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利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
作者：赵容荣齐仙刘玉忠申业黄璐琦
来源：《中国中药杂志》2014年第09期
[摘要]NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway 克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚
合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。实验结果表明Gateway
载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。
[关键词]RNAi； Gateway载体； BP和LR反应
Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。λ
噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的
基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。
与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。Gateway技术可以在任何选择的系统：细菌、酵母、昆虫或哺乳动物等[3-7]进行基因的功能表达分析。现在的多点Gateway技术[8]，能够将一个或多个基因克隆到蛋白表达载体，这项强大的体外重组技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，且同时克隆效率高达95%或更高。当基因在重组目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，同时，Gateway也有助于进行带有不同标签蛋白的表达和纯化，见图1。
NAC是高等植物中特有的一类转录因子，自20世纪90年代从矮牵牛分离第1个NAC基因后[9]。拟南芥中已发现109个NAC转录因子，水稻中有75个NAC[10]。NAC蛋白根据N端保守序将NAC蛋白分为两大类（Ⅰ，Ⅱ），各包含14和4个亚类[11]。NAC转录因子参与植物生长发育的调控，如花器官的发育、侧根的形成、木质部次生壁的形成以及叶片衰老等，同时NAC还参与生物胁迫和非生物胁迫。