基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金项目(No.CARS-20-4-4)和国家自然科学基金项目(No.30871575)收稿日期：2013-05-14接受日期：2013-08-26
Online system:https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014,22(1):1~9
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2014.01.001
甘蔗SPS Ⅲ基因组DNA 及5'侧翼序列的克隆与分析
周平1*
何炜4*金光1高玉娜2，
3
叶冰莹2，3陈由强2，
3**
陈如凯3
1福建省农业科学院果树研究所，福州350013；2福建师范大学生命科学学院，福州350108；3农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福州350108；4福建省农业科学院水稻研究所/农业部闽台农作物种质资源利用重点开放实验室，福州350003*同等贡献作者
**通讯作者，yqchen@https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,
摘要甘蔗是我国南方地区重要的糖料作物。为达到增糖的育种目标，对甘蔗蔗糖积累主要限速步骤的研究是必不可少的。蔗糖磷酸合成酶(SPS)作为蔗糖合成途径的关键限速酶，对甘蔗中蔗糖合成和碳水化合物分配有着重要的影响。本研究采用长距离PCR 法(LD-PCR)克隆到两条不同长度的甘蔗(Saccharum spp.cv.FN95-1702)SPS Ⅲ基因组DNA 片段。序列分析表明，所得的片段基因结构相同，均含有13个外显子和12个内含子，其开放读码框(ORF)编码964个氨基酸，序列提交GenBank ，获得查询登陆
号EU278617、EU278618。以此为基础，继续从甘蔗基因组中扩增出先前未知的SPS Ⅲ基因5'侧翼序列，申请GenBank 登陆号KC422670。转录因子结合位点生物信息学分析表明，该序列含有顺式DNA 作用元件和启动子TATA 启动盒。为进一步验证5'侧翼序列的启动子活性，分别截取5段不同长度的SPS Ⅲ基因5'侧翼序列与报告基因GUS 融合，构建嵌合基因表达载体质粒，基因枪微弹轰击甘蔗愈伤组织观测瞬时表达，证实了所克隆到的5'侧翼序列具有启动子活性，是甘蔗SPS Ⅲ基因的启动子，且具有一定的表达特性。本研究通过克隆分析SPS Ⅲ基因以其启动子，为研究基因结构和生物学功能提供了基础资料。关键词甘蔗，蔗糖磷酸合成酶，基因组DNA 序列，5'侧翼序列，GUS 瞬时表达
Cloning and Sequence Analysis of Sucrose Phosphate Synthase Genomic DNA and 5'-Flanking Sequence from Sugarcane (Saccharum spp.)
ZHOUPing 1*HE W ei 4*
JINGuang 1GAOY u-Na 2,3YE Bing-Ying 2,3CHENY ou-Qiang 2,3**CHENRu-Kai 3
1Fruit Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350013,China;2College of Life Sciences,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China;3Key Laboratory of Fujian Sugarcane Biology and Genetic Breeding,Ministry of Agriculture,Fuzhou 350108,China;4Rice Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Germplasm Utilization,Ministry of Agriculture,Fuzhou 350003,China *The authors who contribute equally **Corresponding author,yqchen@https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,
Abstract Sugarcane (Saccharum spp.)is a commercial important sugar crop in South China.In order to
achieve the breeding aim of increasing sugar yield,it is essential to focus on the principal rate limiting steps in sugarcane sucrose accumulation processes.Sucrose phosphate synthase (SPS)is considered a key rate-limiting enzyme in the pathway of sucrose synthetization and carbon partitioning processes.In this study,two different genomic DNA framents(GenBank accession No.EU278617and EU278618)which encoding Sugarcane SPS Ⅲprotein were cloned by long distance PCR(LD-PCR).DNA Exon-intron structure analysis suggested that both sequences contained twelve introns,thirteen exons,and the open
reading frame encoded
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0引言
蔗糖磷酸合成酶(SPS)在植物体中催化胞质蔗糖合成的最后一步反应，是蔗糖合成途径的关键限速酶，能影响光合中间产物向蔗糖和淀粉途径的分配、调控库蔗糖的积累、参与纤维细胞壁合成与胁迫应答等(周平等,2006)。研究表明，SPS是蔗茎蔗糖合成与积累的主要动力之一(Gutierrez-Miceli et al.,2005;Grof et al.,2007;Batta et al.,2011)，成熟茎节中SPS的基因转录和酶活性明显高于未成熟茎节(Verma et al.,2011)。
SPS家族基因包含四小家族共五种类型，在甘蔗中全部存在，但其表达模式各不相同(Castleden et al.,2004)。近年来多次定量检测成熟期蔗叶和蔗茎中的SPS转录表达，发现在蔗茎中SPSⅢ表达量占茎SPS转录总量的三成，茎中SPSⅢ一定程度上推动了库器官中蔗糖积累(Grof et al.,2006;宋喜梅等,2010;叶冰莹等,2011;杨翠芳等,2012)。SPSⅢ属于禾本科作物独有的SPS D家族。该家族蛋白结构特殊，只存光调控磷酸化修饰位点，不含其他家族SPS还具有的14-3-3蛋白结合位点和渗透胁迫激活位点。据此推测，SPSⅢ不受14-3-3蛋白结合和渗透胁迫激活途径的磷酸化修饰影响，从而避免特定代谢进程中反馈抑制调节(Castleden et al.,2004)，有可能是高表达量且不受代谢反馈抑制的SPSⅢ，保证了蔗茎中高水平的蔗糖合成与积累。另有研究者分别从不同糖含量的甘蔗中特异性扩增约400nt SPSⅢ片段，分析SNP 分布，通过亲代与其杂交子代的SNP分析和单倍型作图定位证实，SPSⅢ靠近增产蔗糖的数量性状基因座(McIntyre et al.,2006)，更表明SPSⅢ的重要性。因此在前期对SPSⅢ相关工作的基础上拟通过克隆SPSⅢ及5'侧翼序列，分析基因结构并确定启动子活性，为今后研究该基因启动子与特异性转录因子的相互作用机制，确认蔗茎中SPSⅢ的高转录表达是否是成熟期库糖积累的需要提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
甘蔗品种为福农95-1702(Saccharum spp.cv. FN95-1702)，由福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供。引物、PCR聚合酶、限制性内切酶、DNA接头等购自宝生物工程有限公司；其他生化试剂为分析纯。
1.2实验方法
1.2.1甘蔗SPSⅢDNA序列的克隆
以Castleden等(2004)报道的甘蔗SPSⅢ系列EST为种子序列，重新比对检索EST数据库，筛选同源度90%以上的EST片段，CAP3软件聚类拼装，达到有效的电子延伸。再以所得的最长拼装序列为参考，甘蔗基因组DNA为模板，设计引物扩增SPSⅢDNA序列。其中正反向引物：
F：5'-CAACT CTCCCATTCCGTCCCCCGAT-3'；
R：5'-CTCCTTTCCTTTCGTTTTCCCGTTGGCT-3'。
使用10μL反应体系进行长距离PCR(LD-PCR)扩增，各反应物配比参照LA Taq DNA聚合酶(Takara)说明书。两步法反应：94℃预变性后，94℃30s，68℃6min，循环25轮。反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的条带，连接pGM-T载体，
a protein of964amino acids.Subsequently,the5'-flanking sequence(GenBank accession No.KC422670)of SPSⅢwas aslo isolated from sugarcane genome DNA using Adaptor-ligation PCR method.This novel sequence contained the important DNA putative cis-acting elements as well as TA TA box.To identify promoter activtity of SPSⅢ,we generated five different vectors which contained different length of the5'-flanking fragment fused to the theβ-glucuronidase(GUS)reporter gene.Transient expression experimen was carried out by the method of particle bombardment.Histochemical activity of b-glucuronidase was observed in callus.The gene expression results confirmed its promoter activtity.This stuty will provide theory basis for further study on the gene structure and biological function of SPSⅢvia gene clone and promoter analysis.
Keywords Sugarcane,Sucrose phosphate synthase,Genomic DNA framents,5'-flanking sequence, Transient GUS expression
2
甘蔗SPS Ⅲ基因组DNA 及5'侧翼序列的克隆与分析
Cloning and Sequence Analysis of Sucrose Phosphate Synthase Genomic DNA and 5'-Flanking Sequence from Sugarcane
转化大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α感受态细胞。篮白斑筛选阳性菌落，PCR 检测，鉴定后的阳性克隆委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.2.2
甘蔗SPS Ⅲ5'侧翼序列的克隆
1.2.2.1接头连接DNA 库的建立
取适量Xba Ⅰ酶切消化基因组DNA ；乙醇沉淀法回收核酸，再在T 4DNA 连接酶的作用下与具相应Xba Ⅰ粘性末端的DNA 接头(Xba ⅠCassette,Takara 委托合成)连接过夜，建立Xba Ⅰ接头连接DNA 库。
1.2.2.2接头连接PCR 扩增
使用SPS Ⅲ特异引物S1和外侧接头引物C1对所得的接头连接DNA 库进行第一轮PCR 扩增(1st PCR)；再以1st PCR 扩增产物为模板，梯度稀释PCR 反应液，使用SPS Ⅲ特异引物S2与内侧接头引物C2进行第二轮PCR 巢式扩增(2nd PCR)，获得目的条带(图1)。反应所使用的特异引物S1、S2系根据步骤3.2.1中测序的SPS ⅢDNA 序列信息设计。其中外侧接头引物C1：
5'-GTACA TATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA ；
内侧接头引物C2：
5'-CGTTAGAACGCGTAA TACGACTCACTA TAG GGAGA ；
SPS Ⅲ特异引物S1：5'-GAAAAACTTAGGAAAGACTGGCAAACTACAACG ；SPS Ⅲ特异引物S2：5'-TGCAAGGTTCCAGATCCTCCACGTC AT 。
1.2.3缺失表达分析甘蔗SPS Ⅲ5'侧翼序列检测
启动子活性
1.2.3.1缺失表达载体的构建
Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切消化pCAMBIA 1391z 载体，将不同长度的SPS Ⅲ5'侧翼序列连同基因的第一个外显子片段(分别命名为D6-SP1~D6-SP5)定向插入到报告基因GUS(β-葡萄糖苷酶，β-glucuronidase)上游，形成嵌合基因，完成5个表达结构为5'Flanking Sequence-SPS ⅢExon-GUS -Nos polyA 的缺失表达载体的构建(图2)，D6-SP1~D6-SP5片段位置参见图6。所插入的SPS Ⅲ外显子长度经设计，保证了插入后的GUS ORF 编码框不偏移，融合形成SPS ⅢExon-GUS 新报告基因。新表达的SPS ⅢExon-GUS 蛋白质构象改变不大，仍可保持GUS 检测活性。
根据PLACE 和PLANCARE 程序预测出的SPS Ⅲ基因5'侧翼序列DNA 顺式作用元件的分布，设计正向引物用于扩增不同长度5'侧翼序列的扩增：
SP1：5'-CCCAAGCTTCA T ACCACA T A T AAAGCCAAAACA T -3'；SP2：5'-CCCAAGCTTTACAACGGCTCGTA TTTGCTG G-3'；SP3：5'-GCGAAGCTTGTGTGCTCTCTT AGA T ACGTTGTCA T -3'；SP4：5'-CCCAAGCTTACGAAGTCCCTCA TGA TTACGC-3'；SP5：5'-CCGAAGCTTCCTTGTTGTCTACTCACCCCA T-3'；(下划线内为Hin d Ⅲ酶切位点)。
反向引物：
5'
GGAAGATCTACCATGGCGCGTAGCCATGTCTTGT-3'
图1接头连接PCR 扩增Figure 1
PCR amplification of adaptor ligated
DNA
图25'侧翼序列缺失表达载体的构建
Figure 2
Binary expression vectors with the deletion 5'flanking sequence
3
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(下划线内为Bgl Ⅱ酶切位点)。
1.2.3.2阴性对照实验表达载体的构建
将不带5'侧翼序列的SPS Ⅲ外显子片段定向插
入pCAMBIA 1391z 载体Hin d Ⅲ/Bgl Ⅱ位点间，
完成表达结构为Promoterless-SPS ⅢExon-GUS -Nos polyA 的阴性对照实验表达载体的构建。由于SPS ⅢExon-GUS 前未引入相关启动子，不能驱动报告基因表达，设计为阴性对照D6-SP-Neg(图3)。其中SPS Ⅲ外显子片段扩增正向引物：
5'-CCCAAGCTTATGGCGGGAAA CGACA ACT-3'(下划线内为Hin d Ⅲ酶切位点)；
反向引物同前。
1.2.3.3瞬时表达分析启动子活性
将甘蔗胚性愈伤组织接入含有2mg/L 2,4-D 、0.2mol/L 山梨醇和0.2mol/L 甘露醇的MS 培养基，预处理脱水8h 。再重新提取纯化重组质粒D6-SP-Neg 和D6-SP1、D6-SP2、D6-SP3、D6-SP4、D6-SP5，乙醇沉淀法浓缩至1μg/μL 。按照基因枪PDS-1000/He 说明书进行钨粉微弹制备与涂膜，其真空度设为8.804×104Pa ，发射盘与可裂膜距离6.35mm ，可裂膜压力7.584×106Pa ，轰击距离6cm ，每皿各轰击一次。以接受基因枪轰击的愈伤组织为实验组，未受微弹轰击的愈伤组织为空白对照，同时放回预处理MS 培养基25℃暗处理，12h 后接入继代MS 培养基继续暗培养，72h 恢复培养后取出，分别切取粒状愈伤组织浸入37℃GUS 染色液着色反应。体视镜下观察并记录愈伤小粒的染色情况。
2
结果与分析
2.1
甘蔗SPS ⅢDNA 序列的克隆
两步法长距离PCR 扩增获得甘蔗SPS ⅢDNA 片段SPS ⅢG1和SPS ⅢG2，长度分别为6493和7382bp(图4)。纯化目的条带连接T 载体，筛选克隆测序，结果表明所克隆片段确为甘蔗SPS ⅢDNA 片段，其基因结构均含有13个外显子和12个
内含子，编码序列高度同源，编码蛋白同源性为99.9%。两者长度的差异只是由于第12个内含子长度的不同造成的。GenBank 登录号EU278617、EU278618，为数据库中首次提交的甘蔗SPS Ⅲ基因序列。2.2
接头连接PCR 扩增甘蔗SPS Ⅲ5'侧翼序列
采用接头连接PCR 法克隆先前未知的SPS Ⅲ5'侧翼序列。该实验方法需要梯度稀释1st PCR 反应液为2nd PCR 反应提供扩增模版。实验结果表明以100倍稀释效果最好，可以明显扩增到1845bp 的单一条带(图5)。纯化目的条带连接T 载体，筛选克隆测序，结果表明，所扩增DNA 片段3'端与前述克隆的甘蔗SPS Ⅲ基因DNA 片段SPS ⅢG1和SPS ⅢG25'端吻合。采用接头连接PCR 法顺利地分离到了甘蔗SPS Ⅲ基因5'侧翼序列。序列提交GenBank ，查询登录号KC422670，为公共数据库中首次提交的甘蔗SPS Ⅲ基因5'侧翼序列。
图6所示为PlantCARE 和PLACE 植物转录因子数据库在线分析SPS Ⅲ5'侧翼序列结果：预测在基础启动子区上存在能与真核细胞基本转录因子TF ⅡD 结合起始转录的TATA-box 及植物启动子上常见的激活转录的CAAT-box 、G-box 增强元件。同时还预测到其他顺式作用元件，如与光响应相关的ACE 、ATCT-motif 、AE-box 元件，表明甘蔗SPS Ⅲ的转录一定程度上受光合调控。此外还存在与组织发育相关的as-2-box 、GCN4-motif 、CAT-box 近似序列。as-2-box 等芽组织特异性元件和GCN4-motif 、CAT-box 等分生组织特异性元件的存在解释了SPS Ⅲ在甘蔗分生组织和幼芽中的转录表达。2.3
缺失表达分析
为研究5'侧翼序列的启动子活性，设计将长度
不同的5'侧翼序列连同SPS Ⅲ外显子片段经Hin d Ⅲ和Bgl Ⅱ双酶切操作定向插入到pCAMBIA
图3阴性对照实验表达载体的构建Figure 3
Binary expression vectors for negative control
experiment
4
1391z载体GUS报告基因的上游，构建实验所需的缺失表达载体。其中D6-SP1所融合5'侧翼序列连同SPSⅢ外显子片段位置为：-1439~+189，D6-SP2融合位置为：-932~+189，D6-SP3融合位置为：-724~+189，D6-SP4融合位置为：-476~+189，D6-SP5融合位置为：-216~+189，D6-SP-Neg位置为：
0~+189。具体位置信息详见图2、3、6。Hin dⅢ/Bgl Ⅱ双酶切重组质粒，鉴定各片段按设计插入，如图7所示。
微弹轰击愈伤组织GUS染色实验结果如图8所示。其中A-E为接受微弹轰击的甘蔗愈伤组织实验组，F为阴性对照，G为未受轰击的空白对照组。经100倍的体视显微镜放大观察，视野中明显可见D6-SP1、D6-SP2、D6-SP3轰击组织上存在蓝色斑点，染色程度各不相同，而其他组织未见明显染色，这表明SP1、SP2、SP3等长度较长的5'侧翼序列可以驱动下游报告基因在愈伤分生组织中的表达，即在甘蔗愈伤组织中表现出特定的启动子活性。
3讨论
(1)实验通过二步法长距离PCR扩增，获得长度不同的甘蔗SPSⅢ基因DNA片段。判断推测二者间的关系，或是分布在不同对染色体位置上SPS Ⅲ类群基因的相应拷贝子，或是SPSⅢ等位基因片段。McIntyre等(2006)指出，随着育种的发展，甘蔗
染色体数不断增多，异染色质含量增加，遗传背景来源复杂。通过SNP分析甘蔗基因组SPSⅢ家族基因，发现至少存在两大类群基因家族，其各自具有不同的拷贝数或者等位片段。同样，在小麦和其他禾本科植物中也存在这个情况，由于基因组庞大，各个家族的SPS又都含有不同类型的基因群(Sharma et al.,2010)，情况十分复杂。因此要弄清本实验所得的EU278617和EU278618间的关系，有待进一步的染色体定位检测和可靠的生物信息学数据分析。
目前已有植物SPS启动子的报道，其中以水稻SPS1启动子的研究最为深入分析。将GUS报告基因与SPS1启动子连接，发现GUS主要在光合叶中表达，且基因的转录是受光调控，和叶肉细胞中相关质体的发育相关。随后在未成熟花的花粉和幼苗的盾片中也检测到SPS1表达。由于SPS1核心启动子区上缺失TA TA序列，不具有典型的启动子结构。通过缺失表达实验确认在上游146bp的5'侧翼序列驱动了下游基因的表达，其间一段22bp 的类启动序列(TCACCC)带有基本转录活性(Miguel et al.,2004,2008)。但水稻SPS1与本研究的甘蔗SPSⅢ分属两个不同的家族，表达的模式各异。即便同一植物，不同家族的SPS表达也各不相同。SPS1则在稻叶中优势表达，而SPSⅢ在甘蔗根茎叶中均有表达。
甘蔗SPSⅢ基因组DNA及5'侧翼序列的克隆与分析
Cloning and Sequence Analysis of Sucrose Phosphate Synthase Genomic DNA and5'-Flanking Sequence from Sugarcane
bp M123
15000
10000
7500
5000
图4PCR扩增甘蔗SPSⅢDNA片段
Figure4PCR products of SPSⅢgene
M：DNA marker；1：甘蔗SPSⅢDNA片段的PCR扩增产物；2：SPSⅢG1克隆重组质粒的PCR鉴定；3：SPSⅢG2克隆重组质粒的PCR鉴定
M:DNA marker;1:PCR amplified productions of sugarcane SPSⅢgenomic DNA framents;2:PCR identification of re-combinant plasmid SPSⅢG1;3:PCR identification of recom-binant plasmid SPSⅢG2
bp M123
4000
3000
2000
1500
1000
图5接头连接PCR分离SPSⅢ基因5'侧翼序列
Figure5The isolation of SPSⅢ5'-flanking sequence us?ing adaptor-ligation PCR
M：DNA marker；1：不稀释的1st PCR产物为模板的2nd PCR扩增结果；2：10倍稀释的1st PCR产物为模板的2nd PCR扩增结果；3：100倍稀释的1st PCR产物为模板的2nd PCR扩增结果
M:DNA marker;1:PCR amplified result for undiluted1st PCR product as2nd PCR template;2:PCR amplified result for1/10dilution of the1st PCR product as2nd PCR template; 3:PCR amplified result for1/100dilution of the1st PCR product as2nd PCR template
5
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Biotechnology
图6甘蔗SPS Ⅲ5'侧翼序列Figure 6
The 5'-flanking sequence of sugarcane SPS Ⅲ
方框内为预测的顺式作用元件；下划线接头连接PCR 引物序列；粗体字为SPS Ⅲ基因编码框，双下划线为翻译起始密码子ATG ，定义起始密码子中的A 被为+1，其他数字为相对于起始密码A TG 的位置。D6-SP1、D6-SP2、D6-SP3、D6-SP4、D6-SP5、D6-SP-Neg 为启动子活性缺失表达实验中不同短截片段的起始位置，D6-SP-T 为短截片段终止位置
Predicted cis-actingelement is indicated by rectangular box;The adaptor-ligation PCR primes is indicated by underlined;Coding sequence as bold text and translation initiation codon by double underlined.In this paper the translation initiation site ATG was defined with +1,other numbers indicate the positions relative to the translation start site ATG.D6-SP1,D6-SP2,D6-SP3,D6-SP4,D6-SP5and D6-SP-Neg indicate the initiation site of different fragments in promoter deletion experiment respectively,and D6-SP-T indicates the termination site
6
(2)SPS 启动子上存在着特异的调控元件控制着基因的转录表达。如水稻内源生理节律与糖信号调控SPS1转录水平(Okamura et al.,2011)。猕猴桃SPS-A2启动子区域预测存在乙烯、
光、赤霉素酸、蔗糖、低温、脱落酸响应元件，但将其连接报告基因，轰击苹果原生质时并未发现瞬时表达；遗传转化拟南芥稳定表达后，发现相关报告基因仅在植株维管组织和幼苗中转录表达(Fung et al.,2003)。在对香蕉的研究中，观察到乙烯、生长素和低温、持续日晒都能不同程度地促进SPS 转录积累。在
SPS 启动子区域，特定的LTRE 、反式GCC-box 、
GATA-box LRE 、GAGA-box 、ARE motifs 都表现出强烈的DNA-核蛋白质互作用(Choudhury et al.,2008)。对香蕉SPS 启动子活性的瞬时表达分析，证实SPS 启动子活跃地调控基因表达(Choudhury et al.,2010)。
分析本研究中所得甘蔗SPS Ⅲ5'侧翼序列，预测可得光响应元件与分生组织特异性表达元件，与水稻、猕猴桃、香蕉的情况类似。由于甘蔗遗传转化困难，采用基因枪轰击观察瞬时表达是鉴定启动子活性的最为快捷和有效的方式。在本实验中，只观察到5'侧翼序列SP1、SP2、SP3连接的报告基因的瞬时表达。这可能是由于愈伤分生组织是未分化或分化程度很小的组织，而5'侧翼序列SP1、SP2、SP3中存在分生组织特异性表达元件CAT-box 、GCN4-motif ，因此在愈伤组织中也能观察5'侧翼序列SP1、
SP2、SP3驱动报告基因的转录表达。其他光响应元件的检测需要特定的暗室和绿光源，受实验条件限制，暂时未能展开。
甘蔗SPS Ⅲ基因组DNA 及5'侧翼序列的克隆与分析
Cloning and Sequence Analysis of Sucrose Phosphate Synthase Genomic DNA and 5'-Flanking Sequence from
Sugarcane
图8甘蔗愈伤组织的GUS 瞬时表达分析Figure 8
GUS transient expression in calli lines
A~F ：甘蔗愈伤组织接受D6-SP1、D6-SP2、D6-SP3、D6-SP4、D6-SP5、D6-SP-Neg(阴性对照)质粒基因枪轰击，72h 恢复培养后的GUS 染色结果，D6-SP1、D6-SP2、D6-SP3轰击组织上存在蓝色斑点，其他未见明显染色；G ：GUS 染色未受轰击的愈伤组织
A~F:GUS expression in calli 72h after gene-gun bombardment with plasmid D6-SP1,D6-SP2,D6-SP3,D6-SP4,D6-SP5and D6-SP-Neg;Blue spots on calli bombarded with plasmid D6-SP1,D6-SP2,D6-SP3were observed,whereas none on other bom-bardments;G:No-treatment control
2000
1000500250100
231309416
bp M1
1
2
3
4
5
6
M2
bp
图7酶切鉴定重组的缺失表达载体Figure 7
Enzyme digestion results of the recombinant
vector with the deletion 5'flanking sequence
M1,M2:DNA marker;1:D6-SP1;2:D6-SP2;3:D6-SP3;4:D6-SP4;5:D6-SP5;6:D6-SP-Neg
7
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(3)前期工作中，已定量检测甘蔗幼苗与糖积累不同时期甘蔗SPSⅢ在幼叶、正3叶、第2节茎、第9节茎、第14节茎、第18节茎的转录表达，各个时期各个组织中的表达量显现规律变化(宋喜梅等,2010)，这表明SPSⅢ启动子具有特定调控能力。将本研究所获得5'侧翼序列直接连接报告基因转化烟草稳定表达，可以观察到转基因植株T0代茎叶花、T1代幼苗子叶等器官组织中报告基因的不同表达情况(高玉娜等,2010;池朝华等,2011)。综合判断烟草转化实验和甘蔗愈伤组织瞬时表达实验结果，进一步证实实验所得的5'侧翼序列具有启动子活性，且具有表达调控功能，确为甘蔗SPSⅢ启动子序列。
4结论
本研究克隆了甘蔗SPSⅢ的基因组DNA片段及其5'侧翼序列。分析表明，SPSⅢ具有13个外显子和12个内含子，5'侧翼序列含有顺式DNA作用元件和植物启动子TA TA启动盒。进一步通过启动子缺失实验，证实了所克隆到的5'侧翼序列具有启动子活性，是甘蔗SPSⅢ基因的启动子，且具有一定的表达特性。这些工作为继续了解具体基因结构和生物学功能提供了帮助。实验建立的SPSⅢ侧翼序列启动子活性瞬时表达体系，为观察不同内外在环境下甘蔗SPSⅢ的转录应答反应提供了方便快捷的研究手段，有助于今后研究启动子与特异性转录因子的相互作用机制，为确认蔗茎中SPSⅢ的高转录表达是否是甘蔗成熟期库糖积累的需要提供参考依据。
参考文献
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甘蔗SPS Ⅲ基因组DNA 及5'侧翼序列的克隆与分析
Cloning and Sequence Analysis of Sucrose Phosphate Synthase Genomic DNA and 5'-Flanking Sequence from Sugarcane (责任编辑任立刚)
沙特阿拉伯蝙蝠携带的中东呼吸系统综合症冠状病毒
Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus in Bats,Saudi Arabia
自从2012年9月份报道了中东呼吸系统综合征(MERS)以来，全世界范围已经有90例这样的病历，其中70个就来自沙特阿拉伯。引起该疾病的β-冠状病毒还没有确定，但是该病毒的死亡率极高，大约为65%。人传染人的情况已被记录在案，但是人类感染中东呼吸系统综合症冠状病毒的来源还不清楚。
从2013年10月到2013年8月，沙特阿拉伯卫生部及美国哥伦比亚大学的研究人员从发现中东呼吸系统综合症的地方的蝙蝠身上收集了一些病毒样品并进一步进行了鉴定。随后他们调查了那些感染该病毒的病人和家属以及他们住所小于12公里范围内的蝙蝠样品，包括一个无人看管的海枣园和他工作1公里范围的一个五金店前边的一个花园。尽管无论是病人还是家人都很难回忆起他们是否见过蝙蝠，研究人员还是调查了12公里范围内的蝙蝠栖息地及堆放肥料的一些地方。经过3周的调查，他们捕获了7个种类的96只蝙蝠，取样后他们释放了这些蝙蝠。他们对这些样品进行基因组DNA 的提取，并且根据MERS 冠状病毒的序列设计引物在DNA 样品中进行PCR 扩增。他们对收集的732个粪渣样品样品中的220以及91个肠道样品中的7个进行了检测。通过对PCR 产物测序及数据库序列比对分析，发现2012年10月在沙特阿拉伯捕获的一只蝙蝠身上携带的病毒与感染该病毒的人体所携带的病毒核苷酸序列同源性达到100%。同时该蝙蝠身上感染了多种α-冠状病毒和β-冠状病毒。虽然只有一只蝙蝠身上的样品显示了这样的高同源性，但是他们还是推测蝙蝠可能在人类感染该病毒中起着重要的作用，这可能是由于2012年10月取样后运送过程中低温措施影响样品的敏感性所致。随后他们深入进行了蝙蝠身上病毒序列与人类携带的病毒序列的进一步分析与比对。该研究近期发表于期刊《Emerging Infectious Disease Journal 》上，研究人员还指出蝙蝠本身已经被证明与人类很多重要疾病相关，他们携带包括狂犬病毒、亨德拉病毒等等，是很多人类疾病传染的根源。当然考虑到他们取样的稀有性，也不排除该病毒有其他的传染源。总之，该研究的发表使人们更深入地了解了中东呼吸系统综合症冠状病毒，为后期寻找蝙蝠或者其他野生或者家养动物与人类疾病的潜在关系指明了方向。
编者：吴慧玲(北京市农林科学院植环所),本刊通讯员
本文引用格式：吴慧琳,2014.沙特阿拉伯蝙蝠携带的中东呼吸系统综合症冠状病毒.农业生物技术学报,22(1):9信息来源：Emerging Infectious Disease Journal,2013,19(11):
1819-1823
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基因组学的研究内容 结构基因组学： 基因定位；基因组作图；测定核苷酸序列 功能基因组学：又称后基因组学（postgenomics基因的识别、鉴定、克隆；基因结构、功能及其相互关系；基因表达调控的研究 蛋白质组学： 鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式 遗传图谱 （genetic map）采用遗传分析的方法将基因或其它dNA序列标定在染色体上构建连锁图。 遗传标记： 有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。 构建遗传图谱 就是寻找基因组不同位置上的特征标记。包括： 形态标记； 细胞学标记； 生化标记；DNA 分子标记 所有的标记都必须具有多态性！所有多态性都是基因突变的结果！ 形态标记： 形态性状：株高、颜色、白化症等，又称表型标记。 数量少，很多突变是致死的，受环境、生育期等因素的影响 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。
细胞学标记 明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 ：染色体的核型、染色体的带型、染色 体的结构变异、染色体的数目变异。优点：不受环境影响。缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利 生化标记 又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。 如：同工酶、贮藏蛋白 优点： 数量较多，受环境影响小 ?
缺点： 受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息 DNA 分子标记： 简称分子标记以 DNA 序列的多态性作为遗传标记 优点： ? 不受时间和环境的限制 ? 遍布整个基因组，数量无限 ?
不影响性状表达 ? 自然存在的变异丰富，多态性好 ? 共显性，能鉴别纯合体和杂合体 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ， RFLP ） DNA 序列能或不能被某一酶酶切，
宏基因组学概述
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宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
克隆土壤宏基因组：一个访问未培养微生物的遗传和功能多样性战略 米歇尔河Rondon 1 ，‖保罗·R·8月 2日，艾伦D.贝特曼 1，肖恩楼布雷迪 3特鲁迪H.格罗斯曼2 ，?马克R.离子亲石元素 1，卡拉答洛亚科诺 2，伯克利A.林奇 2 ，?伊恩·A.麦克尼尔 2查尔斯小调 2，彩丽张晓卿 22，迈克尔·吉尔曼§玛西娅与Osburne 2，乔恩Clardy 3，乔Handelsman 1，*，罗伯特·古德曼 1 +作者背景 植物病理学系，威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星州麦迪逊大学1 ; ARIAD制药公司，剑桥，马萨诸塞州2 ; 化学及化学生物学系，康奈尔大学，纽约3 摘要 在微生物分子生态学的研究进展表明，传统的养殖方法失败代表在自然界中微生物多样性的范围，因为只有一个可行的微生物样本中的一小部分是由栽培技术恢复。发展的方法来研究微生物多样性的充分程度，我们用细菌人工染色体（BAC）载体，构建直接从土壤中分离出（称为宏基因组库）的基因组DNA库。到今天为止，我们已经建成了两个这样的图书馆，其中包含超过100英镑的DNA。16S rRNA基因库之一，从恢复序列的系统发育分析表明，BAC 文库包含了微生物门类品种繁多，包括从不同的类群，如低- G + C的革兰氏阳性序列DNA Acidobacterium，Cytophagales的，变形杆菌。大肠杆菌库中的初步筛选，确定了几个克隆，表达外源基因插入，确认BAC载体可用于维护，表达，分析环境的DNA。这些克隆所表达的表型，包括抗菌，脂肪酶，淀粉酶，核酸，和溶血性活动。宏基因组库是一个探索土壤微生物多样性，落后的土壤中的微生物的遗传信息提供访问的强大工具。这些图书馆将是新举措的基础上，进行基因组研究，链接的由难治种植的微生物为主的环境有关的微生物的进化和功能信息。 生物圈主要是由微生物（32），但大多数微生物在自然界尚未研究。传统培养微生物的方法，限制那些生长在实验室条件下（14，25）的分析。最近激增的微生物分子生态学的研究提供了令人信服的证据表明存在着许多新的类型的微生物在环境中的数量和品种较少的微生物
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。 由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
如何查找基因序列？（转载） (2010-08-01 11:47:41) 如何查找基因序列？ ——在Genbank中寻找目的基因的实例 ——献给受类似问题困扰的广大酷友，以及给我动力和信心发表原创帖的基因酷的朋友们。 酷友感言：网络的世界很精彩，网络的查询很无奈。为了我们的科学研究事业，为了我们能够顺利毕业，我们的广大酷友们在网络的海洋里遨游…遨游…咋就找不到彼岸呢？今天要设计这个基因的PCR引物，明天又要查那个基因的信息，那么大一张网，唉想起来就郁闷……鉴此，我们推出了利用Genbank查找基因序列的帖子，希望对大家有所帮助，并请大家多多指教！当然，如果您已经是此中高手，那就权当我是班门弄斧了，呵呵。 1. 根据文献 搞reasearch肯定要读文献的，如果你曾经在文献中看到过你感兴趣的基因，而且文中还提到了该基因在Genbank中的ID号，那就好办了，直接打开https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把Genbank ID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了。 举例说明，例如：在2003年JBC的文章（Conditional Knock-out of
Integrin-linked Kinase Demonstrates an Essential Role in Protein Kinase B/Akt Activation）中出现了“calreticulin (GenBank accession number gi 16151096)”，那么把“16151096”输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到该基因了（当然包括基因序列等相关信息）。 在出现了检索结果界面（下图）后，直接点击红箭头所指的 AY047586就可以看到基因的相关信息了...（呵呵，是不是有点太......easy 了） 这里需要指出一下，在显示基因的页面右侧有一个Link，点击后出现一个小菜单，里面是与该基因相关的链接，很有用的，值得一个一个地去看看，这里我就不多说了。点击 AY047586后出现的界面如下：如果你只想获得序列（例如去设计PCR引物的时候），那就可以选择FASTA，这样就得到了FASTA格式的序列文件，没有其他数字和格式的干扰。 （缩略图，点击图片链接看原图）这就是FASTA格式的序列： （缩略图，点击图片链接看原图）2. 根据已经获得的基因的相关信息进行查找（待续......） 鼓励一下吧，累坏了正如路漫漫所说，如果只是知道基因的名字，怎么查序列呢？还是举例说明，比如我想做的基因名称是人的VEGF基因，那么怎么在Genbank中找到它呢？还是一步一步来...打开https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,/ 在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165) 摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1 宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2 宏基因组学的应用 2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得
宏基因组测序技术 检测方法
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。 样品处理： 宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。 核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导
宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划 起草人：李浩宇 宏基因组学研究方向及意义 研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。 发掘：环境应激和应答基因的多态性。 探究：多态性基因的功能。 实验大体步骤：
I.环境样品的采集： 1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。 2）样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。 3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。 II.DNA提取方法的选择： 总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。 直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。 间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。 直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。 可以考虑MoBio 和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。 间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/8116780433.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
宏基因组测序讲解
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。 3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究
宏基因组克隆)))微生物活性物质筛选的新途径* 阎冰1,2洪葵1**许云1马超1 (中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验室海口571101)1 (广西红树林研究中心北海536000)2 摘要:在现有技术条件下自然界存在的微生物95%以上未能培养,采用传统的分离培养筛 选的途径寻找新的微生物生物活性物质受到局限;宏基因组是特定小生境中全部微小生物 遗传物质的总和,直接抽提环境样品中的总DNA,利用适宜的载体克隆到替代宿主细胞中 构建宏基因组文库,通过外源基因赋予宿主细胞的新性状或基于某些已知DNA序列筛选, 寻找新的生物活性物质或基因,极大地扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新的生 物活性物质的机会。 关键词:宏基因组,环境总DNA,功能驱动筛选,序列驱动筛选 中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:0253-2654(2005)01-0113-05 M etage no m e Cloning)A Ne w Approach for NovelM icrobial B ioactive Co m poundsD iscovery YAN B i ng1,2HONG Kui1XU Yun1MA Chao1 (Instit u te of Trop ic a lB iolo g ical S cie n ces,Ch i neseA c ad e my of T ropical Ag ric u lt u ral S cience,S t a teK ey Lab for T ropical C rops B iotec hnology,H a i kou571101)1 (G uan gxiM an g roveR ese arc h Center,B eihai536000)2 A bstract:It i s reported t h atm ore t han95%m i crobe spec i es non-cu lt u red or un-cu lt ured yet i n n ow days by t h e trad iti onal cu lti vati on approach,w h i ch li m its d iscoveri ng novel b i oacti ve co mpou nd s fro m m i croorgan i s m s1-M e-t ageno m e.i s t he genom es of the tot alm i crob i ota f ound i n nat u re1M et ageno m e li brariesw ere con structed by d irec-t l y extracti ng DNA fro m environ m en t al sa mp le and tran sf or m i ng t o s u rrogate host1The li b rari esw ere screen ed for novel b i oactive co m pounds or genes surround i ng their s ynthase i n d i ff eren t strat egi es of f uncti on-dri ven or se- quence-dri ven1These h ave enor m ousl y a m p lified t he space ofm icrobial resource utili zation and enhanced the op- portun i ty of obtai n novel b i oactive co mpounds1 K ey words:M etageno m e,Env i ron m ental t otalDNA,Fun cti on-driven screen i ng,Sequence-dri ven screen i ng 微生物活性物质筛选传统方法的基础是微生物分离,获得纯培养,其研究流程包括微生物分离纯化、大量培养、活性检测、活性物质的分离纯化直至开发利用。这一途径被证明是行之有效的,沿着这一途径找到了许多活性物质,但重复发现率特别高。分子微生物生态学研究表明环境中大量存在未能培养的微生物,据估计每克土壤样品中可含有高达40000种的不同微生物,某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%。最近,一个全新的理念)))/宏基因组克隆0:直接提取特定环境中的总*国家/8630海洋生物技术青年基金项目资助(No12002AA628140) 海南省普通高校优秀中青年教师科研和教学奖励基金资助 **联系人E-m ai:l k1022@1631net 收稿日期:2004-04-15,修回日期:2004-05-31