硕士学位论文
题目
母鼠妊娠前慢性不可预见性应激对子代血清CRH、COR和海马PKA、p-CREB（ser133）的影
响
英文题目
The effect of maternal pre-gestational CUS on the serum CRH and COR level，hippocampus PKA and p-CREB expression of offspring rats
姓名李碧燕学号200571031 所在学院医学院导师姓名史雪川
专业儿科学（新生儿方向）
入学日期2005年9月答辩日期2012年5月
学位论文原创性声明
本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。
作者签名：日期：年月日
学位论文使用授权声明
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作者签名：导师签名：
日期：年月日日期：年月日
目录
目录………………………………………………………………………………I
英文缩略词表.............................................................................. II 中文摘要.................................................................................... III 英文摘要.................................................................................... VI 论文正文 (1)
第1章前言 (1)
第2章材料与方法 (3)
第3章结果 (11)
第4章讨论 (25)
第5章结论与展望 (30)
第6章参考文献 (31)
文献综述 (36)
致谢 (46)
个人简历 (47)
英文缩略词表
英文缩写英文全称中文全称
ACTH adrenocorticotropic hormone 促肾上腺皮质激素
BDNF brain-derived neurotrophic factor 脑源性神经营养因子
cAMP cyclic adenosine monophosphate 环磷酸腺苷
COR cortisol 皮质醇
CRH corticotropin-releasing hormone 促肾上腺皮质激素释放激素CREB cAMP response element binding protein cAMP反应元件结合蛋白
CUS chronic unpredictable stress 慢性不可预见性应激
DA dopamine 多巴胺
ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附反应
FST forced swimming test 强迫游泳实验
GC glucocorticoid 糖皮质激素
GR glucocorticoid receptors 糖皮质激素受体
HPA hypothalamo-pituitary-adrenal 下丘脑-垂体-肾上腺
LTP long term potentiation 长时程突触增强效应
MR mineralocorticoid receptor 盐皮质激素受体
NCAM neural cell adhesion molecule 神经细胞粘附因子
NMDA N-methyl-D-aspartate N-甲基-D-天冬氨酸
NR N-methyl-D-aspartate receptor N-甲基-D-天冬氨酸受体
OFT Open Field Test 开场实验
p-CREB phosphorylated CREB 磷酸化cAMP反应元件结合蛋白PKA protein kinase A 蛋白激酶A
PS prenatal stress 出生前应激
PND postnatal day 出生后日期
PVN hypothalamic paraventricular nucleus 下丘脑室旁核
SD rat Sprague-Dawley rat SD大鼠
5-HT 5-hydroxtryptamine 5-羟色胺
中文摘要
背景和目的
目前研究发现母体在妊娠各阶段接受慢性不可预见性应激（chronic unpredictable stress, CUS）均可引起子代神经系统发育异常，并在一定程度上导致子代出现学习、记忆能力障碍及行为的异常。母源性应激对子代的影响机制极为复杂，目前研究认为主要与下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic pituitary adrenal, HPA）轴、单胺类神经递质通路和神经肽有关。本课题组前面的研究中也发现，母鼠妊娠前接受CUS亦可导致子代血清皮质醇（cortisol, COR）升高，并与子代海马中的脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经细胞黏附因子（neural cell adhesion molecule, NCAM）、N-甲基-D天冬氨酸受体2B(N-methyl-D-aspartate receptor 2B, NR2B)表达呈负相关，此外我们还发现母鼠妊娠前接受慢性应激的胎鼠，其大脑海马和额前皮质的5-HT1A受体mRNA转录水平显著下降,5-羟色胺（5-hydroxtryptamine,5-HT）代谢紊乱。关于妊娠前CUS对子代的影响，目前研究仍处于初级阶段，具体机制需进一步探索。本实验通过建立SD大鼠CUS模型，使母鼠于CUS 后短期内受孕，并在母鼠CUS终止后、分娩结束时和所产子鼠28日龄时分别检测血清促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin- releasing hormone，CRH）和COR水平，并通过分析28日龄子鼠海马蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和ser133位点磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein ，P-CREB）表达水平，更深入地探讨母体孕前CUS对子代神经系统发育及学习记忆能力的影响。
材料和方法
SD系成年雌性大鼠随机分为正常对照母鼠组（13只）和孕前CUS母鼠组（12 只）。采用11种刺激方法对 CUS 母鼠组进行21 天CUS。CUS 模型建立完毕后，两组母鼠分别进行断尾取血留待CRH和COR检测。将正常对照母鼠组和 CUS母鼠组分别与成年健康雄性大鼠按2-3:1合笼饲养1周，每天早上8:00 对母鼠进行阴道分泌物涂片检查，以显微镜下查看到精栓为妊娠的标志，确定已受孕的母鼠则单笼饲养至依次分娩，于分娩后6小时内断尾取血。将子代大鼠按性别分为正常雌性子代组（CF）、正常雄性子代组（CM）、CUS 雌性子代组（CUSF）和 CUS雄性子代组（CUSM） 4 组，每组各 18只。在子代大鼠28日龄时进行断头取脑、采血，应用Elisa法测定其血清中CRH、COR水平，用免疫组织化学方法测定其海马中PKA、p-CREB(ser133)的表达情况，并将CUS子代组与同期受孕的正常
子代组进行同性别间对照研究。
结果
1. 母鼠应激结束时，CUS组和对照组的血清CRH分别为（25.19±5.74）pg/ml和（17.34±
2.41）pg/ml（P＜0.01）,CUS组和对照组的血清COR分别为（102.34±9.73）ng/ml和（88.41±8.72）ng/ml（P＜0.01），CUS组均增高。受孕母鼠分娩结束时，CUS组和对照组的血清CRH分别为（52.47±16.04）pg/ml和（2
3.09±3.86）pg/ml（P＜0.01）,CUS 组和对照组的血清COR分别为（12
4.25±9.61）ng/ml和（107.49±7.56）ng/ml（P＜0.01）；两者在CUS组仍高于对照组。分娩结束后两组母鼠血清CRH、COR水平均较CUS结束时高，自身前后对比差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
2. 子鼠28日龄时CUSF组和CF组的CRH水平分别为（26.60±1.10）pg/ml和（15.70±4.72）pg/ml，COR水平分别为（117.80±14.87）ng/ml和（95.73±17.65）ng/ml；CUSM 组和CM组CRH水平分别为（31.86±18.26）pg/ml和（16.65±8.35）pg/ml，COR水平分别为（114.16±17.68）ng/ml和（84.89±11.62）ng/ml，同性别组间差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
3. 子鼠海马的PKA表达 CA1区CUSF组、CF组平均灰度值分别为211.24±12.10、198.46±12.17，在CUSM组、CM组分别为212.13±6.43、199.29±6.36；在CA3区CUSF 组、CF组平均灰度值分别为205.69±8.07、189.52±12.76,在CUSM组、CM组分别为205.29±15.01、195.15±8.94, CUS组子鼠海马CA1、CA3区PKA表达均较对照组子鼠低，同性别组间差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
4. 子鼠海马的p-CREB(ser133)表达 CA1区CUSF组、CF组平均灰度值分别为237.14±
5.69、230.84±3.23，在CUSM组、CM组分别为238.56±5.47、228.46±8.15；在CA3区CUSF组、CF组平均灰度值分别为231.55±9.11、221.40±7.49，在CUSM组、CM组分别为231.84±7.73、222.82±10.61, 在DG区CUSF组、CF组平均灰度值分别为230.23±5.71、219.23±7.33，在CUSM组、CM组分别为230.47±5.65、220.94±
6.72； CUS组子鼠海马CA1、CA3和DG区p-CREB(ser133)表达均较对照组子鼠低，同性别组间差异有统计学意义（P＜0.01）。
5. 子鼠28日龄时海马CA1、CA3区PKA表达与血清CRH及COR水平呈负相关，在CA3和DG区p-CREB(ser133)表达与血清COR水平呈负相关。
结论
1、妊娠前接受CUS的母鼠 HPA轴亢进。CUS结束后短期内受孕，其HPA轴亢进持续存在
于整个妊娠阶段乃至分娩后。
2、母鼠妊娠前接受CUS后短期内受孕，因CUS所致母鼠的HPA轴功能失调可持续存在于整个妊娠期乃至分娩后，通过母体-胎盘-胎儿界面，直接或间接导致子鼠的HPA轴功能亢进。
3、妊娠前接受CUS母鼠所产子鼠28日龄时，大脑海马CA1和CA3区PKA表达较对照组子代显著降低，在海马CA1、CA3及DG区p-CREB(ser133)表达均较对照组子鼠低，且与子代HPA轴亢进关系密切。
关键词
大鼠；妊娠前；慢性不可预见性应激； CRH；COR；PKA；p-CREB(ser133)
Abstract
Backgrounds and aims
The chronic unpredictable stress (CUS) before or throughout the whole pregnancy impairs neural development of the offspring, as well as their cognition, memory and behavior. Despite the variety in methodology, most studies show that it is concerned with hypothalamio-pituitary-adneral (HPA) axis, serotoninergic (5-HT ergic) system. Our recent research indicated that mother exposed to pre-gestational CUS increased the COR level of the offspring which impaired the expression of nervous system related proteins (BDNF, NMDA, etc), as well as the ratio of 5-HIAA to 5-HT and the expression of 5-HT1A receptor and serotonin transporter in the brain of foetal rat. However the mechanism of maternal CUS is still unclear and further studies are proposed to pay more attention to it. In this research, we established a CUS model using Sprague-Dawley (SD) rats, made them pregnant right after the 21-day stress procedure and detected the CRH and COR levels before pregnancy and after delivery. When the offspring were 28-day old we detected the serum CRH and COR level as well as PKA and p-CREB(ser133) expression in the hippocampus to study how maternal pre-gestation maternal CUS affects the neural development and behaviors of the offspring.
Methods
Adult female SD rats were divided randomly into two groups: control group (n=13) and CUS group (n=12). When the procedure of CUS finished (24 hours after the last stressor), female rats were housed by pairs with a male for one week for mating, before which blood samples were collected for CRH and COR detection. The day on which sperm was observed in vaginal smears was designated as embryonic day 0 (E0). The day of delivery was designated as postnatal day 0 (PND0), within 6 hours we collected blood samples again for post-delivery CRH and COR tests. The offspring rats were divided according to their maternal group: offspring of control group (n=36; 18 females in CF group and 18 males in CM group) and offspring of CUS group (n=36; 18 females in CUSF group and 18 males in CUSM group). When the offspring rats were PND28, they were killed and blood samples were collected for serum CRH and COR tests,
hippocampuses were separated, fixed, embedded and formed paraffin section. PKA and p-CREB(ser133) of the hippocampus were measured by immunohistochemistry. Results
1. After the stress procedure, maternal serum CRH level in CUS group(25.19±5.74) pg/ml was higher than control group(17.34±
2.41)pg/ml, (P＜0.01). The COR level in CUS group(102.34±9.73)ng/ml was also significantly higher than controls (88.41±8.72) ng/ml, (P＜0.01). The post-delivery CRH level in CUS group (52.47±16.04)pg/ml was higher than controls (2
3.09±3.86)pg/ml, (P＜0.01), the post-delivery COR level in CUS group(12
4.25±9.61) ng/ml was also significantly higher than controls (107.49±7.56) ng/ml, (P＜0.01). After delivery the serum CRH and COR levels of two groups were higher than that at the end of CUS, the differences were highly significant (P＜0.05 or P ＜0.01).
2. The CRH level was higher in CUSF group (26.60±1.10)pg/ml than CF group (15.70±4.72) pg/ml, the COR level of CUSF group (117.80±14.87)ng/ml also presented a significant increase than the CF group (95.73±17.65)ng/ml; And the CRH level of CUSM group (31.86±18.26)pg/ml was significantly higher than the CM group (16.65±8.35) pg/ml; The COR level of CUSM group (114.16±17.68)ng/ml also presented a significant increase than the CM group (84.89±11.62)ng/ml; All the above differences were highly significant(P＜0.05 or P＜0.01).
3. The grey value of PKA in CA1 and CA3 sub-regions in the CUSF group (211.24±12.10),( 205.69±8.07)was higher than CF group(198.46±12.17), (189.52±12.76),as well as the CUSM group(212.13±6.43),( 205.29±15.01)comparing with CM group (199.29±6.36),(195.15±8.94),（P<0.01).
4. The grey value of p-CREB(ser133) in CA1, CA3 and DG sub-regions in the CUSF group(237.14±
5.69),( 231.55±9.11),( 230.23±5.71) was higher than CF group(230.84±3.23), (221.40±7.49),( 219.23±7.33) as well as the CUSM group(238.56±
5.47),( 231.84±7.73),( 230.47±5.65)comparing with CM group(228.46±8.15),( 222.82±10.61),( 220.94±
6.72) (P<0.01）. Higher grey value means less protein expression,
5. The CRH and COR level of 28-day old offspring were negatively correlated with the expression of PKA in hippocampus CA1 and CA3 sub-regions. The COR level of 28-day old offspring was negatively correlated with the expression of p-CREB(ser133) in hippocampus CA3 and DG sub-regions.
Conclusion
1. The CRH and COR levels of maternal rats suffering from CUS were significantly higher than control group not only after the CUS procedure but also after delivery, which indicates HPA-axis hyperactivity of CUS maternal rats exists throughout the whole pregnancy.
2. The CRH and COR levels of 28-day old offspring of CUS group were significantly higher than those of control group. which indicates maternal HPA-axis hyperactivity and imbalance may lead to HPA-axis hyperactivity of the offspring directly or indirectly.
3. Fertilization short-term after CUS decreased its offspring rats’PKA and p-CREB(ser133) expression in hippocampus and significantly correlated with the serum COR level, a conclusion can be drawn that the brain function insufficiency of offspring are the consequence of both HPA-axis hyperactivity and PKA-CREB signaling pathway disorder.
Keywords Rat; pre-gestational; CUS; CRH; COR; PKA; p-CREB(ser133)
第一章前言
应激是指机体的不协调状态或内环境稳定受到威胁，当机体处于应激状态时即出现下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴及交感肾上腺髓质活性增强，是机体的防御性反应。但过度或慢性应激可对机体造成损害，引起神经内分泌紊乱，并导致体重减轻、活动减少或激越、抑郁、焦虑等症状[1,2]。生命早期环境对个体发育起着尤其重要的作用，早期不良因素可影响神经细胞的生长、增值和分化，改变脑结构和功能。发生于妊娠各阶段的母源性应激，不仅对亲代的身心健康产生影响，而且可降低子代的出生体重，并导致子代出生后出现情感或认知障碍，包括注意力缺陷、多动，焦虑，语言发育迟缓以及学习能力低下等[3]。
母源性应激引起子代出现行为异常发生的机制，目前认为主要与下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进有关。有研究指出，胎鼠 HPA 轴对母源慢性应激的反应，表现为自妊娠15天开始下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）CRH mRNA的表达增加[4]。有学者通过妊娠晚期应激动物模型，发现其胎儿血循环中血清皮质醇（cortisol, COR）升高，同时儿茶酚胺的含量增加，胎儿血中的 COR 升高是由母体中 COR 结合蛋白减少和 HPA 轴调节功能失常引起的[5,6]。目前研究认为，出生前母源性应激对子代HPA轴影响分为对外周分泌影响和对中枢负反馈影响两部分。对外周分泌影响的可能机制包括：（1）母体接受慢性应激后HPA轴亢进，产生过多的皮质醇直接通过胎盘屏障进入胎儿血液循环；（2）母体异常的皮质激素释放刺激胎盘产生CRH，进入胎儿循环，导致胎儿皮质醇生成增多；（3）母体产生的过多皮质醇导致子宫胎盘血管收缩，导致子宫胎盘血流减少，造成胎儿营养及氧供应下降，使胎儿自身应激，导致胎儿肾上腺皮质功能亢进[7]。当胎儿发育中的大脑暴露于高水平的COR 时，会减少海马神经元形成[8]，其结果是导致子代海马的结构异常，边缘系统功能障碍。有研究发现，产前束缚应激影响子代海马的正常发育，表现为对子代海马神经元及其超微结构的损害[9]。应激诱导子代海马CA3区的苔藓纤维出芽，孕期不同时期的应激对雌、雄子代苔藓纤维出芽的影响有所不同，对突触可塑性的影响不同[10]。海马及大脑边缘系统是主管学习记忆的重要脑结构，这些改变所导致的不良影响在胎儿出生后可长期存在，子代的神经行为异常可持续至成年[11]。
近年来研究发现，高水平皮质醇除直接损伤胎儿脑组织外，还可导致大脑生物学异常，从而对其神经系统发育及行为产生深远的影响。目前关于母源性应激对子代产生影响的相关研究多局限于妊娠期间，对于妊娠前慢性应激对子代的影响则较少。有研究发现接受孕前母源性应激，其雄性子代鼠青年期出现抑郁样表现，水迷宫实验中穿越平台的次数明显
降低，同时其下丘脑5-HT水平升高，海马磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylated Cyclic AMP responsive element-binding protein, P-CREB)表达减少[12]。环磷酸腺苷( cAMP)信号级联是细胞内经典的信号通路,其传导途径包括:外源性的刺激引起神经递质的释放(如5-羟色胺、去甲肾上腺素等),这些神经递质与细胞膜上相应的受体结合(如G蛋白), G蛋白可调节腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)的活性, AC可大量催化ATP转变成cAMP,使神经细胞内的cAMP浓度增高, cAMP再激活PKA,活化的PKA转运至细胞核,使CREB 的Ser133位丝氨酸磷酸化, CREB的磷酸化可以实现对相关基因的诱导和调控[13]。已有研究发现PKA-CREB这一信号通路直接参与了水迷宫空间学习记忆的形成[14]。本课题组前期研究[15]通过动物实验已证实妊娠前CUS亦可导致子代血清COR升高，并与子代海马中BDNF、NCAM、NR2B表达呈负相关，且其水迷宫试验逃避潜伏期延长。此外我们还发现母鼠妊娠前接受慢性应激的胎鼠，其大脑海马和额前皮质的5-HT1A受体mRNA转录水平显著下降[16],5-羟吲哚乙酸与5-HT的比率降低，5-HT1A受体及色氨酸转运体表达水平均降低[17]。我们设想，母鼠妊娠前CUS导致神经内分泌紊乱可能持续较长时间，导致母体内环境紊乱，尽管受孕时不良应激已不存在，但仍可能对子代HPA轴及大脑发育产生影响，使其子代出现学习记忆障碍及行为学异常，神经系统cAMP信号通路功能紊乱可能是机制之一。
基于以上假设，本实验构建CUS母鼠模型，并使其在应激结束后1周内受孕。用Elisa 检测其应激结束后及分娩结束后血清COR、CRH水平。子鼠28日龄时采用免疫组织化学染色法检测海马中p-CREB（ser133）及PKA的表达情况，用Elisa法检测血清COR、CRH水平，并与同期受孕的正常母鼠所产子代大鼠进行对照研究，探讨母鼠妊娠前接受CUS后短期内受孕是否导致子代出现大脑神经细胞信号传导紊乱，对子代大脑发育及学习记忆能力产生不良影响。
第2章材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1实验动物
选择育龄期未孕Sprague–Dawley（SD）系大鼠为实验动物，均由广东省医学实验动物中心提供，其中雌性大鼠25只，体重180-200g；雄性大鼠8只，体重250-300g，用于交配；除雄鼠外均单笼饲养。实验前，所有动物适应性喂养1周，每日抚触1次，每次2分钟，使动物适应实验人员的操作。动物房室温由空调控制在 22℃±2℃，自然光照，自由进食、饮水。
2.1.2 实验仪器
（1）压力灭菌消毒器：上海申安医疗器械厂
（2）电子天平：美国双杰兄弟有限公司
（3）4℃冰箱：中国海尔电器公司
（4）－20℃低温冰箱：中国海尔电器公司
（5）－80℃超低温冰箱：美国Thermo公司
（6）雪花制冰机：美国Ross Temp公司
（7）微量加样器：德国Eppendorf公司
（8）医用超净工作台：苏净集团安泰公司
（9）空气浴恒温振荡器：常州国华电器有限公司，型号SHZ-82
（10）电脑控制的自动电击足底装置：自制，由台式电脑一台、提供恒流的变压
器和10 个底部装有导电装置的有机塑料箱3部分组成
（11）行为束缚桶：由矿泉水瓶自制，直径6.5cm，长15cm
（12）手术器械：上海医疗器械有限公司
（13）光学显微镜：日本OLYMPUS公司
（14）恒温培养箱：日本SANYO公司
（15）离心机：德国Eppendorf公司
（16）酶标仪：美国BIO-TEK公司
（17）包埋机：德国LEICA公司铲平
（18）生物组织自动脱水机：德国LEICA公司产品
（19）石蜡切片机：德国LEICA公司产品
（20）生物组织摊片考片机：CS-Ⅲ型，湖北省医用电子仪器厂
（21）高压锅：上海三申医疗器械有限公司
（22）光学显微镜：日本OLYMPUS公司
（23）HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统：武汉千屏影像技术有限公司
2.1.3 主要试剂
（1）大鼠皮质醇Elisa 试剂盒：美国RB公司
（2）大鼠CRH Elisa 试剂盒：美国RB公司
（3）免疫组化试剂盒：武汉博士德公司
（4）DAB显色试剂：福建迈新公司
（5）一抗（兔抗PKA多克隆抗体IgG）：武汉博士德公司
（6）一抗（兔抗p-CREB(ser133)多克隆抗体IgG）：美国Santa公司
（7）二抗（PV-6000）：武汉博士德公司
（8）多聚甲醛：汕头生物制品有限公司
（9）3%过氧化氢：Invtrogen公司
2.1.4主要实验液体的配制
1）4%甲醛：40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500-800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（phosphate Buffer solution，PBS），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，常温保存。
2）PBS液：在800ml蒸馏水中溶解8gNacl、0.2gKCl、1.44gKH2PO4，用HCl调节溶液的PH至7.4,加蒸馏水至1L，保存于室温。
2.2 实验方法
2.2.1 实验动物的分组
母鼠分组：将25只母鼠随机分为2组：应激组（CUS组）和正常对照组，其中CUS
组13只，对照组12只。（CUS组母鼠有1只在行为束缚过程中窒息死亡，1只应激结束后生病死亡，1只生产子鼠后生病死亡，有2只出现吞食子鼠行为；对照组有3未能在合笼一周内受孕）。
子鼠分组：子鼠28日龄时，为进行子代性别间的比较，将子鼠按母鼠窝次分别编号，随机选取子鼠并按性别分入应激雄性组（CUSM）、应激雌性组（CUSF）和对照雄性组（CM）、对照雌性组（CF），每组各18只。
2.2.2 实验动物CUS模型的建立
本实验借鉴了Willner P[18]于1987年提出的“慢性温和不可预知性应激模型”制作方法。Willner在原有的CUS模型基础上进行了两方面的改动，一是使应激刺激的强度明显降低；二是以快感缺失的测量作为模型是否成功的关键。其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症发生及发展的机制更接近。在该模型中,应激刺激的多变性和不可预测性是模型制造成功的关键。在经过长期温和应激后动物出现快感缺失[19]。本课题组在前面的研究中，经过反复探索及实践，建立CUS动物模型的方法已经成熟[15,16]。本实验仍沿用前面的建模方法。
开场实验（open field test, OFT）是一种检测大鼠的活动量以及对新环境的警觉性、适应性和认知能力的方法[20]。我们前面的研究发现，在模型建立前，两组母鼠在开场实验中的各项指标均无差异，但经过21天CUS之后，CUS母鼠组总路程及周边路程无论是与正常对照母鼠组相比、还是自身前后对比均明显减少，说明了该组大鼠经过CUS后活动度下降，对环境的好奇程度下降，表现出抑郁样行为[15,16]。蔗糖水消耗实验中蔗糖水消耗量、蔗糖水偏爱百分比是作为测量动物模型快感缺乏的客观指标[21]。CUS 母鼠组建立模型后这两项指标显著减少，说明了该组大鼠经过 CUS后对奖赏的敏感性降低，出现快感缺失，这与目前国内外其他学者的研究结果一致[22,23]。
整个建模过程持续21天，共有11种刺激（如下表），随机安排，每天一种，每种刺激出现1-2次，同种刺激不连续出现，以避免动物的适应现象或预测刺激的发生。
应激日程应激因素操作方法
第1、17天禁水不放置水瓶，禁水24小时
第2、16天潮湿垫料30cm×20cm×20cm的鼠笼底部铺满垫料，然后往垫料中均匀浇
入250ml自来水，大鼠在此环境中生活24小时
第3、13天夹尾在距尾根部1cm处，用塑料夹子夹住大鼠尾部，持续1分钟。第4、15天高温环境利用空气浴恒温振荡箱进行，设定温度为45℃，关闭震荡功能，
将大鼠至于此环境中10分钟。
第5、19天明暗颠倒8:30至18:30将大鼠放置于隔光的暗房间中，18:30至次日8:30
将动物放置在日光灯照射的房间中，自由进食、饮水，通风良
好。
第6、12天禁食不放置饲料，禁食24小时。
第7、18天冰水游泳将冰和自来水混合成4℃的水，加入透明的圆形塑料桶中，水深
为20cm，将大鼠放入桶中游泳5分钟。
第8、20天行为束缚利用自制的行为束缚筒，将动物装入其内，束缚2小时
第9、21天倾斜鼠笼将鼠笼45°倾斜放置，大鼠在此环境中生活24小时
第10、14天水平震荡利用空气浴恒温振荡箱进行，设定温度为25℃，振荡频率为4
次/秒，持续10分钟
第11天电击足底利用电脑控制的自动电击装置，设定电流强度为1.0mA每次电
击持续1秒，每分钟10次，持续10分钟
2.2.3 母鼠的体重记录与血标本采集
（1）母鼠的体重
在CUS开始前（W0）、第1周末（W1）、第二周末（W2）、第3周末（W3）分别对两组母鼠体重进行测量，并记录结果。
（2）血标本的采集和处理
为尽可能降低采血过程对母鼠的刺激，本实验采用断尾取血法。方法如下：采血时间为上午9:00至12:00，用大鼠固定器将大鼠固定好，碘伏棉枝消毒鼠尾尖部，用消毒手术剪剪去尾尖10 mm，然后从尾根部向尾尖按摩，血自尾尖流出，以无菌2ml离心管盛接血
液，每只母鼠采血1.5ml，采血后以干灭菌棉球压迫止血。
分娩后的母鼠于6小时内采血，方法同上，为避免母鼠受惊吓刺激后出现吞食子鼠行为，采血完毕后单独放置1小时后再放回子鼠笼中。
所有血标本均于4℃冰箱放置过夜后，于3000rpm离心10分钟，取上清，置于-80℃冰箱保存以待Elisa检测。
2.2.4 母鼠的受孕
CUS模型建立及血标本采集完毕后，将正常对照组母鼠和CUS组母鼠与健康雄性成年大鼠按3:1合笼饲养1周，合笼后每日上午8:00对母鼠进行阴道分泌物涂片检查并记录图片结果，以显微镜下看到精栓为受孕标志，受孕母鼠单笼饲养至分娩。自每只母鼠妊娠第18天起每天于8:00、12:00、18:00、22:00四个时间点检查是否有母鼠分娩，如有则进行采血及记录日期，以计算子鼠日龄。子代大鼠统一于21日龄时离乳并以饲料喂养至28日龄。
2.2.5 子代大鼠血标本和脑组织标本的取材
子鼠28日龄时，进行断头取脑取血。先以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射，充分麻醉后，进行冰上断头取血、取脑。整个取脑过程在冰冷环境中完成，即操作所用器械均需预冷，手术剪、止血钳、镊子，药勺等都要预先放在碎冰中。手术时，首先用大剪刀直接剪下头部，放在冰盘上，由助手收集躯干部流出的血液于离心管中。操作者快速将枕骨周围的肌肉修剪掉，暴露枕骨大孔，然后从枕骨大孔处小心插入血管钳，撬开枕骨，向上掀开两侧顶骨，用弯镊从脑的两侧分离一下，使大脑充分暴露，然后从前端将脑掀起，用药勺刮断连接的脑神经，从鼠脑下方将其取出，将整脑放在另一个干净的冰盘上分离出双侧海马。左侧海马置于装有4%多聚甲醛的EP管中等待免疫组织化学检测。
2.2.6 亲代及子代血清CRH、COR水平的Elisa检测
采用美国RB公司生产的标准Elisa试剂盒(96T)进行，严格按照说明书操作。（1）20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1:20稀释，及1份的20×洗涤缓冲液
加19份的蒸馏水；
（2）在每组子鼠血清标本中随机抽取14份，与全部母鼠血清标本和试剂盒均在室温解冻，平衡20分钟；
（3）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
（4）待测样本孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul
（5）随后标准品孔和样本孔每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体
100ul，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min；
（6）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸
水纸上拍干，如此重复洗板5次；
（7）每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育15min；
（8）每孔加入终止液50ul，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
（9）绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。本试剂盒标准品线性回归与预期浓度相关系数R≥0.9900。
2.2.7免疫组织化学法检测子鼠海马PKA、p-CREB(ser133)的表达情况
⒈实验步骤
1）取材、固定
大鼠用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，固定后断头取脑，于
温操作台上分离出海马，置于装有4%多聚甲醛的EP管中，放置过夜。
2）脱水和包埋
⑴ 95%乙醇Ⅰ 2-4小时
⑵ 95%乙醇Ⅱ 2小时
⑶无水乙醇Ⅰ 1.5小时
⑷无水乙醇Ⅱ 1小时
⑸二甲苯+无水乙醇(1:1) 20分钟
⑹二甲苯Ⅰ 10分钟
⑺二甲苯Ⅱ 10分钟
⑻浸软蜡(50-52℃) Ⅰ 30分钟
⑼浸软蜡(50-52℃) Ⅱ 1小时
⑽浸硬蜡(58-60℃) Ⅰ 30分钟
⑾浸硬蜡(58-60℃) Ⅱ 30分钟
⑿石蜡包埋:温度60℃
3）切片
切成4um厚，35℃水漂片展开，贴于预处理好的玻片上，60℃烘烤4小时。每个标本连续切片5张。
4）阳性细胞的检测
采用免疫组化两步法，DAB显色，苏木素轻度复染细胞核，用PBS替换一抗作阴性对照。按试剂盒说明书操作。
免疫组化染色步骤：
⑴用Poly-Lydine将清洁载玻片防脱处理；
⑵捞片后置烤箱60℃1小时以使切片紧密黏附。
⑶切片石蜡至脱水：二甲苯5min×3→无水乙醇10min×2→95%乙醇5min×1→90%乙醇5min×1→80%乙醇2min×1→70%乙醇5min×1→自来水洗涤5min。
⑷灭活内源性过氧化物酶：3%H
2O
2
室温避光孵育30min，PBS洗涤5min×3次。
⑸组织抗原修复：0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0）中行微波抗原修复15min， PBS洗涤5min×3次。
⑹每张切片加1滴多克隆抗体PKA（1：300）；4℃过夜。
⑺ PBS冲洗3次，每次5分钟。除去PBS液，每张切片滴加二抗PV9000试剂，
室温孵育15min。PBS冲洗3次，每次5分钟。
⑻除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察掌握染色程度。
⑼自来水冲洗10分钟，苏木素复染。
⑽自来水冲洗5分钟。
⑾梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
同样方法进行P-CREB(ser133)免疫组化检测，一抗浓度为1:100。
2. 图像分析
子代大鼠海马CA1层和CA3层的PKA、P-CREB(ser133)免疫反应阳性细胞通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行处理。在高倍镜（40×10）下，PKA以海马细胞的胞浆/胞膜有棕黄色物质沉积者为阳性细胞，P-CREB(ser133)以海马细胞的细胞核有棕黄色物质沉积者为阳性细胞。每张切片随机选取3个非重叠CA1层高倍视野、3个非重叠CA3层视野和3个非重叠的DG层视野，分别测定其免疫阳性细胞平均灰度值并进行分析。平均灰度值在图像分析中用来表示图像的透光率,分为256级,最黑为0级,最亮为255级,平均灰度值越高,说明其免疫组化染色越浅,棕黄色物质沉积量越低。
2.2.8 统计学处理
所有数据以means±SE 表示，采用spss17.0 统计软件进行分析。统计方法包括，两独立样本均数t-test，配对样本均数t-test和Bivariate相关性分析。检验水平为P＜0.05，以“*”标记，p<0.01以“**”标记。