细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成 免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。因此在一定意义 上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。 第一节 造血干细胞的特性和分化 一、造血干细胞的起源和表面标记 （一）造血干细胞的起源 哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以 及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺 是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。 早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell）， 具有自我更新（self?renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予 机体在整个生命过程中始终保持造血能力。多能造血干细胞最初分化为共同淋巴 样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。 （二）造血干细胞的表面标记 白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。 （1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达 CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单 克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。随着造血干细胞的分 化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。 （2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原 癌基因c?kit的编码产物Kit。CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70% CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。 （3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细 胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免
动物骨髓干细胞细胞分离液试验方法 货号：P8600 规格：200mL 保存：常温保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 产品内容： 名称规格 动物骨髓干细胞分离液200mL 匀浆冲洗液200mL 样本稀释液200mL 清洗液200mL 洗涤液200mL 无菌硅化离心管5支 实验前准备： 1、适用仪器 最大离心力可达1200g的水平转子离心机 骨髓单细胞悬液的制备： 1.以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。 2.用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液冲洗出内腔中的骨髓。 3.收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以70μm细胞筛网（随试剂盒附赠5个）过滤。 4.450g，离心10min，弃上清。 5.用样本稀释液重悬细胞浓度为2×108-1×109/ml的单细胞悬液备用（以小鼠为例，一般使用1ml样本稀释液重悬骨髓细胞）。 检验方法： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。 1.取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。
2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5-10ml洗涤液，混匀细胞。 5.400g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 差异贴壁法纯化细胞： （1）用干细胞无血清培养基或干细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。 （2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。
第一章绪论 第一节细胞生物学研究的内容与现状 一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。 研究的主要任务是以细胞作为生命活动的基本单位为出发点，探索生命活动基本规律，阐明生物生命活动的基本规律，阐明细胞生命活动的结构基础。 细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、代谢、运动、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等重大生命过程。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。 细胞生物学研究的课题归纳起来包括3个根本性的问题： 1.基因组是如何在时间与空间上有序表达的？ 2.基因表达的产物是如何逐级组装成能行使生命活动的基本结构体系及各种细胞器的？这种自组装过程的调控顺序与调控机制是什么？ 3.基因及其表达的产物，特别是各种信号分子与活性因子，是如何调节诸如细胞的增殖、分化、衰老与凋亡等细胞最重要的生命活动过程的？ 二、细胞生物学的主要研究内容 1、生物膜与细胞器的研究 2、细胞信号转导的研究 3、细胞骨架体系的研究 4、细胞核、染色体以及基因表达的研究 5、细胞增殖及其调控 6、细胞分化及干细胞生物学 7、细胞凋亡 8、细胞衰老 9、细胞工程 10、细胞的起源与进化 第二节细胞学与细胞生物学发展简史 一、生物科学发展的三个阶段: 1.形态描述生物学时期，19世纪以前； 2.实验生物学时期，20世纪前半世纪； 3.精细定性与定量的现代生物学时期，20世纪50-60年代至今。 二、细胞生物学发展简史 1. 细胞的发现 英国学者胡克，1665年第一次描述植物细胞的构造。 荷兰学者列文虎克观察了动植物活细胞与原生动物 2. 细胞学说的建立其意义 Matthias Jacob Schleiden（1804~1881)，德国植物学教授，1838年发表“植物发生论”(Beitr?ge zur Phytogenesis)，认为无论怎样复杂的植物都有形形色色的细胞构成。 Theodor Schwann（1810~1882)，德国解剖学教授，一开始就研究Schleiden的细胞形成学说，并于1838年提出了“细胞学说”（Cell Theory)这个术语；1939年发表了“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
壹、計畫說明 長期以來造血幹細胞捐贈的傳統觀念中，認為骨髓捐贈是「抽龍骨水」，以至於願意捐贈造血幹細胞的民眾並不多，然而，骨髓捐贈並非抽龍骨水，而現在更有一種新的捐贈方式－週邊血幹細胞捐贈，是多數民眾所不知。台灣每年仍有約300位血癌患者需要尋找非親屬捐贈者，在血液病患日漸增加的情況下，我們更需要持續不斷推廣捐贈造血幹細胞的正確認知，讓民眾在正確的認知下，重新思考捐贈造血幹細胞的意義。 為推動造血幹細胞捐贈，希望透過宣導進而達到提升捐贈率的效果，並藉此將辦理「因為有愛-微電影創意影片」之徵選活動，向民眾徵求創意，吸引更多人加入捐贈行列。 貳、報名資格 一、一般民眾、不限年齡。(歡迎學校及社團踴躍參加) 二、個人或組隊報名均可，一組最多五人。 三、為符合公平原則，已獲得國內外獎項之作品，均不得參賽，違者取消參賽 資格。 四、不拘任何表現方式，發揮創意用5分鐘以內影片投稿參賽。 五、參賽作品不得使用非法取得下載之音樂、影像或影片片段。參賽者若有抵 觸任何著作權之法律，一切法律責任由參賽者承擔。 六、參賽者之作品如涉及智慧財產權者，主辦機關取得全部權利。 七、本活動之參賽作品，無論入選與否，一經送件即視為同意本活動評審所有 規則，並同意授權主辦單位得自行運用相關業務範圍內，對所有參賽作品 之公開發表、公開展示、公開播放、影像及圖文宣導、攝影、重製、改作、 編輯、印製、散布、出版、網頁製作、下載傳輸等相關非商業行為之用途， 日後不得有異議。且不另支付稿費及版稅，參賽者無異議亦不另行索取費 用。
參、徵件期間： 一、報名收件日期：即日起至6月30日止。以郵戳為憑，逾期恕不受理。 二、初審結果公佈：102年7月15日(一) 三、網路投票期間：102年8月1日～8月31日 請上「骨髓幹細胞中心Facebook粉絲團」投票 四、決審：102年9月 五、公布優勝結果：102年9月 六、頒獎典禮：102年本中心週年慶活動(預計9月) 七、成績公佈：公布於活動網站及慈濟骨髓幹細胞中心網站 肆、創作主題 須與造血幹細胞捐贈方式緊密連結，且畫面上需呈現自行設計的標語。 伍、作品規格： 一、類型：不限(劇情片、紀錄片、動畫短片皆可) 二、相關規格： 1.片長：嚴格規範5分鐘以內(包含片頭與片尾) 2.拍攝工具：不限 3.影片格式：像素至少720(W)x480(H)的avi/mov/mpg格式。 4.輸出格式：mpeg格式 5.參賽影片畫面大小至少720x480，最大不得超過1,920x1,080。 6.請將原始影片格式及輸出之mpeg格式，以數位檔案存於隨身碟中或以 CD/DVD-R片燒錄轉檔成之作品繳交。 7.提交作品不予退還，未符合作品競賽規格者不另行通知與退件。
骨髓间充质干细胞的主要表面标志 1 骨髓间充质干细胞的发现和来源 骨髓组织中有多种细胞成分，除基质细胞等已经分化的细胞外，还含有两类多潜能干细胞：造血干细胞和间充质干细胞。1987 年Friedenstein 等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下可分化为多种类型的细胞，而且经过20－30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞, 故称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs),或间质祖细胞(MPCs)，是成人多能干细胞的一类。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)，或骨髓基质成纤维细胞(Marrow stromal fibroblast，MSF)。Friedenstein AJ , Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow o steogenic stem cells: in vit ro cult ivat ion and t ransp lantat ion in diffusion chambers. Cell T issue Kinet, 1987, 20 (3) : 263-267] 2 鉴于其强大的增殖能力及多向分化潜能，可在体外长期培养和遗传背景较稳定，而且用自体干细胞诱导构建的组织不涉及伦理问题，也不存在MHC限制，所以骨髓间充质干细胞日益受到重视。但是与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs的数量非常少，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少。因此，如何简便有效地从骨髓中获取高纯度的MSCs显得尤为重要，寻找高度特异性的MSCs的表面抗原也就成为MSCs研究中的一项重要任务和目标。 不仅如此，一种同样来源于骨髓、贴壁生长、被认为更原始（可以分化为MSCs）也具有更强增殖能力的干细胞也被鉴定，它就是多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell (MAPC) or mesodermal progenitor cell(MPC)）[Reyes, M., Lund, T., Leuvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., Verfaillie, C.M. (2001) Purification and in vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98, 2615-2625]，因能和MSCs一起被纯化而统称BM stromal stem cell。 3 利用流式细胞仪的研究显示,MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①
在20世纪末和21世纪初干细胞的研究取得了突破性进展,主要进展包括两个方面:一是成功建立了可以分化为人体任何组织类型的成熟细胞的人类胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)系,这是干细胞研究的重大里程碑和生命科学的重大技术突破[1];二是发现成人各种组织中均有未分化成熟的干细胞分布,这类干细胞的基本功能是在生理条件下更新正常衰老死亡的细胞,维护组织或器官的结构完整和正常功能,而在组织损伤等病理条件下可动员、增殖和分化为成熟的功能细胞,修复损伤[2]。传统认为,特定组织中的干细胞只能向它所存在组织类型的成熟细胞分化,而这一观点目前受到挑战。许多研究结果证明,一种组织中的干细胞不但可以分化为它所在组织类型的成熟细胞,而且在特定的条件下或移植到其他组织中,还可以被诱导分化为其它无关组织类型的成熟细胞,有的还可打破胚层限制,分化为不同胚层的成熟细胞[3,4]。比如骨髓组织中的干细胞不但可分化为各种血液细胞,还可分化为脑神经细胞,脑组织中的干细胞可以分化为神经细胞,移植到受致死量放射线照射的小鼠骨髓组织中,也可以重建造血免疫功能。最近还有人从骨髓、神经等组织获得具有与ES细胞特性相似的成体干细胞,这类细胞可以在特定条件下分化为三个胚层的多种类型的成熟细胞。成人体内的干细胞虽然数量稀少,但由于其可塑性强,取材容易,可实现自体化治疗,避免了ES细胞或异体细胞治疗的免疫排斥、伦理和未知病源感染等问题。干细胞的研究进展极大地促进了生命科学研究和生物技术产业的发展,同时也预示着一些目前难以治愈的疾病可能由于干细胞的研究与应用而得到有效治疗,因此在最近几年受到相关研究者和社会各阶层的广泛重视。 1干细胞研究技术的新进展 干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞,是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞,形成任何类型的组织和器官,以实现机体内部建构和自我康复能力。根据细胞的发育阶段,干细胞可分为来源于早期胚胎的胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESCs)和存在于成人各组织中的成体干细胞(adultstemcell,ASCs)。人类ESCs可来源于桑椹球细胞、囊胚内细胞团或拟胚体细胞等[5,6],还有发现从流产胎儿生殖脊分离获得的生殖原基细胞(embryonicgermcell,EGCs)和从畸胎瘤组织分离获得的多能干细胞也具有与ESCs类似的生物学特性,即具备分化为成人所有组织类型的成熟细胞的潜能[7,8]。1998年,美国科学家从人囊胚内细胞群分离培养胚胎干细胞(embryonicStemCells)并建立细胞系,与此同时,美国的另一研究小组从妊娠5~9周的胎儿生殖脊组织中也分离获得胚胎干细胞样细胞,此后,科学家从畸胎瘤组织、成人骨髓、胎盘,甚至外周血中均分离获得胚胎干细胞样细胞,这些进展为人类认识和利用干细胞前进了一大步[9,10]。当受精卵分裂发育成囊胚时,将内细胞团(innercellmass)分离出来进行培养,在一定条件下,这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代,同时还保持其全能性,因此被称为胚胎干细胞。胚胎干细胞在培养条件下,若加入白血病抑制因子LIF(leukaemiainhibitoryfactor),则能保持在未分化状态,若去掉LIF,胚胎干细胞迅速分化,最终产生多种细胞系,如肌肉细胞、血细胞、神经细胞或发育成“胚胎体”。 1997年,英国科学家利用核移植技术已发育成熟的体细胞移植到去核卵母细胞中,在体外条件下成功将成体细胞的发育时钟拨回到最原始状态,然后启动其发育和分化机制,再历经了像天然受精卵发育那样的胚胎干细胞的发育和分化,胚胎形成和组织器官的发育,最终诞生一个新的生命体,表明成体细胞在合适的条件下可以返老还童,关键在于如何创造这种适于细胞返老还童的条件和土壤。依据上述原理,科学家怀疑成人组织细胞的更新与修复可能源于其中存在具有多向分化潜能的干细胞或逆向分化机制,于是对成体干细胞进行了深入研究。1999年,美国科学家MargarelGoodell发现小鼠肌肉组织干细胞可以“横向分化”(transdifferentiation,转分化)成血液细胞,这一发现很快被世界各地的科学家证实,并且发现其他组织来源的人成体干细胞同样具有“横向分化”的功能[11,12]。现在已证明人的骨髓干细胞可以分化为肝脏细胞、肌肉细胞、神经细胞等。这种横向分化具有相当的普遍性,
1、什么是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)? 人体大部分骨头的中央部门有骨腔,骨腔内所含的物质即骨髓.骨髓中有一种能起着造血功能的细胞就叫造血干细胞.人血中的红细胞,血小板,淋巴细胞,粒细胞等,都是由它经过多次分化发育而成的. 2、什么是造血干细胞移植? 造血干细胞移植是指他人骨髓中的造血干细胞移植到人体内,平时所说的”骨髓移植”实际上就是造血干细胞移植. 3、造血干细胞移植能治疗哪些疾病? 利用造血干细胞移植治疗的疾病很多.可治疗肿瘤性疾病,如:白血病,某些恶性实体瘤等,以及非肿瘤性疾病,如:再生障碍性贫血,重症免疫缺陷病,急性放射病,地中海贫血等.目前,对造血干细胞的研究又有一些新突破,如对重症天疱疮严重并发症(双侧股骨头无菌性坏死)以及生症肌无力等疾病的患者治疗. 4、什么是HLA,它在造血干细胞移植中的作用是什么? HLA即人类白细胞抗原,存在于人体的各种有核细胞表面.它是人体生物学”身份证”,由父母遗传,能识别”自己”和非已”,从而保持个体完整性.因而HLA在造血干细胞移植的成败中起着重要作用,造血干细胞移植要求捐献者和接受移植者HLA配型. 5、兄弟姐妹的HLA相合率是多少?非血缘关系的捐献者中与患者的HLA相合率是多少? 同卵(同基因)双生兄弟姐妹为100%,非同卵(异基因)双生或亲生兄弟姐妹是1/4. 人类非血缘关系的HLA型别中,相合几率是四百分之一到万分之一,在较为罕见的HLA型别中,相合几率只有几十万分之一.由于独生子女家庭的普遍性,高相合率人群减少,今后移植主要在非血缘关系供者中寻找相合者. 6、为什么要建立中国造血干细胞捐献者资料库? 我国需要造血干细胞移植的患者有数百万人,仅白血病患者每年就新增4万人以上,要成功地进行造血干细胞移植治疗,捐献者与患者之间的HLA型别要相合.如果不合,移植后就会产生严重的移植物抗宿主反应,甚至危及患者生命.因此,必须建立中国人的造血干细胞捐献者资料库,并且是参加的志愿者越多,库容量越大,患者找到相合捐献者的机会就越多,”生机”就越大. 7、中国造血干细胞捐献者资料库是什么机构?
?３８２?．，ｏｌｌｍｄｚｏｆＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｒｎｅｎｔａｔＭｅｄｉｃｉｎｅＶｄ．９，Ｎｏ．５Ｍａｒ．２０１０骨髓干细胞治疗心脏病的研究与进展 龚怡综述雷长城’审校（南华大学附属第二医院湖南衡阳４２１０００）【关键词】骨髓干细胞心血管疾病移植 各种心脏病发展到晚期大多导致心力衰竭，心力衰竭严重影响着心脏病患者的预后及生活质量。而常规治疗手段效果有限，骨髓干细胞的临床研究越来越多。现就骨髓干细胞的分类、作用机制、途径、存在的问题及前景等作简要介绍。 １研究背景及现状 冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿性心脏病、扩张型心肌病等各种原因所致的心肌损伤发展到晚期大多伴有心腔扩大和舒缩能力下降，虽然成熟的心肌细胞不是终末分化细胞，但由于其增殖、分裂能力有限，新生成的心肌细胞远远无法修复坏死的心肌，具有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对或绝对减少，受损心肌细胞由纤维组织瘢痕修复，未受损的心肌细胞代偿肥大，造成心肌功能收缩功能下降，最终导致心力衰竭。目前常规的治疗手段只能缓解心衰症状，不能修复死亡或濒死的心肌。心肌细胞在出生后已失去增殖能力或增殖能力极低，因此增加具有完整舒缩功能的心肌细胞数目，是改善心功能的关键。细胞移植是一个切实可行的增加成体心肌细胞的方法，骨髓干细胞在体外有良好增殖能力，能在心肌内环境下分化为损伤组织所需要的心肌细胞，且无移植后的免疫排斥反应，因此在心肌损伤的治疗中备受关注。Ｓｏｏｎｐａａ等¨１首先尝试了心肌细胞移植，初步证实了心肌细胞移植的可行性。他们将小鼠胚胎心肌细胞移植到正常小鼠心脏中，发现移植的心肌细胞能够存活并与受体心肌细胞产生闰盘连接。随后，各种干细胞用于心脏病治疗。干细胞移植成为心力衰竭治疗的一种新尝试。德国和香港两个研究小组曾利用心肌梗死患者自身骨髓干细胞修复其受损伤的心脏取得成功。另据报道，美国、德国、中国研究人员利用骨髓干细胞、或自体骨髓干细胞治疗心脏病或心肌梗死患者均取得重要进展。与此同时，在巴西有利用心脏病患者自体骨髓十细胞或血液干细胞注射到患者右心室，能促使新心肌和血管的形成，使患者得到治愈。 ２干细胞概况 干细胞（ｂｏｎｅｍＢ＿ｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）是一类具有多向分化潜能的细胞，主要分为胚胎干细胞（ＥＳＣ）和成体干细胞两大类。干细胞具有以下几点主要的细胞生物学特性：①具有自我更新及自我维持的能力。②具有多项分化的潜能，可以分化成心肌细胞、脂肪细胞和软骨细胞等。③干细胞的分裂能力可维持相当长的时间， ?通讯作者有的可持续终生。④具有生理性的更新能力。⑤干细胞的自我更新和分化需要特定的微环境，这个微环境能够提供一些因子维持干细胞的未分化状态，并能将诱导干细胞分化的因子排斥在外。 ２．１胚胎干细胞胚胎干细胞是～种源于早期胚胎组织（４～５ｄ）并能被诱导生成机体各种类型的细胞，具有自我更新能力的多能干细胞。有研究表明，将胚胎干细胞移植到梗死心肌后，７一１２周可形成稳定的心肌结构，明显改善血液动力学，促使梗死区新生血管生成∞１但胚胎干细胞移植应用于临床还存在很多问题，比如胚胎干细胞免疫原性引起的免疫反应，移植带来的社会、伦理、法律、道德等问题。 ２．２成体干细胞成体干细胞是未分化的细胞出现在已分化的特定组织中，能够自我更新产生由其来源的所有特定组织。目前用于移植的成体干细胞主要是骨髓干细胞（ＢＭＳＣ）。骨髓干细胞包括造血干细胞（ＨＳＣｓ）、间质干细胞（ＭＳＣｓ）和血管内皮祖细胞（ＥＰＣｓ）三大类细胞群。不同于胚胎干细胞，患者可将自身的骨髓干细胞用于移植治疗，从而避免了伦理方面的问题，由于它属于自身组织，也降低了免疫排斥反应的可能性。２．２．１造血干细胞造血干细胞是骨髓中发现最早的干细胞群。早在上个世纪５０年代，临床就用骨髓移植的方法来治疗血液系统疾病。在此后相当长的时间里，人们一直认为造血干细胞只能分化成血细胞，但近几年的研究结果显示并非如此。Ｌａｇａｓｓｅ等Ｈｏ发现纯化后的造血干细胞在体内可分化为肝上皮实质细胞。Ｏｒｌｉｅ等【５１发现包含肝星状细胞（ＨＳＣ）的¨ｎ—ｅ—ｋｉｔ＋细胞群在大鼠体内可以转化成心肌细胞，而不含ＨＳＣ的Ｌｉｎ—ｅ—ｋｉｔ＋细胞群则不能形成新生的心肌组织。这一结果表明骨髓造血干细胞可分化成心肌细胞。 ２．２．２骨髓间充质干细胞１９６８年Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等在分离大鼠骨髓成骨细胞时，首次从骨髓基质中鉴定出一种非造血系成体多能干细胞，并证实这类细胞在体外能分化成各种间质细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等，甚至能横向分化为神经细胞和神经胶质细胞，因此称之为ＭＳＣｓｏＭＳＣｓ是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，能实现自我更新和诱导分化。体外培养细胞呈贴壁生长特性；典型细胞集落呈放射状排列。免疫学检查ＭＳＣｓ不表达ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤｌ４等造血细胞的标记；而表达为ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤｇＯ、ＣＤｌ０５、ＣＤｌ６６等。骨髓中ＭＳＣｓ含量很低，一般为０．００ｌ％一 万方数据
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植