项目名称：神经分化各阶段细胞命运决定的调控网
络研究及其转化应用
首席科学家：章小清同济大学
起止年限：2012.1至2016.8
依托部门：上海市科委教育部
一、关键科学问题及研究内容
（一）拟解决的关键科学问题
本项目要解决的关键科学问题是：1）多能干细胞分化为神经外胚层细胞并区域化为部位特异性神经前体细胞、以及部位特异性的神经前体细胞终末分化为神经元或胶质细胞的过程是由哪些信号和胞内因子决定的；2）如何将体外定向分化过程和体内胚胎发育相结合，揭示胚胎发育过程中各神经细胞类型生成的调控网络及分子网络的异常对早期胚胎发育的影响；3）人类神经系统分化发育和小鼠之间存在哪些异同，现有的通过对小鼠研究获得的知识哪些是适用于人类，以及人类有哪些特征性之处区别于小鼠；4）如何根据神经分化过程中的决定信号和胞内决定因子建立高效的生成特定类型神经细胞的技术方法，包括程序性分化、去分化和转分化, 并用来治疗某些中枢神经系统疾病。具体分解为以下几点：
1.基于我们已经建立的并结合其他实验室建立的多能干细胞高效定向分化方
法，将人类ES细胞分化为神经外胚层细胞（Neuroectoderm）和中胚层-内胚层细胞（Meso-endoderm）。另一方面，将神经外胚层细胞继续分化为神经前体细胞（Neuroprogenitor）。横向比较神经外胚层细胞和中胚层-内胚层细胞；纵向比较上游的多能干细胞、神经外胚层细胞和其下游的神经前体细胞，进行基因表达谱分析，从而提炼出神经外胚层细胞特有的信号网络和转录调控网络。同时通过调控这些信号网络和转录网络，分析其在神经外胚层细胞分化中的作用；以及是否可以通过调控这些网络提高神经定向分化的效率；
或研究这些信号和转录网络是否能使神经前体细胞或星型胶质细胞去分化为神经外胚层细胞。同时结合早期正常胚胎标本，分析体外神经外胚层细胞分化是否和体内发育过程吻合；结合神经系统发育异常早期胚胎标本，分析某些分子网络异常是否和早期胚胎发育缺陷相关；并通过比较人类和小鼠的神经外胚层分化，分析进化过程中的保守性和特异性。
2.在Wnt、SHH、BMP、RA等变形素的作用下，将神经外胚层细胞区域化为前
脑背侧或腹侧神经前体细胞，脊髓背侧或腹侧神经前体细胞。横向比较各部
位特异性的神经前体细胞；纵向比较上游的神经外胚层细胞、神经前体细胞和其下游的神经元或胶质细胞，进行基因表达谱分析，从而提炼出各部位特异神经前体细胞的信号网络和转录调控网络。其中既包括调控区域化部位的胞外胞内信号分子传递，也包括调控神经前体细胞分化发育阶段的胞外胞内信号分子传递。通过调控这些信号网络和转录网络，分析其在神经前体细胞分化中的作用；以及是否可以通过调控这些网络提高神经定向分化的效率；
或研究这些信号和转录网络是否能使不同部位特征的神经前体细胞互相转换或使胶质细胞去分化为部位特异的神经前体细胞。结合胚胎标本，分析体外神经外胚层区域化机制是否和体内发育过程吻合，以及分子网络异常是否和某些神经系统早期发育缺陷相关；并通过比较人类和小鼠的神经前体细胞分化过程，分析进化过程中的保守性和特异性。
3.将前脑腹侧MGE（Medial Gangalia Eminence）神经前体细胞分化为GABA抑
制性中间神经元及前脑胆碱能神经元。将脊髓腹侧神经前体细胞分化为脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞。通过单细胞mRNA-Sequencing分析各细胞类型之间的基因表达谱，提炼神经前体细胞终末分化为特定类型神经细胞的调控信号网络和转录因子网络。分析这些调控网络在不同亚型神经元或在胶质细胞分化中的作用；探讨通过调控这些网络提高特定类型神经细胞分化效率的方法；探讨通过这些调控网络将星型胶质细胞直接编程为GABA 抑制性中间神经元、前脑胆碱能神经元、脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞的方法。同样结合胚胎标本，分析这些体外神经分化过程中的调控机制是否和体内发育过程吻合及其与某些早期胚胎发育缺陷的关联；并通过比较人类和小鼠的神经生成或胶质生成过程，分析进化过程中的保守性和特异性。
4.研究如何基于神经分化各阶段细胞命运决定的分子调控网络，通过高效的神
经定向分化方法，或通过将星型胶质细胞直接重编程的方法，得到GABA抑制性中间神经元、前脑胆碱能神经元、脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞。体外研究这些神经元和胶质细胞的生化特性、电生理特性、及功能活性，包括其调控下游靶细胞的能力。将少突胶质细胞移植入Shiverer/SCID 小鼠侧脑室，观测其形成髓鞘的能力。将前脑胆碱能神经元移植入学习记忆缺陷的小鼠海马，观测其对学习记忆改善的情况并对其进行生理测试。根据
人类和小鼠在神经定向分化过程中的异同，利用保守的调控网络尝试将海马星型胶质细胞体内原位直接重编程为前脑胆碱能神经元，观测小鼠学习记忆改善的情况。
回答这些关键科学问题的核心是通过横向和纵向的比较，结合胚胎标本提炼神经分化发育各阶段，包括神经外胚层细胞、部位特异性多潜能神经前体细胞及成熟的神经细胞的信号网络和转录因子网络。并进一步通过调控这些分子网络，建立高效生成特定类型神经元或胶质细胞的技术方法。在此基础上和特定疾病状态结合，研究这些神经细胞的功能活性及其在中枢神经系统疾病治疗中的实际意义。
（二）主要研究内容
围绕以上关键问题，本项目拟设置以下四个课题：一，神经外胚层细胞命运决定的分子网络研究；二，神经外胚层细胞头-尾侧化和背-腹侧化为神经前体细胞的调控网络研究；三，功能性和区域特异性神经元生成和胶质细胞生成的调控网络研究；四，基于分子调控网络，通过分化、去分化或转分化方法获得特定类型有功能活性的GABA抑制性中间神经元、前脑胆碱能神经元、脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞, 及其在老年痴呆、脱髓鞘病变等中枢神经系统疾病中的应用前景分析。通过以上研究内容的实施，本项目的预期目标是实现多能干细胞神经定向分化的高效性和可调控性；利用发现的调控各阶段神经细胞定向分化的调控网络，实现靶向到特定神经前体细胞/有功能神经细胞的部分重编程（去分化和转分化）；在体外、体内检测分化、去分化或转分化而来的各类型神经元的电生理特性、递质释放及通过突触联系调控下游靶细胞等功能活动，并对将这些神经元应用于中枢神经系统疾病进行前景分析；将少突胶质细胞移植入Shiverer小鼠观测重新形成髓鞘的能力。与此同时，通过建立人类早期胚胎冰冻切片标本库，通过将体外定向分化和体内胚胎发育有机结合，验证胚胎发育过程中细胞类型转换的分子机制及这些分子机制异常对早期胚胎发育的影响；通过对不同种属进行比较，尤其是将人类系统和生物医学中常用的动物模型小鼠进行比较，研究神经分化发育在种属间的保守性和特征性。
在多能干细胞向神经细胞定向分化的过程中，主要经过神经诱导(Neural Induction)、区域化(Neural Patterning)和神经生成或胶质生成(neurogenesis或gliogenesis)等三个主要阶段。具体讲，ES细胞或iPS细胞在脱离其合适的培养环境后，发生分化，并在特异信号的引导下(主要是抑制BMP、激活FGF)转变为神经外胚层细胞，这就是神经诱导；在区域化信号(变形素，如RA使细胞尾侧化，SHH使细胞腹侧化，Wnt和BMP使细胞背侧化)的作用下，神经外胚层细胞区域化为部位特异性的多潜能神经前体细胞；区域化的多潜能神经前体细胞在一定的信号作用下分化并逐渐成熟为神经元(PDGF, NT3等)或胶质细胞(LIF, CNTF等)。在多能干细胞→神经外胚层细胞→多潜能神经前体细胞→神经元或胶质细胞逐步分化的过程中，除了这些关键信号的作用外，转录因子也在其中起了决定性作用。然而目前我们对哪些转录因子在这些过程中起关键作用，及其具体的分子机制仍然了解的较少，研究最为透彻的还是以Oct4/Sox2/Nanog为核心的转录网络在早期的多能干细胞自我更新中的关键作用。还有一点必须提及的是神经定向分化的过程，同时也是各类型神经干细胞分化潜能逐步下降的过程。神经外胚层细胞能分化为神经系统的各种细胞类型，而区域化后的神经前体细胞只能分化为神经系统某一特定部位的神经元和胶质细胞。在此，我们拟设立课题1，2，3 分别就神经分化各关键步骤的分子机制进行深入探讨，同时通过课题 4 将这些基础研究向实际应用进行转化。
1．神经外胚层细胞命运决定的分子网络研究
有关神经外胚层发育的研究在上世纪20年代就开始了。当时通过在蛙卵中进行细胞移植实验，发现蛙卵中一些特定部位的细胞能诱导外胚层细胞（类似于哺乳动物中的多能干细胞）发育为神经组织。其后几十年的研究发现，这些细胞分泌Noggin等BMP信号抑制因子，从而促进神经外胚层的生成。这就为后来形成著名的“Default”神经诱导学说奠定了基础，即外胚层细胞在没有外来信号作用的情况下倾向于发育为神经外胚层，Noggin就是通过抑制BMP信号而发挥神经诱导的作用。但是越来越多的实验也证实，神经诱导可能是一个较为复杂的过程，除了抑制BMP信号外，激活FGF信号及抑制Wnt信号可能也在其中发挥重要作用。由于哺乳动物的胚胎发育在子宫内进行，因而对哺乳动物胚胎发育分子
调控机制的研究要困难的多。虽然小鼠转基因研究从某些侧面证实了抑制BMP、激活FGF信号在小鼠神经外胚层细胞发育的过程中起重要作用，但是这些结论都不如在对蛙卵和鸡胚的研究中清楚。而我们对人类自身的神经系统发育尚没有很好的工具进行研究。另一方面，虽然人们对细胞外的信号在神经外胚层细胞发育过程中的作用有了较多的理解，对这一过程中细胞内转录因子网络的理解却所知甚少。我们在2010年Cell Stem Cell杂志上发表文章，率先通过多能干细胞的体外分化对体内胚胎发育进行模拟，研究证明了转录因子Pax6是人类多能干细胞分化为神经外胚层细胞的充分必要条件。进一步的研究显示，Pax6的这种作用是灵长类动物所特有，而不适用于小鼠。结合胚胎标本，我们进一步证实了这种差异在体外和体内是一致的。今年Sasai课题组在Nature杂志上发表文章，证明了小鼠中另一转录因子Zfp521是靶向小鼠多能干细胞到神经外胚层细胞的充分必要条件。这些实验结果提示，作为最高等的生物，人类可能在某些发育机制上和其它动物存在差异，而人类多能干细胞可以被用来对这些机制进行深入剖析。
在课题1，我们拟首先将人类ES细胞分化为神经外胚层细胞，然后再将神经外胚层细胞经过约一周左右分化为神经前体细胞。或我们将多能干细胞分别分化为神经外胚层细胞和中胚层-内胚层细胞。在通过免疫荧光检测或流式细胞分析对分化细胞纯度进行分析后（至少95%以上，多能干细胞Nanog+/Oct4+；神经外胚层细胞Pax6+/Sox2+/Sox；前脑神经前体细胞FoxG1+/Sox1+/Sox2+；中胚层-内胚层细胞Pax6-/Sox2-/T+或Sox17+），通过mRNA-Sequencing对基因表达谱进行横向和纵向比较，提炼出神经外胚层细胞有关细胞类型和分化发育阶段的特征信息，包括信号网络和转录因子网络。这些信号应包括FGF的激活，BMP信号的抑制，也可能包括其他我们未知的信号，例如Notch信号、IGF信号等。这些转录因子应包括Pax6，也可能包括其它的转录因子，例如Six3、Six6、LMO3等。与此同时，这些信号和转录因子可以相互作用和影响，信号之间和转录因子之间既可以是相互平行的关系，也可以是上下游关系。总之，通过化学和基因干预，我们可以理清这些信号和转录因子网络相互之间的关系；探讨这些信号网络和转录因子网络在神经外胚层细胞分化中的作用机制；根据这些分子网络完善神经外胚层细胞分化的技术方法；并研究这些分子网络是否能将部位特征限定的神经前体细胞逆转为神经外胚层细胞，这些重编程的神经外胚层细胞进而可以被区域化
为各种神经细胞类型；同时和正常胚胎标本结合，将体外神经分化的研究和体内胚胎发育挂钩，利用体外模型模拟体内胚胎发育的过程，或通过神经发育异常的胚胎标本，分析分子网络异常对早期胚胎发育的影响；通过人类细胞和小鼠细胞的比较，从进化的角度分析人和其他种属在神经发育过程中的保守性及特异性。2．神经外胚层细胞头-尾侧化和背-腹侧化为神经前体细胞的调控网络研究
在胚胎发育过程中，神经盘的细胞由于受到其下方的中胚层和内胚层细胞的信号传递，在发育闭合为神经管的同时沿头-尾轴和背-腹轴被区域化。与此类似，在多能干细胞神经定向分化的过程中，类似于神经盘的神经外胚层细胞在相同区域化因子的作用下，也能被区域化为各种部位特异性神经前体细胞。然而至于区域化因子是如何诱导部位特征基因表达；部位特征基因又如何界定各部位的神经前体细胞；各部位神经前体细胞之间的共性和特点；以及多潜能神经前体细胞区别于其上下游神经细胞的分子机制尚不清楚。利用多能干细胞神经定向分化这一工具，将为我们就这些问题的研究提供前所未有的便利。
在课题2，我们将首先用100-500 ng/ml SHH, 联合或不联合1 mM RA，处理分化第10天的神经外胚层细胞1周，从而获得前脑背侧（Pax6+/FoxG1+/Nkx2.1-），前脑腹侧(Pax6-/Nkx2.1+/FoxG1+)，脊髓背侧(Pax6+/Dbx2+) 和脊髓腹侧(Nkx2.2+/Olig2+) 神经前体细胞，这些神经前体细胞再进一步向下游最终分化为前脑背侧皮层谷氨酸能神经元、前脑腹侧纹状体GABA抑制性中间神经元、前脑胆碱能神经元、脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞等。和课题1类似，在保证细胞纯度超过95%的情况下，通过横向分析前脑背侧，前脑腹侧，脊髓背侧和脊髓腹侧神经前体细胞，提炼各神经前体细胞的共同点和部位特征; 通过纵向分析神经外胚层细胞，神经前体细胞和终末分化细胞的基因表达谱，进而提炼出多潜能神经前体细胞区别于上游神经外胚层细胞和下游终末分化细胞的有关细胞发育阶段的分子网络。基于这些关键信号和转录因子的分子网络，我们将进一步研究化学或基因干预这些分子网络对神经外胚层细胞区域化的影响，包括信号和转录因子的关系及转录因子之间的相互调控；各部位特异神经前体细胞之间的本质差异及互相转换的可能；以及这些信号和转录网络是否能将星型胶质细胞逆转为部位特异的神经前体细胞。同样通过和胚胎标本结合或通过比较人类系统及
小鼠系统，研究人类早期神经系统胚胎发育及人类进化过程中的保守性和特异性。
3．神经元生成和胶质细胞生成的调控网络研究
部位特异的多潜能神经前体细胞继续分化为特定类型的神经元和胶质细胞。由于此时细胞周围环境复杂，较难在体外进行模拟，因而很难对神经定向分化精确控制。以前脑腹侧和脊髓腹侧神经前体细胞为例，前脑腹侧MGE神经前体细胞分化为纹状体GABA抑制性中间神经元或前脑胆碱能神经元；而脊髓腹侧神经前体细胞分化为脊髓前角胆碱能运动神经元或少突胶质细胞。虽然通过转基因小鼠的实验，初步明确了Lhx6 和Lhx7/8在区分纹状体GABA抑制性中间神经元和前脑胆碱能神经元当中的作用，明确了FGF信号在区分脊髓前角胆碱能运动神经元和少突胶质细胞中的作用。但是调控这些部位特异神经前体细胞逐渐分化为特定类型的神经元或胶质细胞的具体分子机制在很大程度上仍不清楚。由于此阶段细胞分化多为各细胞类型的混合体，因此，我们将通过单细胞mRNA-Sequencing 的方法，比较各细胞类型及同一类型的不同阶段，从而理清部位特异神经前体细胞分化为特定类型神经元和胶质细胞的具体信号和转录因子网络。
理清多潜能神经前体细胞终末分化过程中的信号网络和转录因子网络后，我们将进而研究如何根据这些分子网络建立有效靶向某特定类型神经元或胶质细胞的分化方法；研究将星型胶质细胞转分化为特定类型神经元或少突胶质细胞的可能性。同样通过和胚胎标本结合或通过比较人类系统及小鼠系统，研究人类早期神经系统胚胎发育及人类进化过程中的保守性和特异性。
4．多能干细胞神经定向分化调控网络在中枢神经系统疾病中的转化应用
在中枢神经系统疾病中，部分疾病是由于某一特定类型神经细胞变性或异常所引起。例如癫痫症是由于某一局灶神经元过度放电，进而引起某脑区异常放电所引起；帕金森氏病是由于中脑黑质多巴胺神经元变性所引起；老年痴呆是首先引起前脑胆碱能神经元变性所致；SMA、ALS等是由于基因突变而导致的脊髓前角运动神经元变性死亡所引起；脱髓鞘病变是少突胶质细胞异常所引起。对于这
些疾病，细胞移植或替代治疗可能是最理想的选择，即我们可以通过移植抑制性中间神经元调整局灶神经元过度放电，通过移植健康的前脑胆碱能神经元、
脊髓前角运动神经元或少突胶质细胞替代病变的细胞进而达到治疗癫痫症、老年痴呆、脊髓损伤和脱髓鞘病的目的。
实现细胞移植和替代治疗最关键的一环就是如何获得纯度较高的有功能的细胞。ES细胞和iPS细胞作为目前最成熟的多能干细胞，可以被用来定向分化为各种组织细胞类型，包括神经细胞类型。然而定向分化的关键是我们能深刻理解分化各阶段调控各特定细胞类型生成的信号网络和转录因子网络，从而实现定向分化的精确调控。同时我们还需要探讨其它获得特定细胞类型的方法，例如去分化和转分化。在课题4，我们将就这一目标进行研究。根据课题1，2，3阐明的有关各阶段神经定向分化的分子机制，课题4将和其他3 个课题团结协作，通过和材料科学结合，研究如何建立多能干细胞神经定向分化为特定神经细胞类型的高效实用的技术方法；探索将星型胶质细胞直接编程为部位特异神经前体细胞或特定类型神经元以及少突胶质细胞的方法。体外建立癫痫症细胞模型，研究GABA抑制性中间神经元共培养对海马原代培养神经元癫痫样放电的抑制作用；通过mu p75-SAP人工祛除隔区前脑胆碱能神经元，观测其对小鼠空间学习记忆以及新联系形成的影响，将人多能干细胞定向分化而来的前脑胆碱能神经元移植入小鼠双侧海马，观测其对小鼠空间学习记忆以及新联系形成的恢复作用。在人和小鼠调控机制相对保守的前提下，将诱导星型胶质细胞直接编程的信号分子和转录因子导入小鼠海马，观察原位重编程的效果和对小鼠学习记忆的恢复作用；将通过神经定向分化而来的脊髓前角胆碱能运动神经元或经过将胶质细胞直接重编程而来的脊髓前角胆碱能运动神经元和C2C12肌肉细胞共培养，分析神经肌肉突触的形成和功能，同时以前脑的胆碱能神经元作为对照研究细胞类型的特异性；将通过神经定向分化而来的少突胶质细胞或经过将星型胶质细胞直接重编程而来的少突胶质细胞移植入Shiverer/SCID小鼠的侧脑室，电镜观察外源少突胶质细胞在体内环境中形成髓鞘的能力。
二、预期目标
本项目通过对人类多能干细胞进行神经定向分化，从而得到神经外胚层细胞、各部位特异性多潜能神经前体细胞、以及特定类型神经元和少突胶质细胞。通过对神经细胞和非神经细胞或不同种类的神经细胞进行横向比较；对各分化发育阶段神经细胞进行纵向比较，进而研究这些细胞中基因表达谱的差异，提炼出神经定向分化各阶段细胞命运决定的关键分子调控网络，包括信号网络和转录因子网络。对这些网络的深入研究将有助于建立高效的、安全的、可控的特定神经细胞定向分化方法；有助于建立将星型胶质细胞去分化为特定神经前体细胞的重编程方法，星型胶质细胞转分化为特定神经元或少突胶质细胞的直接重编程方法；通过对这些分化、去分化或转分化而来的特定类型神经元和少突胶质细胞进行体外功能的检测和体内功能的检测，进而通过细胞培养模型或动物模型实验，研究其潜在的治疗前景。通过和早期胚胎标本结合，将体外神经分化和体内胚胎发育挂钩，利用体外模型模拟体内胚胎发育过程，或通过神经发育异常的胚胎标本，分析分子网络异常对早期胚胎发育的影响；同时通过比较人类和小鼠在早期分化发育过程中的保守性和特异性，分析人脑区别于其他动物的本质属性。
五年预期目标：
1.揭示多能干细胞神经定向分化过程中各分化发育阶段细胞命运决定的分子
调控网络，主要是决定信号和转录决定因子；
2.利用神经分化过程中的关键信号和关键因子，建立高效可控的特定神经细胞
分化方法，建立星型胶质细胞去分化为特定神经前体细胞的重编程方法，星型胶质细胞转分化为特定神经元或少突胶质细胞的直接重编程方法；
3.通过分化、去分化、转分化而得到GABA抑制性中间神经元、前脑胆碱能神
经元、脊髓前角胆碱能运动神经元和少突胶质细胞，体内体外验证这些细胞的活性、生理功能及应用前景；
4.以前脑胆碱能神经元为例，研究其在治疗老年痴呆中的转化应用，包括建立
原位直接重编程的技术体系；
5.和临床结合，收集早期人工流产和病理性流产早期胚胎标本，建立正常和异
常早期胚胎冰冻切片标本库；比较体外神经分化和早期的胚胎标本，揭示人类早期神经发育过程中的分子机制；
6.比较人类和小鼠神经分化发育过程中的保守性和特异性，从进化的角度研究
人类区别于其他动物的本质特征；
7.预期该项目完成时有多于60-80篇的研究论文发表在高水平的国际学术刊物
上，其中影响因子大于5的30-50篇，影响因子大于10的10-20篇；申请专利5-10项；
8.培养博士后10-15人，博士研究生30-50人，培养和壮大国内干细胞及转化
医学的研究队伍。
三、研究方案
（一）研究方案
项目研究采用多学科交叉，多课题组合作的方式进行。其中课题1、课题2和课题3 互为提供信息、细胞及实验材料。通过课题1、课题2和课题3的紧密协作，并通过一系列的生物信息学分析，提炼出可能的调控各阶段神经细胞定向分化的关键调控网络。通过化学和基因干预，研究这些包括信号和转录因子网络在内的分子调控机制在各阶段神经细胞定向分化中的作用；通过结合胚胎标本，研究这些调控网络在体内胚胎发育过程中的作用及这些调控网路异常对早期胚胎发育的影响；通过比较人类和小鼠在神经分化发育上的异同，研究人类神经系统发育过程中的保守性及人脑区别于其他动物的本质特征。课题4在其他3个课题的基础上，研究如何基于这些调控网络，通过分化、去分化或转分化方法，获得特定类型的神经元或少突胶质细胞；并在体内及体外研究这些细胞的功能活性，及在相关中枢神经系统疾病中的应用前景。
具体研究方案如下：
图1：项目总体研究方案和技术路线
课题一神经外胚层细胞命运决定的分子网络研究
1．人类多能干细胞（包括人类和小鼠ES细胞）的获得
主要利用华东干细胞库已有的人类ES和小鼠ES细胞系的资源，以及国际常用的人类ES细胞系H1和H9，小鼠ES细胞系D3。
2．人多能干细胞神经定向分化
多能干细胞神经定向分化将贯穿于所有的四个课题之中，我们在此一并阐述。将人类多能干细胞悬浮培养4天以促进多能干细胞向三胚层分化，进而将之转移到无血清培养液使其分化为神经上皮细胞。在此阶段加入促进区域化的因子（变形素，如Wnt、SHH、RA、BMP），细胞将被区域化为部位特异性神经前体细胞。神经前体细胞再悬浮培养后形成神经球（Neurosphere），神经球被种植到培养表面后即分化为神经元或胶质细胞。神经球按分化发育的先后具有不同的潜能，从早期到后期分别产生投射神经元、中间神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
根据重要基因表达的特征分析分化得到的神经细胞的部位特征：前脑背侧，FoxG1、Pax6、Emx1、Tbr1；前脑腹侧，FoxG1、pan-Dlx、Nkx2.1、Gsh2、Lhx6、Lhx7/8；脊髓背侧，HoxB4、Pax6、Dbx2；脊髓腹侧，HoxB4、Nkx2.2、Nkx6.1。
根据重要基因表达的特征分析分化得到的神经细胞的分化发育阶段特征：神经上皮细胞，Pax6+/Sox2+/Dach1+/Six3+/Sox1-；神经前体细胞，Sox1、Sox2；星型胶质细胞前体细胞，S100β、CXCR4；少突胶质细胞前体细胞，Olig2、Sox10、Nkx2.2；神经元，βIII-tubulin、MAP2；星型胶质细胞，GFAP；少突胶质细胞，O4、MBP。
根据细胞形态分析神经细胞类型：早期神经上皮细胞呈柱状或长梭形；稍晚期神经上皮细胞及早期神经前体细胞排列成蔷薇花状类似于神经管样的结构；悬浮培养的神经前体细胞和胶质前体细胞形成神经球；大部分神经元有一根长的轴突和很多短的树突，而成熟的胶质细胞往往有很多短的突起。
另外，从细胞的功能上来讲，多能干细胞在体外能分化为外胚层、中胚层和
内胚层细胞，在体内能形成畸胎瘤。神经外胚层细胞不能分化为中胚层和内胚层细胞，但能被变形素区域化为各部位神经前体细胞。部位特异性的神经前体细胞不能再被变形素重新区域化，而只能分化为特定部位的神经元和胶质细胞。神经元最为关键的是它的电活动特征，即动作电位和兴奋性/抑制性突触后膜电流；星形胶质细胞可以促进神经元的存活、突起的生长、突触的形成; 少突胶质细胞可以形成髓鞘。
3. 横向和纵向基因表达谱分析
将人类ES细胞通过GSK3β抑制剂Bio及血清或BMP分化为中胚层-内胚层细胞。通过细胞组织化学或流式细胞分析检查细胞纯度（Nanog、Pax6、T、FoxG1等），在纯度超过95%的情况下进行下一步的基因表达谱分析。通过mRNA-Sequencing，横向比较中胚层-内胚层细胞及相同人类ES细胞分化而来的神经外胚层细胞；纵向比较ES细胞、神经外胚层细胞和多潜能神经前体细胞（课题1，2，3互通信息和共享资源）。通过Ingenuity IPA 软件分析信号转导通路及转录因子网络。通过mRNA-Sequencing分析，还将获得有关转录剪切、启动子选择及MicroRNA相关信息。
4. 化学或基因干预信号和转录网络对神经外胚层细胞分化的影响
细胞外信号：研究给予外源Wnt、BMP、Notch、EGF、FGF、PDGF等细胞外信号，或通过其特异性抑制剂（SU5402、PD98059等）对多能干细胞分化为神经外胚层细胞的影响；通过过表达或通过siRNA剔除β-catenin, SMAD1等下游信号效应分子，研究这些信号对神经外胚层细胞分化的影响；通过基因突变屏蔽β-catenin, SMAD1等下游信号效应分子的磷酸化位点，或改变其进出核信号，从而调控信号效应分子的翻译后修饰或细胞内定位，进一步研究各信号通路调控神经外胚层细胞分化的分子机制。
转录因子：我们的前期工作发现了Pax6在人类神经外胚层细胞分化中的关键作用。通过我们初步的基因表达分析，我们还发现了一些其他转录因子也在神经外胚层细胞中高表达，如Six3、Six6、LMO3等。我们将进一步通过过表达或siRNA剔除的方法研究其他转录因子在人神经外胚层细胞分化中的作用；观察Pax6和其他转录因子之间的相互关系；以及这些转录因子和细胞外信号的相互关系。通过这些研究建立一个完整的调控神经外胚层细胞分化的信号和转录因子
网络。
5．研究人为提供信号和转录网络能否靶向多能干细胞到神经外胚层细胞或逆转神经前体细胞为神经外胚层细胞
将ES细胞置于稳定维持的培养环境或中胚层-内胚层细胞分化的环境，观察人为提供神经外胚层细胞分化相关的信号和转录网络对ES细胞稳定维持或中胚层-内胚层细胞分化的影响；神经外胚层细胞区域化为部位特异神经前体细胞后将失去对区域化因子起反应的能力，因此，我们将观察人为提供神经外胚层细胞相关的信号和转录网络能否将神经前体细胞逆转为神经外胚层细胞，从而恢复其对区域化因子反应的能力，进而被区域化为其他的神经前体细胞。
6.通过正常和异常的早期胚胎标本验证体内胚胎发育过程中调控各神经细胞
分化的相关分子网络
该部分内容同样将贯穿于课题1，2，3之中，并在此一并阐述。在通过伦理学审查，获得病人及家属同意，并保护病人隐私的前体下，收集正常人工流产和病理性流产的早期胚胎标本（20天-3个月），固定后行冰冻切片，根据胚胎发育阶段（Carnegie Stage）建库并实行资源共享。对病理性流产标本，获取父方和母方血液样本冻存，以及在可能的情况下保留部分固定前胚胎标本，以便日后进行遗传学分析。
首先在正常的胚胎标本中，通过免疫组织化学的方法验证各信号或转录因子网络在各神经细胞类型中的激活和表达情况，研究体外神经分化和体内胚胎发育在分子网络上是否一致。其次，挑选中枢神经系统发育异常的胚胎标本，研究神经细胞发育异常是由哪些信号和转录网络异常引起的，并通过遗传学分析，寻找发病原因。
7.比较人类和小鼠在神经系统发育过程中的差异
在研究清楚了人类神经外胚层分化发育相关信号和转录因子网络后，在小鼠ES细胞或小鼠胚胎中，研究人类和小鼠在神经外胚层发育上是否保守。我们的
前期工作已经证明了一些不一致的地方，在课题1，我们将就信号和其它转录因子网络作进一步验证。同样在课题2和课题3当中，我们也将比较在神经外胚层细胞区域化为部位特异神经前体细胞，以及神经前体细胞最终分化为特定类型神经元或胶质细胞的过程中，人类和小鼠在分子调控机制上的差异。
图2：课题一技术路线
课题二神经外胚层细胞头-尾侧化和背-腹侧化为神经前体细胞的调控网络研究
1.基因表达谱的横向和纵向比较
在没有任何区域化因子作用的情况下，人类神经外胚层细胞将分化为前脑背侧神经前体细胞；而500 ng/ml SHH处理一周，神经外胚层细胞将几乎全部被腹侧化为前脑腹侧MGE神经前体细胞；1 mM RA处理一周，将尾侧化为脊髓背侧神经前体细胞，而如果同时加入100 ng/ml SHH，将获得脊髓腹侧神经前体细胞。通过对这四类不同部位的神经前体细胞进行mRNA-Sequencing，并经生物信息学分析，提取各神经前体细胞的部位特征性调控网络及各神经前体细胞的共性特征。除了横向比较外，还可以通过课题1，2，3的团结合作，对神经外胚层细胞、各部位特异性神经前提细胞、神经元或胶质细胞进行纵向比较，提炼出有关多潜能神经前体细胞特定发育阶段的调控网络。
2.部位特征调控网络在神经外胚层细胞区域化中的作用
主要研究各区域化因子是如何调控部位特征转录因子的；通过染色体免疫沉淀（ChIP）研究信号效应分子（Gli、β-catenin、Smad等）在部位特征转录因子（Pax6、Nkx2.1、HoxB4、Nkx2.2、Olig2等）启动子区的结合；通过报告基因研究其对基因表达的调控；利用相似的方法研究各部位特征转录因子之间的相互调控。研究化学或基因干预部位相关调控信号和转录因子对神经外胚层细胞区域化的影响；过表达或siRNA剔除部位相关转录因子是否能使神经前体细胞沿头-尾轴或背-腹轴发生转换；人为提供部位相关调控网络是否能提高神经外胚层细胞区域化为部位特异神经前体细胞的同步性和效率。
3.阶段特征调控网络在神经外胚层细胞区域化中的作用
研究siRNA剔除阶段相关转录因子能否使神经外胚层细胞稳定维持；研究过表达阶段相关转录因子或激活神经前体细胞关联信号能否直接靶向神经外胚层细胞为神经前体细胞。
4.人为导入部位或阶段特征网络能否逆转星型胶质细胞为部位特征性神经前
体细胞
将人类ES细胞分化为星型胶质细胞，检测GFAP、Ki67以确定细胞类型，以及确定其中不混杂有前体细胞。或者获得外科脑手术过程中病理送检后剩余的新鲜脑组织，通过原代培养获得星型胶质细胞，同样通过检测GFAP、Ki67以确定细胞类型。将部位特征转录因子、阶段特征转录因子或同时将部位和阶段相关转录因子通过慢病毒tet-on诱导表达系统过表达在星型胶质细胞中，在给予相应信号的条件下，观察这些调控网络能否逆转星型胶质细胞为部位特异的神经前体细胞。同时观察在关闭这些转录因子的情况下，逆转而来的神经前体细胞是否能分化为相关类型的神经元或少突胶质细胞。
在人类和小鼠调控网络相对保守的前提下，研究分子调控网络是否能体外将小鼠星型胶质细胞去分化为特定类型神经前体细胞。将GFAP-Cre小鼠和ROSA-loxp-stop-loxp-GFP小鼠杂交，从而带双转基因的子代小鼠（GFAP-Cre/ROSA-GFP）的所有GFAP阳性细胞及其衍生细胞均被标记绿色荧光。对成年GFAP-Cre/ROSA-GFP小鼠的星型胶质细胞进行原代培养，Sox1、Sox2、Ki67、phospho-H3免疫荧光鉴定无神经前体细胞污染。通过慢病毒tet-on诱导表达系统过表达神经前体细胞相关基因。在给予相应信号的条件下，观察细胞形态、部位特征基因表达、分化发育阶段特征基因表达。对去分化而来的神经前体细胞进行分化潜能的检测（撤除过表达的转录因子）。
图3：课题二技术路线图
课题三功能性和区域特异性神经元生成和胶质细胞生成的调控网络研究
1.单细胞mRNA测序
前脑腹侧MGE神经前体细胞继续分化为GABA能抑制性中间神经元（GAD+）和前脑胆碱能神经元（CHAT+）；脊髓腹侧Olig2+神经前体细胞继续分化为脊髓前角胆碱能运动神经元（HB9+）和少突胶质细胞（PDGFRα+）。由于目前对神经前体细胞是如何分化为不同类型神经元和胶质细胞的具体机制尚不清楚，因而分化的产物经常是多种细胞类型的混合体。因此在课题三中，我们将利用单细胞mRNA测序技术，进而区分神经前体细胞分化为特定类型神经元或少突胶质细胞的分子调控网络。具体讲，通过SOLiD? 2.0系统将单个细胞mRNA逆转录为cDNA，再通过加尾、PCR等步骤变成双链cDNA, 扩增并建库。然后通过SOLiD?3 PLUS System 测序，并行生物信息学分析。
2.神经生成和胶质细胞生成的分子调控机制
通过单细胞测序技术及相应的生物信息学分析，提炼出神经前体细胞分化为GABA能抑制性中间神经元、前脑胆碱能神经元、脊髓前角胆碱能运动神经元和少突胶质细胞相关的信号和转录网络。通过化学和基因干预相关信号和转录因子网络，研究这些调控网络在各型神经元和少突胶质细胞分化中的作用；研究人为提供相关信号或转录网络是否能有效靶向神经前体细胞分化为特定类型的神经元或少突胶质细胞，从而提高神经定向分化的效率。
3.特定神经元亚型的生成机制
前脑MGE神经前体细胞和脊髓腹侧Olig2+神经前体细胞都能分化为胆碱能神经元。我们除了可以在课题4研究这两类神经元在体内外功能上的差异外，还可以通过比较这两类神经元在分化过程中的调控网络，分析是否存在共同的调控通路以靶向神经前体细胞为相同类型神经递质的神经元。
4.人为提供信号和转录网络能否转分化星型胶质细胞为特定类型的神经元或
少突胶质细胞