人质膜型唾液酸酶对丁酸钠诱导细胞凋亡的影响及机制研究
禹彬1..2 , 许莉1 ,孙连坤1, 李晓洁1 , 李扬1 * , 赵雪俭1
（1. 吉林大学基础医学院病理生理教研室，吉林长春130021；2. 内蒙古民族大学附属医院, 内蒙古通辽 028000）
【摘要】目的：研究人质膜型唾液酸酶(hmSD)对丁酸钠(NaBT)诱导人雄激素非依赖型前列腺癌细胞(PC3细胞)凋亡的影响及其可能机制。方法：以稳定转染hmSD的前列腺癌细胞(PC3-hmSD细胞)为靶细胞，通过MTT，流式细胞术，吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色等方法观察hmSD与凋亡的关系，应用细胞内ROS 测定，Western Blotting等方法初步探讨hmSD的作用机制。结果：1.NaBT作用下PC3-hmSD细胞的生存率高于PC3细胞，PC3-hmSD细胞的凋亡率低于PC3细胞；2.NaBT诱导细胞内活性氧产生，PC3-hmSD细胞与PC3细胞比较无明显差异；3. NaBT作用下，与PC3细胞比较，PC3-hmSD细胞Bcl－XL、P65的蛋白表达增强，而Caspase9的蛋白表达减弱。结论：1.hmSD具有抵抗NaBT诱导细胞凋亡的作用；2.hmSD对NaBT诱导活性氧产生无抑制作用；3. hmSD抗凋亡作用可能与Bcl-XL、P65表达上调，Caspase9表达下调有关。
【关键词】人质膜型唾液酸酶，前列腺癌细胞，丁酸钠，凋亡
[基金项目] 吉林省科技厅资助项目（20010709）；教育部留学基金资助项目（2003）[作者简介] 禹彬（1974－），女，黑龙江萝北县人，主治医师，医学硕士，主要从事肿瘤病理生理学的研究。
*通讯作者（Tel:0431-********；Email:lyang@https://www.doczj.com/doc/921520038.html,）
Study of apoptosis and its mechanisms of hmSD
overexpressed PC3 cells induced by NaBT
YU Bin1.2 , XU Li1 , SUN Lian-kun1 , LI Xiao-jie1 , LiYang1* , ZHAO Xue-jian1
(1. Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Science, Jilin University, Changchun 130021, China; 2. Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, China)
Abstract: Objective To study of apoptosis and its mechanisms of hmSD overexpressed PC3 cells induced by NaBT.Methods The relation of hmSD and apoptosis was detected by MTT assay, AO/EB-staining and DNA ladder. The antiapoptotic mechanisms of hmSD was research by examining intracellular ROS and Western-blotting methods. Result 1. The survival rate of PC3-hmSD cells is higher than that of PC3 cells treated with NaBT, and the apoptosis rate of PC3-hmSD cells is lower. 2. It was found that no difference of fluorescence intensity between both cell line treated with NaBT. 3. The result of Western blotting showed that the expression of bcl-xl decreased in NaBT treated PC3 cells, but it increased in PC3-hmSD cells. Compared with respective control group, the expression of P65 and caspase9 increased in NaBT treated cells, but the increased P65 and decreased caspase9 expression was found in hmSD overexpressed cells. Conclusion 1. NaBT can induce the apoptosis of PC3 cells, and hmSD can reverse it. 2. The pathway of hmSD against apoptosis may be no relation with the suppressed ROS synthesis. 3. The antiapoptotic mechanisms of hmSD may be involved in the downregulation of caspase9 and the upregulation of P65 and Bcl-xl expression.
Key word: hmSD; PC3 cell; NaBT; apoptosis
人质膜型唾液酸酶(human membrane associated sialidase/hmSD/Neu3)主要存在于细胞膜，是膜内在蛋白，具有严格底物特异性，在细胞表面调节上发挥重要作用[1]。许多研究表明hmSD与凋亡的发生密切相关。我们的前期工作证明hmSD 可抵抗丁酸钠(NaBT)诱导的前列腺癌细胞凋亡[ ]。提示hmSD有可能成为新的前列腺癌的肿瘤标志物[2]。但二者之间的关系究竟如何，通过何种途径发挥其作用，hmSD如何影响前列腺癌细胞凋亡，尚不清楚。本实验以稳定转染hmSD的人雄
激素非依赖性前列腺癌PC3细胞(PC3－hmSD)为研究对象，在观察NaBT诱导细胞凋亡基础上，初步探讨其可能的机制，为前列腺癌的诊断治疗奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1细胞株及试剂将本实验室保存的前列腺癌细胞株PC3，稳定转染hmSD质粒的PC3细胞株(以下简写为PC3-hmSD细胞)，培养于含10%小牛血清IMDM 培养液中，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，第二天换液，2到3天传代。其中PC3-hmSD细胞培养液中加入200μgG418/ml，在给予NaBT处理前停用G418。NaBT(以无菌去离子水配制成0.2M的贮存液，高压灭菌，4℃保存，使用时用培养液稀释成所需浓度)。
1.2 MTT法检测NaBT对PC3-hmSD细胞和PC3细胞增殖的影响分别取对数生长期PC3-hmSD细胞及PC3细胞，0.25％胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于无菌96孔培养板，24h后细胞贴壁生长，分组加药。两种细胞分别分四组○1对照组，○2NaBT
2.5mM组，○3NaBT 5mM组,○4NaBT 10mM组。每组设三个培养时间(24h，48h，72h)，每个培养时间设四复孔。药物作用结束前4h每孔加MTT(5mg/ml)20μl，孵育4h弃培养液，每孔加DMSO100μl，摇床震荡10min，转移至酶标仪检测各孔的吸光度值(OD570)。
1.3吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色检测凋亡细胞取生长状态良好的PC3-hmSD细胞及PC3细胞，调整浓度为5×105/ml，接种于6孔培养板，每孔1ml,孵育24h,分为对照组和用药组(根据MTT结果选择NaBT 5mM),作用4h后，吸出培养液，PBS洗三次，每孔加PBS1ml及配制好的AO/EB 30μl(其中AO、EB各为100μg/ml)，避光孵育10min，激光共聚焦显微镜观察照相记录（488nm，523nm双波长激发）。
1.4 DCFH-DA激光共聚焦法检测细胞内ROS水平取对数生长期PC3-hmSD细胞和PC3细胞接种于24孔培养板(4×105/孔/ml)，37℃恒温培养24h后，分别加入NaBT 5mM作用细胞4h，PBS洗两次，每次5min，加入含DCFH-DA(10μM)的PBS100μl，37℃避光孵育30min，弃PBS，PBS 洗涤细胞两次(5min/次)，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。激光共聚焦显微镜观察药物作用后的荧光强度(激发波长488nm，发射波长525nm)，荧光强度代表细胞内活性氧的产生情况。
1.5Western Blotting检测Bcl-XL、P65、Caspase9的蛋白表达PC3-hmSD细胞和
PC3细胞，分别经NaBT 5mM 作用8h ，提取每组细胞的总蛋白，采用Bio-Rad 法测定蛋白含量。取总蛋白80μg 作SDS-PAGE 电泳分离蛋白样本。用电转仪将蛋白样本转移至PVDF 膜上，电流等于胶面积×0.55。PVDF 膜用5%脱脂奶粉封闭1h ，PBST 洗三次，分别加入Bcl －XL 抗体、P65抗体、Caspase9抗体 (1：500稀释)，4℃过夜。次晨，PBST 洗三遍，10min/遍，加入Western Blotting 过氧化物酶标记的IgG(1：2000稀释)，脱色摇床摇1h ，PBST 洗三遍，5min/遍。DAB 显色，拍照。 1.6 统计学方法 各组数据采用mean±SD 表示，统计学处理采用SPSS11.5软件分析，各实验组间均值比较采用ANOVA 检验。 2 结 果
2.1 NaBT 对PC3-hmSD 细胞和PC3细胞生长的影响 MTT 比色法结果显示，随着NaBT 作用时间的延长和剂量的增加，细胞存活率逐渐降低。并且相同剂量、相同时间，PC3-hmSD 细胞的存活率高于PC3细胞（如图1所示）。
A B
图1. NaBT 处理后PC3-hmSD 细胞和PC3细胞生存率（24h,48h,72h ）
Fig1. The survival rate of PC3-hmSD and PC3 cells treated with NaBT
00.20.40.60.811.2CON
2.5mM
5mM 10mM
72h
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 CON
2.5mM
5mM
10mM
48h
C
* P<0.05，** P<0.01 compared with Control; n=4
# P<0.05，## P<0.01 compared with PC3 cell; n=4
2.2 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色检测细胞凋亡激光共聚焦显微镜观察，对照组细胞为梭形或多角形，细胞膜光滑无皱缩或发泡，细胞核染色质为均匀的绿色，形态规则。NaBT 5mM组作用4h后，细胞体积明显缩小，细胞核出现典型的凋亡形态改变，早期凋亡细胞：核染色质着绿色，低倍镜下呈荧光亢进的固缩状或圆珠状小体，高倍镜下呈不规则块状荧光（新绿色斑点）。晚期凋亡细胞：核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。偶可见死亡细胞：细胞体积明显增大，核染色质着不均匀的橘红色，无染色质凝集。各组细胞中凋亡细胞所占百分比如表1所示。可见相同处理因素作用下，PC3－hmSD细胞组的凋亡细胞百分比低于PC3细胞组，证明hmSD具有抗凋亡作用。
Tab1. The apoptotic percentage of NaBT treated cells stained with AO/EB (%)
PC3 cells PC3-hmSD cells
Control 3.3±1.52 4.3±0.58
NaBT(5mM) 32.0±2.00 22.3±2.08*
*P<0.05 compare with PC3 cells
2.3 细胞内 ROS 水平的检测结果图2A为激光共聚焦显微镜观察照片，左边为荧光照片，右边为同一视野下生活态细胞。结果显示：两种细胞对照组只能观察到极微弱的荧光，NaBT 5mM作用4h，荧光强度均较各自对照组增强，但两种细胞相比，荧光强度无明显差异，提示hmSD拮抗NaBT诱导细胞凋亡可能与上调细胞内活性氧无关。(图2B为IPP5软件分析结果)。
A PC3 cells PC3-hmSD cells
con
NaBT
(5mM)
B
500000
100000015000002000000250000030000003500000
CON NaBT(5mM)
f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y
图2. 共聚焦显微镜下检测PC3-hmSD 细胞和PC3细胞内活性氧水平
Fig2. A, intracellular ROS in PC3 and PC3-hmSD cells exposed to NaBT for 4h (observed with laser cofocal microscope)
B, fluorescence intensity of ROS stain in cells treated with NaBT
2.4 Bcl-XL 、P65、Caspase9的Western blotting 结果 如图3所示，NaBT 作用PC3-hmSD 细胞和PC3细胞8h ，PC3-hmSD 细胞Bcl-XL 的蛋白表达增强，PC3细胞Bcl-XL 的蛋白表达减弱，两组比较差异显著(P<0.01)。在两组细胞P65和Caspase9的蛋白表达均较各自对照组增加，但PC3-hmSD 细胞Caspase9表达弱于PC3细胞，而P65表达强于PC3细胞（P<0.01）。
B Bcl-XL expression
C P65 expression
0.51
1.52
con
NaBT(5mM)
P r o p o r t i o n o f c o n t r o n P 65p r o t e i n c o n t e n t (%)
D Caspase9 expression
图3. Bcl-XL 、P65和Caspase9的蛋白表达
Fig 3.The content changing of Bcl-XL (B)、P65 (C) and Caspase9 (D)
in two kinds of cells dealed with NaBT for 8h. 1.con 2. NaBT(5mM)
* P<0.05，** P<0.01 compare with Control; n=3 # P<0.05，## P<0.01 compare with PC3 cell; n=3
PC3 cells PC3-hmSD cells
β-actin
42KD Bcl-XL
28KD
P65
65KD
Caspase9
46KD
1 (2)
1 (2)
3 讨论
有研究显示，在肾细胞癌[3]、结肠癌[4]、乳腺癌[5]等hmSD的表达普遍升高。本实验组前期工作已证实hmSD在前列腺癌组织中比非癌组织高4.5－6倍，且hmSD的表达与肿瘤细胞分化程度呈正相关；并证明hmSD对丁酸钠诱导的PC3细胞凋亡具有抵抗作用[6]。本实验利用高表达hmSD的PC3细胞株在证实hmSD 拮抗NaBT诱导细胞凋亡的基础上，对其机制进行了初步探讨。
氧化应激是细胞凋亡的重要通路，本实验利用DCFH进行了细胞内ROS的检测，结果发现，hmSD对丁酸钠诱导的活性氧产生并无明显抑制作用，与PC3细胞组比较无统计学意义。说明hmSD抵抗凋亡可能不主要通过抑制细胞内活性氧实现的。对凋亡相关基因蛋白表达的检测结果发现，在丁酸钠的作用下，PC3-hmSD细胞中促凋亡蛋白Caspase9的表达较PC3细胞增高显著。有研究表明，丁酸钠诱导结肠癌等多种肿瘤细胞凋亡，可能是通过对Bcl-2的调节引起线粒体膜电位改变，从而引起Caspases的级联活化，诱导肿瘤细胞凋亡[8]。p65是对氧化敏感的核转录因子。当细胞发生氧化应激时，p65迅速从细胞质移位入核，促进相关基因的转录[9]。Barkett等的研究认为p65是一种能够诱导促进细胞存活的蛋白表达的转录因子，它通过抗凋亡基因Bcl-XL，抑制凋亡蛋白c-IAP1，c-IAP2或调节肿瘤抑制因子PTEN来实现[10]。本实验中，加入丁酸钠后两种细胞均出现P65蛋白表达升高，但与PC3细胞相比，转染hmSD的PC3细胞P65蛋白表达增高显著。此结果支持Barkett等人的理论。然而hmSD与NF-κB之间存在着怎样的调节通路，还有待进一步研究。在丁酸钠诱导结肠癌细胞凋亡中，丁酸钠可能通过Bax和Bak等介导凋亡前蛋白的作用，下调Bcl-XL的表达[12]。本实验结果显示，高表达hmSD的PC3细胞中Bcl-XL的表达水平较PC3细胞为高。表明hmSD可能通过上调Bcl-XL的表达发挥其凋亡抵抗作用。
综上所述，hmSD的抗凋亡作用可能是通过下调Caspase9的蛋白表达，上调Bcl-XL和P65的蛋白表达实现的。为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的思路和实验基础。
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