１８６ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．３
?检测技巧?
ＥＬＩＳＡ测定中影响因素简析
李卫杨
（株洲市第一医院，湖南株洲４１２０００）
ＥＬＩＳＡ方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。但ＥＬＩＳＡ测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ＥＬＩＳＡ测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②操作因素；③试剂因素。本文主要就标本因素和操作因素对ＥＬＩＳＡ测定的影响做如下讨论。
１标本因素
血清是最常用的ＥＬＩＳＡ标本，血浆一般可视为与血清同等的标本。标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性干扰物质和外源性干扰物质两种。
１．１内源性干扰物质
有人认为大约４０％的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体、交叉反应物质和其它物质等。
１．１．１类风湿因子人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ型类风湿因子（ＲＦ）可以与ＥＬＩＳＡ系统中的捕获抗体及酶标记二抗的ＦＣ段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：①用Ｆ（ａｂ）２替代完整的ＩｇＧ；②标本用偶联有热变性（６３℃，１０ｍｉｎ）ＩｇＧ的固相吸附剂处理（将热变性ＩｇＧ加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可用２一巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使ＲＦ降解。
１．１．２补体它能够与固相一抗，标记二抗Ｆｅ结合或影响它们的结合而造成假阳性。解决的办法是：①用ＥＤＴＡ稀释标本；②用５６℃，３０ｍｉｎ加
收稿日期：２００７—１１—１５；修回日期：２００７－１２－２０热血清使Ｃｌｑ灭活［１］。
１．１．３嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ｉｇ（ｓ）结合的天然嗜异性抗体，可将ＥＬＩＳＡ系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ｉｇ（ｓ），但加入量不足或亚类不同时无效。
１．１．４嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ＥＬＩＳＡ方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，测定前需用理化方法将其解离后再测定。
１．１．５医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体临床采用鼠源性ＣＤ３等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体，ＥＬＩＳＡ测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ｉｇ（ｓ），从而克服由于上述原因造成的假阳性。
１．１．６交叉反应物质类地高辛、类ＡＦＰ样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
１．１．７标本中其它成分的影响血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ＥＬＩＳＡ测定结果有干扰作用。
１．２外源性干扰物质
外源性物质常常是由于用于ＥＬＩＳＡ测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响口］。
万方数据
１．２．１标本溶血溶血的原因有许多，主要有体外溶血和体内溶血两种。体外溶血可由物理因素（如机械性破坏、冰冻）、化学因素（如血样接触表面活性剂）和代谢性因素（如遗传病引起的血细胞脆性增加）引起。体内溶血可由物理因素（人工心脏瓣膜或大血管手术后）、生物因素（如恶性疟疾）和药物毒性反应等因素引起。由于各种标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使Ｈ。０。释放出原生态氧［ｏ］，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，在以辣根过氧化物酶为标记的ＥＬＩＳＡ测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
１．２．２标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
１．２．３标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，血清中ＩｇＧ可聚合成多聚体，ＡＦＰ可形成二聚体，在间接法ＥＬＩＳＡ测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，可出现假阴性。为克服上述干扰，ＥＬＩＳＡ测定的血清标本宜为新鲜采集。如不能立即测定，５天内测定的血清标本可存放于４℃，１周后测定的血清标本应低温冻存。冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
１．２．４标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后１／２～２ｈ开始凝固，１８～２４ｈ完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ＥＩ。ＩＳＡ测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。
１．２．５标本管中添加物质的影响抗凝剂（如肝素）、酶抑制剂（如ＮａＮ。可抑制ＥＬＩＳＡ系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对ＥＬＩＳＡ测定有一定干扰作用。综上所述，对
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临床检验ＥＬＩＳＡ测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
２操作因素
２．１温育的影响
温育是影响ＥＩ。ＩＳＡ测定结果的关键因素。温育时间不够，弱阳性标本检测不出；温育温度不够，弱阳性标本也难以检出。
２．２洗板的影响
洗板对ＥＬＩＳＡ测定来说也是关键步骤。洗板分手工洗板和机器洗板，一般认为机器洗板较手工洗板效果要好，关键是洗板次数的选择。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果；洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果。
２．３显色的影响
影响显色的关键是显色温度和显色时间，有些实验室操作人员不严格按说明书操作，因为担心“花板”，往往是显色时间不到就匆忙终止显色，结果造成弱阳性标本不能显色而导致假阴性发生。
２．４加样的影响
加入样品、试剂及混匀时间的差异称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，尤为手工操作更著，对结果都会产生或大或小的影响。ＥＬＩＳＡ常用项目，例如：乙肝两对半，多是成批检测。从加第一个样本到最后一个样本，包括中间换吸管尖的工作，在这一过程中有一个时间差，加试剂及混匀也同样存在时间差，这种操作时间差会致使抗原抗体反应和酶促反应时间的不一致，而这种不一致可以直接导致误差的产生，尤其是在夏天，若不合理安排时间、尽量减少时差，将会导致假阳性或假阴性的结果出现。
ＥＩ。ＩＳＡ检测法影响因素众多，上述只是一些常见因素分析。要想提高ＥＬＩＳＡ检测的检测质量，关键还要加强实验室科学管理，强化标准化流程操作，加强质量控制，提高人员素质，以减少检测假阳性、假阴性结果的发生。
参考文献：
［１３曹文飞．酶联免疫测定的干扰因素与对策［Ｊ］．中国实验临床免疫学杂志，１９９８，１０（３）：６０—６３．
［２］许斌．ＥＳＬＩＡ检测ＨＢｓＡｇ影响因素的探讨［Ｊ］．临床检验杂志，２０００，１８（４）：２３２．
（张增武编辑）
万方数据
ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析？ 1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别 1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。 b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。 c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。 d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。 1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小 b.一般只含有一个抗原决定簇 c.纯度高 d.稳定性差 由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。 由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。2．假阳性本底产生的原因 2. 1 抗原因素 2.1. 1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。 2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。 2.2. 3 抗原纯度对特异性的影响。以HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV 抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。 2.2 人血清中的正常IgG
影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效 的测定
定量分析实验三影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰 检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定 【目的要求】 1.了解氢气流量、空气流量、载气流量等操作条件对氢焰检测器敏感度的影响。 2.学会测氢焰检测器的敏感度。 【基本原理】 【实验条件】 1.气相色谱仪 2.色谱柱 SE-30 5%不锈钢柱，长2m，内径3mm 3.载气 N2，流量：50mL/min 4.检测器 FID 5.柱温 70℃ 6.进样口（汽化室）、检测器温度 150℃ 7.样品：正庚烷、苯、正戊醇，甲醇为溶剂 【操作步骤】 1．开机 ①开电源，开载气，调氮气流量到50mL/min，调柱温到70℃，调进样口、检测器温度到150℃。 ②按“升温”按钮开始升温。 ③调空气流量到500mL/min，氢气流量到75mL/min以上，按“点火”按钮，如果点火成功，会听到一声清脆的爆鸣声，并会看到点火成功的提示（氢气的点火流量应大于最佳工作流量，否则火点不燃，如果空气流量太小，则火也点不燃，则听不到爆鸣声，需重新点火）。 ④当柱温及进样口温度达到设定温度后，“Ready”显示亮。待基线基本稳定后，请按“调零”按钮，将当前的基线电压调到零点。 2．氢气氮气流量比对灵敏度的影响
这里氮气流量固定到到50mL/min，改变氢气流量就改变了氢氮流 量比。 ①选择样品为正庚烷,浓度为10mg/L,进样量为1mL, 范围为1(101), 记录灵敏度为8mv/满刻度。 ②将氢气流量分别调到15、30、40、50、60、70 mL/min（氢气流 量不能太小，太小了会熄火），分别进样，进样的同时按“开始记录”按 钮，记录色谱图，色谱峰流出完后，按“停止记录”按钮，计算机会在屏 幕上打印出组分的保留时间和峰面积，注意氢气流量的改变对氢焰检 测器的灵敏度的影响，将结果输进下表。 氢气流量(ml/min) 15 30 40 50 60 70 氮氢流量比 10:3 5:3 5:4 1:1 5:6 5:7 峰面积（μvs） 15411 23947 27954 28514 25779 26015 根据刚才的实验数据，灵敏度最高时的氢气流量为: 3．空气流量对灵敏度的影响 将氢气流量调到刚才摸索出的最佳氢气流量，空气流量调到40、 80、160、320、400，500mL/min（空气流量不能太小，太小了会熄 火）分别进样，记录色谱图，观察氢气流量的改变对氢焰检测器的灵 敏度的影响，将结果输进实验报告（空气流量改变引起峰面积的较明 显改变才能说峰面积的改变是空气流量的改变引起的，如果峰面积改 变不明显，这种改变可能是随机的，本仿真机也仿真了随机结果，这 样才符合实际）。 空气流量(mL/min） 40 80 160 320 400 500 600 空气氢气流量比 4:5 8:5 16:5 32:5 8:1 10:1 12:1 峰面积（μvs） 5142 10465 18597 26167 27061 28705 27931
影响细胞ELISA 结果的主要因素 The major factors influencing the result of cell ELISA 李蓉芬, 陈 敏, 康运生, 钟小林, 何凤田 (第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,重庆400038) 细胞ELISA(酶联免疫吸附试验) 是用细胞代替可溶性抗原包被于96 孔酶联板(或细胞培养板) 进行免疫学检测的一种有效方法,该方法特别适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况[1～3] 。我们在实际操作过程中体会到细胞ELISA 的结果理想与否与多种因素有关, 概括起来包括以下几方面。 1 细胞状态 应使用对数生长期的细胞。此期细胞的活力最好,抗原表达水平最高。对贴壁细胞来讲,此期细胞贴壁最牢。 2 细胞固定 2.1 悬浮生长细胞的固定 将细胞用PBS 洗涤后,重悬于PBS 计数。按(4～5) ×105/ 孔加于96 孔酶标板中,1 200 r/ min 离心12～15 min, 弃上清,充分干燥后,每孔加入50μl PBS 配制的0.25 % 戊二醛作用10～12 min, 弃固定液,PBS 洗3 次。此处应注意的问题有: ①细胞洗涤:目的是去除培养基中的血清,利于后续固定。②最初每孔悬浮细胞用的液体量:至少应在200μl/ 孔左右,否则会因液体量少而在后续离心中使细胞不均匀分布,进而影响酶联检测结果。③离心:速度不能过高(为1 200～1 800 r/ min) ,离心时间不能过长(为10～18 min) ,否则可能破坏细胞。④镜检:离心后的细胞置显微镜下观察,对细胞分布明显不均的孔进行标记, 在后续实验中弃用。⑤固定前细胞应充分干燥:否则残液可使细胞固定不牢。⑥固定液的选择:通过比较,在相同时间内(室温) ,0. 25 % 的戊二醛较4% 的多聚甲醛的固定效果好。 2.2 贴壁细胞的固定 将细胞接种于96 孔新细胞培养板中,培养36 h 左右,使细胞达80 %～90 % 满孔密度,弃培养基,温PBS 洗2 次,充分干燥后,同上固定8 min ,PBS 洗3 次。此处应注意的问题有: ①细胞接种前应计数: 旨在尽量使每孔中的细胞数一致。②细胞洗涤:应用温PBS 洗涤,否则会因骤冷而使细胞脱落。这一点在冬天操作时尤为重要。③其它注意事项:同悬浮细胞固定中应注意的问题“④～⑥”。 3 封闭液的选择 我们使用PBS 配制的10 % 小牛血清、2% 牛血清白蛋白、5% 绵羊血清、5% 市售脱脂奶粉等几种不同试剂进行封闭,结果以5% 脱脂奶粉的封闭效果最好。 4 细胞内源性过氧化物酶的检测和去除 对固定过的细胞,直接加入邻苯二胺(OPD) 底物显色,观察内源性过氧化物酶的情况。对内源性过氧化物酶水平很低的细胞无需进行内源性过氧化物酶的处理,而对内源性过氧化物酶水平较高的细胞则需用甲醇配制的0.3 % 双氧水于室温下作用30 min 予以去除。 5 反应后洗涤 为了避免细胞非特异性吸附抗体,每步反应后应进行充分洗涤。洗涤次数和时间均应较常规ELISA (常规ELISA 指包被物为可溶性物质) 增加。①洗涤次数和时间:每步反应后至少应洗5 次,每次洗涤时间不少于5 min 。②振荡洗涤:在洗涤过程中,使酶联板处于温和振荡状态,以保证洗
ELISA的基本原理[1] ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部分包括：（1）包被的抗原或抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或试管；（2）酶标记的抗体或抗原和（3）酶的反应底物等。抗原或抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标准，显色或产生荧光或发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。 二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3] 通常所提到的抗原与抗体的相互作用，一般指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。 （一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长 通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的区域内。也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。 （二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定 此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分，这部分体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100?。液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要经过扩散或质量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。可参与结合反应的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积，无法精确计算这种反应体积，从而难以使用通常的质量作用定律图形来计算Keq。因此，固相上抗原与抗体反应的Keq值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性。 （三）固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低
液相色谱柱柱效的提高和测算 液相色谱柱柱效的提高和测算 摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。 关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数 一、提高液相色谱柱柱效的方法 我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。 (1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。 (2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。 (3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。 (4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。 (5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。 (6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。 从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。 二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题 我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。 不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。 三、几种测量和计算柱效值的方法 因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式习惯上定义为: 式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n的方法所对应的常数a值之间的关系。
问题 可能原因 解决方法 1、无颜色 试剂孵育的时间没有按说明书操作。 确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。 2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。 重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 3、漏加酶 检查操作流程，注意不要漏加 5、HRP酶污染了叠氮钠 使用新配制的试剂，禁含叠氮钠 标准品有问题(若在标本孔中有信号) 按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品 某一容器未洗净,残留灭活酶物质 尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠 使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体 重新确认所选用的试剂 .漏加显色剂A或B 加显色剂后观察一下液面高度 试剂配制/使用有误 将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。 缓冲液污染 配制新新鲜的缓冲液 显色弱 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。 检查产品的有效期 加入试剂的体积和时间有误 确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。 试剂、样品用前未能平衡 用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右
缩短孵育时间能使实验的信号变弱。 检查孵育的时间。 在温度变化的环境内孵育酶标板。 确定孵育的温度，应避免温度的变化。 使用了被污染的试剂 检查试剂是否被污染。 标准品/标本制备方法不规范 检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应 显色底物制备不规范 检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。 检测时间不当 是否在规定的时间内检测。 仪器设定不正确，滤光片不匹配。 仪器是否设定正确，滤光片的使用等。 高背景(本底) 洗涤操作不规范 洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。 实验中孵育温度和时间不适当 确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当 酶加量过多 加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定。 封闭不完全 检查封闭液的计算量；提高封闭时间。 标本或标准品中的干扰物质 做适当的对照 显色剂受光照时间较长,或污染
一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30 ~60 min，各试剂在使用前充分混匀。②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。 二、操作不当导致 1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异； 2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上； 3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会 对结果造成较大影响。 4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强； 5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数； 6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴； 7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。 8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空 白值或背景值升高。 三、检测样品处理不当引起溶血或污染 1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性 的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色； 2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应； 3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性； 4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果 在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳 性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采 用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。 5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固
高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察 一、实验目的 1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理 2．学习高效液相色谱仪的使用 3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法 4．考察流动相配比对分离情况的影响 二、基本原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即： 2 22/11654.5??? ??=???? ??=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间 Y 1/2为色谱峰的半峰宽度 Y 为色谱峰的峰底宽度 影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。 三、仪器和试剂 1．仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器） 2．50μL 微量进样器 3．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。 配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。 四、实验条件 1．色谱柱 长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相 2．流动相 组成1：甲醇:水（95:5）；组成2：甲醇:水（85:15）；流量均为0.8ml/min 3．紫外光度检测器 波长254nm 4．进样量 5μL 五、实验步骤 1．设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。 2．吸取5μL 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。 3．改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。 4．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。 六、数据记录及处理 1．记录实验条件。 （1）色谱柱与固定相 （2）流动相及其流量、柱前压 （3）检测器波长 （4）进样量 2．分别记录三个组分色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。 3．分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n ，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。 七、思考题 1．由本实验计算出的各组分理论塔板数说明什么问题？ 2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？ 3. 试分析流动相条件改变后保留时间及分离度的差异，并阐明原因。
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称.近二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后, 使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比.继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后,1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法,建立了 用酶来标记抗原或抗体的分析技术.它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术,是一种用酶标记抗原或抗体的方法.由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数 分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的 抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来. ELISA试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法.将抗原,抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原.此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,由于其试剂稳定,易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域. ELISA基本原理 ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原,抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术. ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,基本原理有三条: （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按 底物显色的程度显示试验结果. 由于抗原,抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一 种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性. 在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定 093858 张亚辉 一. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2) 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：20μl定量环，实际注射每次可控制在40μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
间接法ELISA SOP 一、包被 1．抗原包被量为20μg/板。 2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。 3．取25μl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100μl/孔。 4．包被完毕后，4℃过夜。 二、封闭 1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。 2．加封闭液，200μl/孔。 3．37℃孵育2h。 4．甩干，洗板（3次）。 5．用干燥的自封袋4℃保存。 【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200μl -300μl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。 三、一抗 1．可洗板一次。 2．阳性对照：1μl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。 3．阴性对照：做1：2万稀释。 用1μl阴性血清加入100μl抗原稀释液中，先做1：100稀释。再从此液 取出5μl加入995μl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。 4．空白对照：只加抗原稀释液。 5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100μl抗原稀释液。 6．第一孔加100μl（1：1000）的阳性对照。 7．第二孔加100μl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100μl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。 1：1000 1：2000 1：4000 1：8000 1：16000 1：32000 阴性对照（1：2万） 空白对照 8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。 【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。 ②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。 ③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。
色谱法习题 一、选择题 1.在色谱分析中, 用于定性分析的参数是 ( ) A.保留值 B.峰面积 C.分离度 D.半峰宽 2.在色谱分析中, 用于定量分析的参数是 ( ) A.保留时间 B.保留体积 C.半峰宽 D.峰面积 3. 良好的气-液色谱固定液为 ( ) A.蒸气压低、稳定性好 B.化学性质稳定 C.溶解度大, 对相邻两组分有一定的分离能力 D. (1)、(2)和(3) 4. 在气-液色谱分析中, 良好的载体为 ( ) A.粒度适宜、均匀, 表面积大 (2)表面没有吸附中心和催化中心 C.化学惰性、热稳定性好, 有一定的机械强度 D. (1)、(2)和(3) 5. 试指出下列说法中, 哪一个不正确? 气相色谱法常用的载气是 ( ) A.氢气 B.氮气 C.氧气 D.氦气 6.在液相色谱中，范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略（） A.涡流扩散项 B.分子扩散项 C.流动区域的流动相传质阻力 D.停滞区域的流动相传质阻力 7. 使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好？ ( ) A.H2 B.He C. Ar D.N2 8.热导池检测器是一种 ( ) A.浓度型检测器 B.质量型检测器 C.只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器 D.只对含硫、磷化合物有响应的检测器 9. 使用氢火焰离子化检测器, 选用下列哪种气体作载气最合适？ ( ) A.H2 B.He C.Ar D.N2 10.含氯农药的检测使用哪种色谱检测器为最佳？( ) A. 火焰离子化检测器 B. 热导检测器 C. 电子捕获检测器 D. 火焰光度检测器 11. 某色谱柱长1m时，其分离度为1.0，问要实现完全分离（R=1.5），色谱柱至少应为多长： A. 1.5m B. 2.25m C. 3m D. 4.5m 12. 气相色谱检测器中，通用型检测器是： A. 热导池检测器 B. 氢火焰离子化检测器 C. 火焰光度检测器 D. 差示折光检测器 13. 使用热导池检测器时,下列操作哪种是正确的： Ａ.先开载气,后开桥电流, 先关载气,后关桥电流 B. 先开桥电流,后开载气, 先关载气,后关桥电流 C. 先开载气,后开桥电流, 先关桥电流,后关载气 D. 先开桥电流,后开载气, 先关桥电流,后关载气 14. 下列哪种方法不适用于分析试样中铅、镉等金属离子的含量 A. 气相色谱法 B. 原子吸收分光光度法 C. 可见分光光度法 D. 伏安法
１８６ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．３ ?检测技巧? ＥＬＩＳＡ测定中影响因素简析 李卫杨 （株洲市第一医院，湖南株洲４１２０００） ＥＬＩＳＡ方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。但ＥＬＩＳＡ测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ＥＬＩＳＡ测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②操作因素；③试剂因素。本文主要就标本因素和操作因素对ＥＬＩＳＡ测定的影响做如下讨论。 １标本因素 血清是最常用的ＥＬＩＳＡ标本，血浆一般可视为与血清同等的标本。标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性干扰物质和外源性干扰物质两种。 １．１内源性干扰物质 有人认为大约４０％的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体、交叉反应物质和其它物质等。 １．１．１类风湿因子人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ型类风湿因子（ＲＦ）可以与ＥＬＩＳＡ系统中的捕获抗体及酶标记二抗的ＦＣ段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：①用Ｆ（ａｂ）２替代完整的ＩｇＧ；②标本用偶联有热变性（６３℃，１０ｍｉｎ）ＩｇＧ的固相吸附剂处理（将热变性ＩｇＧ加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可用２一巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使ＲＦ降解。 １．１．２补体它能够与固相一抗，标记二抗Ｆｅ结合或影响它们的结合而造成假阳性。解决的办法是：①用ＥＤＴＡ稀释标本；②用５６℃，３０ｍｉｎ加 收稿日期：２００７—１１—１５；修回日期：２００７－１２－２０热血清使Ｃｌｑ灭活［１］。 １．１．３嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ｉｇ（ｓ）结合的天然嗜异性抗体，可将ＥＬＩＳＡ系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ｉｇ（ｓ），但加入量不足或亚类不同时无效。 １．１．４嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ＥＬＩＳＡ方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，测定前需用理化方法将其解离后再测定。 １．１．５医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体临床采用鼠源性ＣＤ３等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体，ＥＬＩＳＡ测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ｉｇ（ｓ），从而克服由于上述原因造成的假阳性。 １．１．６交叉反应物质类地高辛、类ＡＦＰ样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。 １．１．７标本中其它成分的影响血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ＥＬＩＳＡ测定结果有干扰作用。 １．２外源性干扰物质 外源性物质常常是由于用于ＥＬＩＳＡ测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响口］。 万方数据
ELISA方法大全 ELISA试剂盒种类繁多，根据原理可大致分为间接法、夹心法、竞争法、捕获包被法（也称为反向间接法，比较少见）。其中各类型试剂盒的基本原理可以参考：【蛋白研究系列专题】-12丨ELISA方法知多少？（链接地址为： https://www.doczj.com/doc/9088382.html,/s/PfZRQxBEP6cWt6FJyE7KXQ）以下为各类型ELISA试剂盒的抗原抗体连接顺序及适用类型： 注： ▌：吸附介质；/：竞争关系；-：结合 Ag：抗原（antigen）；sAg：固相抗原；lAg：游离抗原（即待测抗原）；Ag*：酶标抗原 Ab：抗体（antibody）；sAb：固相抗体；lAb：游离抗体（即待测抗体）；Ab*：酶标抗体（或酶标二抗） lIgM：游离IgM 被测物以红色表示 上面的方法涉及到的是比较简单的方式，在实际运用中则会进行一些改良，下面举几个栗子！直接法：直接用酶标抗体结合抗原，或者直接用酶标抗原结合抗体。间接法：间接用酶标二抗结合特异性识别抗原的抗体。下面的栗子帮助大家理解。 栗子1 表中列出的两种夹心法属于直接夹心法，间接夹心ELISA则是基于两种不同种属来源的抗体，与直接法相比具有更高的灵敏度，常用来检测低丰度抗原样本。间接夹心ELISA的抗原抗体连接顺序为：▌-sAb1(species 1)-lAg-Ab2(species 2)-Ab*，当然也不一定非要不同物种的抗体，使用同一物种的抗体也可以是这样的连接顺序：▌-sAb Fab-lAg-lAb(same species)-anti Fc Ab*。 栗子2 竞争ELISA方法灵活性强，在实际应用中衍生出了许多不同的检测方式，除了表中列出的直接竞争法，还有间接竞争法、夹心竞争法等，这些方法是将间接法和夹心法进行重新组合得到的更为复杂的检测方法。 间接竞争法的抗原抗体连接顺序为：▌-sAg/lAg-Ab-Ab*，或者▌-sAg-Ab/lAb-Ab*酶标二抗。这种方法比直接法进一步放大信号，故灵敏度更高。 夹心竞争法从原理上分可以有四种，实际中运用的多是：▌-sAb-Ag/lAg-Ab*，例如ICTP 检测试剂盒就是用这种方法开发的。 栗子3