心管中，加入50uL EB buffer (或无菌H2O)
至膜中央，静置片刻，然后13000rpm*1min离心，然后测定浓度
2.4 连接
在连接反应中通常要求：(目的基因分子数：载体分子数=3：1)
连接反应体系
-
+ sample
10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl
PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl
目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /
T4连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl
补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl
于16℃连接过夜。或室温(25℃)1小时以上。
2.5 感受态细胞制备及转化
2.5.1 CaCl2制备感受态细胞(DH5α、DH10B、TOP10 )
1）接过夜菌在15ml试管中加入3ml LB培养基，从平板上挑取一单克隆接
种，37℃，260rpm，培养过夜，约16小时。
2）接菌取2ml过夜菌接入200ml新鲜的LB 培养基， 37℃，260rpm，培
养，直至OD600=0.4-0.5(一般约2小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。
3）收菌4℃，5000rpm×5min，弃上清。
4） CaCl2 悬浮若50ml菌液收菌，用10ml 0.1M的CaCl2 轻轻吹打，充分悬
浮，冰浴10min。
5）离心4℃，5000rpm×5min，弃上清。
6）CaCl2 悬浮以2ml 0.1M的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min即感受态制备完成。
此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油，混匀后-80℃冻存，以后使用(一般可存1个月)。
注：制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。
2.5.2 转化(PGEM-T vector)
1)准备1.5ml的离心管，冰浴预冷。
2)取100ul感受态细胞，加入5ul连接液，冰浴45-60min。
3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)
4)冰浴2min。
5)加LB培养基900ul，37℃，150rpm培养45-60min。
6) 4000rpm×3min 离心。
7)留100ul上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的LB板(预先涂
布X-gal和IPTG)。
8) 37℃培养箱倒置培养过夜，约16小时。
2.6 接菌
1）转化得到蓝白菌落筛选板(因为我们一般用的是PGEM-T做连接，经X-gal 处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。)
2）挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB培养基。
3）37℃，260rpm 培养。
4）培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR鉴定。
5）以PCR结果，将有目的片段插入的样品以5ml LB培养基再次接菌，37℃，260rpm 培养过夜，约16小时。
2.7 阳性克隆鉴定 (PCR鉴定)
2.7.1PCR鉴定体系
10X Taq buffer 3 ul
4X dNTP (10mM) 0.5 ul
Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)
10uM引物(双向) 各1ul
50%DMSO(which is optional) 1ul
模板：过夜菌液 / 挑单克隆2ul
加灭菌水至30ul
2.7.2 PCR鉴定程序：
94℃5min
94℃30s
30cycle 55℃ 30s
72℃3min
72℃ 10min
4℃+∞
30ul上样，走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小
2.8 质粒抽提(质粒小量抽提试剂盒)
1)收菌以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml菌液)
2)弃上清。
3)加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。
4)加200ul Solution II，温和混匀6次。(此过程不超过5min)
5)加280ul Solution III，温和混匀6次。
6)以14000 rpm×10 min 离心。
7)取上清，过吸附柱，以10000 rpm×1 min，弃滤液。
8)吸附柱内加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。
9)反复步骤8)一次。
10) 14000 rpm×1 min 离心。
11)将吸附柱旋转180度后再14000 rpm×1 min 离心。
12)加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置
2min。
13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒DNA。
2.9 测序
1) ABI377测序仪测序。
2) 测序结果分析：用软件Vector NTI Suite 6分析测序结果。每个克隆相应的测
序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库http://192.168.0.2/index.htm。
克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。
3.基因克隆的编码
根据实验基因引物的号码相对应编制。
如：基因引物编号： 1000_f 1000_r
克隆编号：1000A1 or 100092
(注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…
最后一位为克隆数编号，一般为1—3)
第二章酵母双杂交筛选
1. 操作流程
诱饵基因转化筛库宿主菌Y190——>含诱饵基因的Y190保种——>诱饵基因的自激活检测——>筛库(组织库或者小文库)——>挑选鉴定阳性克隆——>抽提阳性克隆中PREY质粒并在细菌中扩增——>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共同转化Y190，验证其相互作用
2. 方法
2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190
1）3个1mm 克隆接种于3mlYPD液体培养基30℃振荡培养20小时(过夜)，OD600达到1.2左右。
2）将此3ml菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD中培养4小时左右，使培养液OD600达到0.6。
3）50ml离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1，865rpm)，5分钟离心收集菌体，弃上清。
4）20ml ddH2O重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。
5）20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。
6）根据每个转化需要50μl菌液的量加入1XTE/LiAc重悬菌体，分装到Eppendorf管中，每管50μl菌液。
7）每管加约100ng Bait基因质粒，5μl预变性的Carrier DNA*，500μl 1X TE/LiAc/PEG*。
8）放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30分钟,15分钟时混匀一次。
9）30分钟后，每管加入15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠
7
倒混匀。
10）42℃水浴热激20分钟，每10分钟上下颠倒混匀一次。
11）冰浴5分钟。
12）700g，5分钟离心收集菌体，弃上清。
13）ddH2O洗涤一次菌体。
14）利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp平板上。
15）30℃培养箱培养。第2天即可观察到克隆长出，第3天克隆即长到所需大小。
Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml.
未使用过的Carrier DNA 先100℃变性10分钟，立即置于冰浴2分钟,然后再100℃变性10分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA只需要100℃变性一次即可。
1XTE/LiAc: V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:8
1XTE/LiAc/PEG: V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:8
50%PEG： 50%为质量体积比。PEG3350溶于ddH20中一般需要加热溶解
10XTE： 0.1 M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.5
10XLiAc： 1M LiAc, pH7.5
2.2 含Bait基因质粒的Y190保种
Bait基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR 鉴定是否转入正确的Bait基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。
2.2.1 酵母菌落PCR
1) 用含Bait基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌Y190作为阴性对照
2) 按照下列反应体系进行PCR
ExTaq Premix(Takara) 10μl (2X )
5’Primer 0.5μl (10μM)
3’Primer 0.5μl (10μM)
8
ddH20 8.9μl
菌0.1μl
3)按照下列反应条件进行PCR
95℃5分钟
94℃30秒Array 58℃30秒
72℃2分钟
72℃5分钟
72℃延伸2分钟是针对小于2Kb的Bait基因,对于长于2Kb的Bait基因要相应延长时间。
4）PCR产物进行电泳检测
2.2.2 阳性克隆保种
1）将阳性克隆接种到3ml相应液体培养基中，30℃振荡培养2-3天。
2） 700g,5分钟,离心收集菌体。
3）加入1：1的液体培养基和Sterile Glycerol Solution*混合溶液。
4）充分悬浮菌体，放于-80℃保存。
Sterile Glycerol Solution: 65%(V/V) glycerol, 0.1M MgSO4, 0.5mM Tris-HCl, pH7.4
2.3 Bait基因的自激活检测
一般采用膜检的方法，检测LacZ基因的表达情况。膜检方法如下:
1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。
2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30秒，取出后晾干。
3)培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶
后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm培养皿加2ml 显色液，15cm 培养皿加5ml 显色液。
4)盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。
5)20分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3小时为准，特殊情
况下可以看过夜是否变蓝。
6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。
9
显色液: 100ml Z buffer,0.27ml β–mercaptoethanol,1.67ml X-gal
Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4·7H20, 5.50g/L NaH2PO4·H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L MgSO4·7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。
X-gal: X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside)溶于DMF (N,N-dimethylformamide)中，终浓度为20mg/ml。
2.4 诱饵基因筛库
2.4.1 转化法筛选组织库
1) 5-10个2mm 克隆接种于1ml SD/-Trp液体培养基中，混匀后转入150ml
SD/-Trp 振荡培养20小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。
2) 150ml培养液转入1000ml YPDA(YPD+Adenine)中混匀，此时OD600=0.2~0.3。
3) 培养约4~5小时至OD600>0.6。
4) 500ml离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J-25(以下步骤均使
用此离心机),700g,5分钟,RT(室温)。同时将2000μl Carrier DNA预变性两次。
5) 500ml ddH2O洗涤一次，700g, 5分钟,RT，收集菌体。
6) 30ml 1X TE/LiAC洗涤菌体(预先配制50ml 1X TE/LiAC), 转入100ml离心管。
7)700g, 5分钟, RT。(预先配制50ml 1XTE/LiAC/PEG)。
8)加入12ml 1X TE/LiAc重悬菌体。
9) 加入100~500μg文库DNA, 2000μl 预变性的Carrier DNA，轻轻混匀。
10)加入50 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
11)30℃孵育45分钟，每15分钟混匀一次.
12)加入3.2ml DMSO, 轻轻混匀.
13)42℃热激20分钟,每10分钟混匀一次.
14)冰浴5分钟.
15）700g,5分钟，收集菌体.
16）加入1000ml YPDA,30℃振荡培养60分钟.
17）700g, 5分钟，收集菌体.
10
11
18) 加入2ml 0.9％ NaCl 悬浮菌体，终体积约5ml 左右。取20μl 菌液做滴度测
定，其余菌液200μl/块，涂布于15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。
19) 滴度(转库效率)测定： 20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10 ；
20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100；
20μl +180μl NaCl(0.9％)1:1000；
20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10000
20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100000
1:1000; 1:10000；1:100000 三种浓度各取100μl 涂布SD/-Trp/-Leu 平板
20) 转库效率的计算：对生长在SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数，挑选克隆数在
30-300之间稀释度计算转库效率
转库效率计算实例：
? 在1：10000转库效率计数平板上长出100个克隆(稀释度=0.0001)
? 总悬浮体积= 5ml
? 文库质粒用量=100μg
转库效率 =
= 5 X 105cfu/μg
21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14天后，会有阳
性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm 。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.2筛选小文库
2.4.2.1 转化法
1)5~10个2mm 克隆接种于2ml SD/-Trp 液体培养基中，摇20小时(过夜)，至
OD600=1.2 左右。
2) 2ml 培养液转入20ml YPDA 中，此时OD600=0.2~0.3。
100μl X 0.0001 X 100μg
3)培养约4~5小时至OD600>0.6。
4) 用50ml离心管收集菌液，Eppendorf Centrifuge 5810R(以下步骤均使用此离心
机),700g,5分钟,RT。同时将Carrier DNA预变性两次。
5)10ml ddH2O洗涤一次，700g, 5分钟,RT，收集菌体。
6) 10ml 1X TE/LiAc洗涤菌体(预先配制1X TE/LiAc)700g, 5分钟, RT。(预先配
制1XTE/LiAC/PEG)。
7)加入600μl 1X TE/LiAc重悬菌体。
8）加入2μg小文库DNA，20μl 预变性Carrier DNA，轻轻混匀。
9）加入2.5 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
10) 30℃孵育45分钟，每15分钟混匀一次。
11) 加入160μl DMSO, 轻轻混匀。
12) 42℃，热激20分钟,每10分钟混匀一次。
13) 冰浴5分钟。
14) 700g,5分钟,收集菌体。
15) 加入20mlYPDA,30℃摇60分钟。
16) 700g,5分钟，收集菌体。
17)加入200μl 0.9％NaCl悬浮菌体,取20μl菌液做滴度测定，其余菌液涂布于一
块15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。
18) 滴度测定：方法同筛选组织文库。
19)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT平板上生长7-14天后，会有阳
性克隆生长出来。阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。
从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey质粒与Bait质粒做共转验证。
2.4.2.2 Mating法
1)将带有小文库基因的质粒分别转入Y187中(方法见1)，保存甘油菌(方法见
2.2)。将甘油菌扩增并保存到96孔板(Corning Incorporated costar 3599)中，每
个孔对应一条小文库基因，-80℃冻存备用。
2) 将Y190菌液(携带pGB-诱饵基因质粒)平铺在15cm培养皿中, 用96孔 12
replicator(sigma)影印到15cm SD/-Trp 平板上。
将Y187菌(携带pACT2-小文库基因质粒)用96孔replicator从96孔板中影印到15cm SD/-Leu 平板上。
3)生长48-72小时，观察菌落生长情况，每个菌落长至3-5mm，分别印至绒布上。
再从绒布上影印到15cm 2xYPD平板上。Y190菌(携带PGB-X诱饵质粒)的96个克隆和Y187菌(携带pACT2-小文库基因质粒)的96个克隆一一对齐，影印到一起，使其发生Mating。30℃培养20~24小时。
4)Mating完成，再用绒布把菌落从2xYPD平板影印至
SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板上。
5)30℃培养5~14天，在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板生长出来的克隆做膜检
(方法见3)。
6)对膜检显蓝色的菌落做PCR鉴定(方法见2.1)是否为对应的小文库基因，并用
此基因的prey质粒与Bait质粒做共转验证。
2.4.3 注意事项
1) 2XYPD平板培养基应该稍微薄一些，这样培养基比较透明容易观察，可以尽
量保证Y 190菌和Y187菌克隆对齐。
2) 因为Y190为Adenine缺陷菌株，所以菌落为红色。而Y187 非Adenine缺陷
菌株。所以菌落为白色。为了便于操作，一般先把Y187菌影印到2XYPD 平板，然后再影印Y190菌。
3)Mating时应该设置阳性对照，以便监测Mating情况是否良好。
2．5．抽提酵母质粒
1）膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT平板上，约2cm2，然后放置于30℃培养箱中培养3~4天。
2)取一Eppendorf管，加入30μl 5u/μl Lyticase。把菌用牙签刮到lyticase中，V ortex
充分悬浮。37℃孵育30分钟。
3) 加入170μl Lysis Buffer使终体积为200μl。再加入200μl玻璃珠
(425-600microns)，200μl酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，vortex剧烈振荡5分钟。 13
4) 12,000rpm 离心10分钟，将上清转入一干净Eppfendorf管中。注意，不要
把蛋白转移过去。
5)加入8μl 10M NH4Ac和500μl无水乙醇，混匀，-80℃放置1小时。
6)12,000rpm离心10分钟，去上清。
7)加入500μl 70%乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5分钟。
8)弃上清，真空抽干沉淀。
9)将沉淀重悬于10μl ddH2O中，一般取2~3μl转化大肠杆菌。
Lyticase: 将Lyticase干粉溶解在1XTE中，终浓度为5u/μl。
Lysis Buffer: 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Triton X-100 , 0.5% SDS
2.6酵母质粒的扩增
一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的Prey质粒在大肠杆菌中扩增。
2.6.1 大肠杆菌电转感受态制备
1)挑一单克隆接入3ml LB培养基，摇培14~16小时至 OD600=1.0~1.2
2)将摇培后的菌液转接1L LB培养基, 摇培4~5小时至OD600=0.7-0.8
3)离心收菌，10ml冰水溶解
4)5000g，2o C离心10分钟收菌，400ml冰水将菌重悬，冰浴10分钟
5)5000g，2o C离心10分钟收菌，40ml 预冷10%甘油重悬，冰浴10分钟
6)5000g，2o C离心10分钟收菌，加1ml 10%甘油重悬
7)用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的10%甘油(注：等体积10%
甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例：加入1ml10%甘油后重悬菌液体积为4ml，则加入10%甘油量为3ml)
8)分装到Eppendorf管中，每管100μl，冰上操作。
9)-80o C冰箱保存。
14
10)取出两管做阴性、阳性对照。
LB：10g/L蛋白冻,10g/L NaCl；5g/L酵母提取物。121o C，20分钟灭菌。
10%甘油：V甘油：V水=1：9。
2.6.2 电转
1)从-80o C冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电
转仪准备30分钟。
2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态，
用枪吹打均匀(注意，不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常，有利于在出现问题时寻找原因。
3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.4307000569)。(注意，
不要产生气泡)
4) 擦干电转杯上电极两边的壁。
5)将电转杯放入电转仪，启动电极。
6)电击后，用1ml SOC*将感受态洗出，37o C孵育45分钟。
7) 6,000rpm，3分钟离心收菌。
8)涂板。
不同电转杯的最适电压各不相同，经实验：
1mm电转杯的最适电压为1900-2200V
4mm电转杯的最适电压为2300-2500V
8mm电转杯的最适电压为2500-2700V
SOC: 20g/L 蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，pH7.0。121o C，20分钟灭菌。冷却至60o C以下时，每升加入20ml灭菌的1M葡萄糖溶
液。该溶液使用前每升加入5ml灭菌的2M MgCl2。
2.7 Prey质粒与Bait质粒共转Y190(参考1)
1)3个1mm 克隆接种于3mlYPD液体培养基30℃振荡培养20小时(过夜)， 15
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解 2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。 分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）： 溶解 3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用 0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）： 加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于 9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）： 在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加 32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加 0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：
溶解 78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）： 溶解 7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）： 溶解 40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至 5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（ 0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取 186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/LHEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（ 6.8- 8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至 91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT： 溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
常用抗生素： 备注：(摘自《分子克隆》第三版附录 2 ) ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22 ym滤器过滤除菌； ②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素( ampicillin )(100mg/ml ) 溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml? 50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素( carbenicil l in )( 5 0 m g/m l ) 溶解0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林( methicillin )(100mg/ml ) 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml) 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素( chloramphenicol)(25mg/ml) 溶解250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml 。分装
成小份于-20C贮存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素( streptomycin)(50mg/ml) 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸( nalidixic acid )( 5mg/ml ) 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装 成小份于-20C贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素( tetracyyline)(10mg/ml ) 溶解100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以 免溶液见光，于-20C贮存。常以10ug/mI?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。
11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及 明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。 另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
常用抗生素： 备注： （摘自《分子xx》第三版附录2） ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用 0.22μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解 0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解 0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
7 繁殖迅速，培养对象易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌大规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已实现商品化的30多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌生产的。 2.3.3 pBR322质粒载体的特点 （1）具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段 （2）具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。 （3）含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA 停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。（4）限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 2.4基因的导入 2.4.1基因导入的概述 把已知基因转移到真核细胞，并且整合到基因组中得到稳定表达的技术，称为基因导入。它是改变物种遗传性状的最根本途径。要把基因导入细胞，首先要把细胞克隆化。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如β-珠蛋白基因，TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的原核中，再把受精卵植入到生殖管道中，发育成的个体不仅能表达注入
8 基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。 2.4.2基因导入的方法 基因导入的方法总体有物理方法，化学方法和生物学方法。其中物理方法主要有DNA直接注射法、颗粒轰击技术;化学方法主要有脂质体载体、受体介导法；生物学方法主要通过构建病毒载体来完成，常见的有逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。 2.5基因的导入后的筛选与鉴定 2.5.1筛选与鉴定的原因 由于DNA分子的体外重组是分子群体间的反应，因此连接反应完成后的体系中不仅含有正确的重组子，还含有一些不正确的重组子及为重组的DNA，如载体自身环化形成的DNA 分子，外源DNA片段彼此相连形成的多聚物等。因此，连接物转化受体细胞后，我们需要采用适当的方法将所需要的目的基因转化重组子从非重组子中和细胞群体中筛选和鉴定出来。重组子的筛选与鉴定是基因克隆的重要步骤。 2.5.2筛选与鉴定的方法 筛选与鉴定的方法，在遗传选检测上有插入失活筛选、蓝白斑筛选；在物理检测上有酶切鉴定、PCR检测；此外还可利用核酸分子杂交检测，免疫学检测，核酸序列分析等方法。 2.6目的基因的表达与鉴定 2.6.1目的基因表达与鉴定的原因 克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供做结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。 2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法迄今为止，已建立的基因表达系统有多种，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统。常用的原核生物表达系统有大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等；常用的真核生物表达系统是酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统等。而其中最具代表性的是大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。 目的蛋白的鉴定方法包括生化反应检测法，免疫学检测法和生物学活性检测法等。常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western杂交、等点聚焦电泳和双向电泳等。 3、基因工程生产干扰素 3.1、干扰素目的基因的分离与扩增 (1)破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA (2)将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的部分 (3)mRNA反转录成cDNA cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）。 选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒使用Oligo(dT)引物（因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。） 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。 9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。
1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类 基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。 分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度 （1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。