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33通讯作者,E 2mail :chunlongyang @https://www.doczj.com/doc/8710846195.html, 收稿日期:2004206202,修回日期:2004209225
家蝇抗菌肽的研究与应用
3
罗金香 杨春龙33
吴伟东
(南京农业大学理学院 南京 210095)
Study and application of Musca domestica antimicrobial peptides .LUO Jin 2X iang ,Y ANG Chun 2Long ,W U Wei 2D ong (College o f Sciences ,Nanjing Agricultural Univer sity ,Nanjing 210095,China )
Abstract In recent years ,the antimicrobial active substances and especially antimicrobial peptide of houseflies were investigated extensively.The antimicrobial peptides could exhibit biological activities against bacteria ,fungi ,cancer cells and viruses.By the treatment with acupuncture ,acupuncture carrying bacteria ,heat shock ,ultras onic vibration ,radioactive ray ,high frequency electromagnetism or physiological saline etc.,this peptide could be induced into houseflies.The antimicrobial peptide could exist stably in -20～100℃,in the s olution of extreme pH value ,or in the s olution of concentrated saline.The structure ,m ode of action and m olecular biology of antimicrobial peptides of houseflies were summarized ,and the application prospect was discussed.K ey w ords housefly ,antimicrobial peptide ,antimicrobial active substance
摘 要 近年来,对家蝇Musca domestica 体内外抗菌活性物质的研究受到人们广泛的关注,其中研究较多的是抗菌肽。家蝇抗菌肽对细菌、真菌、肿瘤癌细胞和病毒等具有生物活性,可通过针刺、带菌针刺、超声波、放射性射线、高频电磁场和生理盐水等方法诱导增量产生,能耐极端的温度和pH 值的溶液,在高浓度盐溶液中也很稳定。文章还对家蝇抗菌肽的结构特点、作用机理与分子生物学研究做了概述,同时对家蝇抗菌肽的应用前景进行了讨论。关键词 家蝇,抗菌肽,抗菌活性物质
家蝇Musca domestica隶属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科。体内外通常携带有害因子数量多达数万亿,能够机械传播人、畜多种病原体如细菌、病毒和寄生虫卵等[1,2],而自身并不感病。即使在人工大规模高密度饲养的条件下,也不会发生集体染病,这是缘于家蝇体内外抗菌活性物质的作用。这些抗菌活性物质包括血淋巴受体外异物刺激而增加表达量的抗菌肽、凝集素,幼虫排放到体外有生物活性的分泌物,表皮中的几丁质,也有存在于其他组织器官或代谢产生的粪产碱菌、有机化合物和尿囊素。多种抗菌活性物质构成了家蝇特殊免疫防御机制,使其能够长期稳定维持家蝇生存而免受细菌、真菌、病毒、肿瘤癌细胞和寄生虫等侵染。在当前有害生物易产生抗药性,而新型抗菌药物开发又非常困难的情况下,许多专家将注意力转向家蝇这种独特的昆虫资源[3]。至今研究最多的是家蝇抗菌肽,内容主要涉及其生物活性、诱导产生方法、作用机制和分子生物学等。研究的最终目的在于开发出新一代高效、无毒副作用和作用机制独特的抗菌药物。
1 家蝇抗菌肽的生物活性
有关学者已在地中海实蝇Ceratitis capitata[4]、果蝇Drosophila melanogaster[5]和厩赦蝇Stonzoxys poregrinn[6]中分离到具有不同生物活性的抗菌肽。在棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina和伏蝇Phormia terranovae体内分离到了sarcotoxinⅠ[7]、Ⅱ[8]、Ⅲ[9]和diptericin[10]等具有抗菌活性的蛋白。而在家蝇血淋巴中既分离到了分子量较小的生物活性肽Π蛋白,又分离到分子量较大的凝集素溶菌酶等多种抗菌肽。这些抗菌肽抗细菌、真菌、寄生虫,更引人注目的是它们还能杀伤多种肿瘤癌细胞和病毒,而对正常的体细胞无毒副作用。抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,如金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌等。还抗植物细菌性病害如水稻白叶枯病菌,大白菜软腐病菌和引起人类疾病的痢疾杆菌、肺炎杆菌。对一些真菌如白念珠菌和白僵菌也有很好的生物活性,也对令人畏惧的肿瘤癌细胞有活性。邱晓燕等分离到分子量为4kDa和916kDa的抗菌肽,较低浓度下能有效抑制人胃癌细胞MG C802 3和BG C2823、人乳腺癌细胞MCF27以及人肺癌细胞SPC2A21的体外增殖[11]。还抑制病毒侵染和繁殖,陈艳等用蝇蛆组织匀浆液处理流感病毒表现出非常好的防效[12]。这些抗菌肽活性浓度在μgΠm L级,其抑菌效果与传统抗生素相当甚至超过之。有报道表明苍蝇抗菌肽的抗菌活性超过了青霉素[13],与目前广泛使用的抗生素及农用杀菌剂不产生交互抗性,不诱导病原菌产生抗性突变,因此有望开发成为新一代优秀抗癌、抗病毒或抗病菌药物。
2 家蝇血淋巴抗菌肽的诱导产生
当家蝇处于不适宜的环境条件或体壁受损伤、受异物侵染时,血淋巴中受基因控制的活性物质表达量会显著增加。目前已经成功地使用不同的诱导方法对不同虫态进行诱导并获得抗菌物质的增量表达和新蛋白的激活产生[14,15,54]。周永富等采用针刺损伤法诱导家蝇3龄幼虫,除原有抗菌蛋白的表达获得增强外,还激活了新蛋白的产生,这种新蛋白可能也有抗菌活性[16]。盛长忠等采用针刺、带菌针刺、超声波均成功地诱导家蝇蛹产生了抗革兰氏阴性球菌(大肠杆菌,变形杆菌)的抗菌肽[17]。陈留存等采用大肠杆菌诱导家蝇成虫并从血淋巴分离提取出一种对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌)和阴性菌(绿脓假单胞菌、大肠杆菌)都有活性的抗菌肽C M2Ⅲ[18]。用于家蝇血淋巴诱导的诱导源很多,如物理因子:超声波、高频电磁场、γ射线、X射线、紫外线、热激、体壁损伤法等;生物因子:菌类(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)及生理盐水等。在诸多诱导方法中,体壁损伤法既经济、方便,效果又好。不同诱导源诱导产生的抗菌物质抗菌谱有所差异,并发现经菌类诱导产生的抗菌物质似乎有免疫记忆现象。齐静姣等以60C oγ射线、活的大肠杆菌、热灭活的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和生理盐水为诱导源,结果表明细菌诱导的抗菌谱
较广,60C oγ诱导的抗菌谱较窄,经热灭活的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌对相应菌的抗性较其它菌强[19]。家蝇血淋巴抗菌物质动力学研究表明,不同诱导源诱导产生最大活性高峰各有一个最佳诱导强度和时间[19]。诱导强度低,效果不明显,强度大会致虫体死亡,一般诱导后36～48h出现活性物质表达量高峰[20]。从家蝇血淋巴抗菌物质诱导的研究可以推测诱导抗菌物质基因的表达似乎是在接受了第一信使的刺激后,有一个共同的第二信使,它再将不同信号传递给细胞核内染色体上,从而激活相应基因启动和表达[21]。诱导机理研究对揭示家蝇防御机制具有重要意义,是寻找高活性抗菌肽的基础。
3 抗菌肽的分类、结构特点和理化性质
自1981年Steiner等从惜古比天蚕滞育蛹中分离到抗菌肽天蚕素(cecropin)并测定其多肽化学结构以来[22],已从昆虫中分离出170多种抗菌肽[23],根据其结构和功能不同可分为5类[24,53]:天蚕素类,具有2个两性的α螺旋结构,分子量在4kDa左右,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有抗性[25]。昆虫防御素类,含有半胱氨酸且形成二硫键,具有α螺旋和β折叠结构,分子量为4kDa,对革兰氏阳性菌有生物活性[26,27]。富含脯氨酸的抗菌肽,分子量为2～4kDa,抗革兰氏阴性菌[24]。富含甘氨酸的抗菌肽,分子量为10～30kDa,对革兰氏阴性菌有活性[28]。家蝇抗菌肽属于以上类型的有M D L2 3,推测属于的有M D L21,不能完全肯定的有M D L22[29]。
人们已从家蝇血淋巴分离到多种活性抗菌肽,它们的分子量在4～86kDa,由51～111个氨基酸组成,不含甲硫氨酸,不含或含少量半胱氨酸,不形成二硫键,富含碱性氨基酸,等电点大于7。在生理条件下,柏鸣等对家蝇抗菌肽进行圆二色分析,其二级结构构像单元以无规卷曲(包括β-转角)为主,2616%α螺旋, 2317%β折叠,4917%β转角与无规卷曲[30]。家蝇抗菌肽的三级空间结构还在进一步研究之
中。
家蝇抗菌肽有较稳定的理化性质,能耐极端温度,经-20℃冷冻或100℃沸水浴处理后,抗菌肽的生物活性变化不大,还耐高浓度盐溶液、较极端的pH溶液。抗菌肽水溶性好,呈碱性。
4 家蝇抗菌肽的作用机理
家蝇抗菌肽之所以不易产生抗药性,在于其独特的作用机理。当前,家蝇抗菌肽抗真菌和病毒的作用机理还不十分清楚,有待进一步研究,而对细菌和肿瘤细胞的作用机理研究得相对较多。一般认为是通过破坏细菌的细胞膜而杀伤细菌,细菌有外膜和内膜2种膜系。外膜富含带负电荷的脂多糖,内膜为质膜。通过静电引力抗菌肽首先与细菌外膜结合,然后与内膜作用,扰乱膜脂分子的排列,改变细胞膜通透性,在细胞膜上形成许多孔道,使细胞内的原生质扩散,并从孔道向胞外渗漏,最终导致细胞完全解体,起到抑菌杀菌作用[31,32]。文彩虹等研究表明抗菌肽能引起肝癌细胞S M MC27721膜通透性增高,抑制能量代谢,抑制分裂增殖[33]。
5 家蝇抗菌肽分子生物学
昆虫防御系统中存在一系列抗菌肽,每一种抗菌肽都有自己特定的抗菌谱,它们合力作用几乎可以抵抗所有的感染源[34],如果蝇防御系统中至少存在7种不同的抗菌肽[35]。家蝇血淋巴防御系统也是如此。目前已对家蝇不同抗菌肽基因采用不同策略和技术路线进行了克隆。夏平安等构建了家蝇基因组文库,从诱导的蝇蛆体内提取基因组DNA,采用Bell随机酶切,回收10～23kb目的DNA片段,经匹配与磷酸化的E M BL3BamHI酶切载体臂连接,在体外包装成活的重组噬菌体,转染K W
251宿主菌,文库效价5×104pfuΠm L,成功地构建了家蝇基因组文库[36],为后续分子杂交筛选和鉴定重组λDNA,最终得到目的基因打下了基础[37]。王来元等首先构建了家蝇cDNA文库,从诱导的家
蝇体内提取总RNA,分离到mRNA,然后进行cDNA的合成、重组,构建了完整、有效的cDNA 文库,滴度3146×105pfuΠm L,重组率9916%,为下一步家蝇抗菌肽基因的cDNA克隆奠定了基础[38]。王来城等以家蝇cDNA文库为模板,采用PCR扩增出防御素基因片段,再进一步扩增3′和5′端序列,得到全长430bp的cDNA序列,其中开放阅读框可以编码92个氨基酸残基的短肽[39]。分析表明家蝇防御素成熟肽由40个氨基酸残基组成,推测其二级结构由3部分组成,即N端的loop、1个α螺旋和2个反向平行的β片层。为进一步重组表达提供了重要的基因源。家蝇抗菌肽对原核生物细胞具有广谱的毒杀作用而对真核细胞毒性较小,缘于两者的细胞膜结构不同。为寻找到高效的表达载体,许小霞等以G enBank中报道的家蝇天蚕素基因为模板设计引物,运用反转录聚合酶链式反应从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素的开放阅读框,分析其成熟肽,重新合成1对引物,并在碳端突变和酰胺化,再利用半嵌套式PCR扩增出其成熟肽,然后与酵母表达载体pPICZnA重组构建高效表达质粒[40]。下一步的表达和抗菌肽的纯化还在进一步研究之中,有望通过基因工程途径开发出高效的家蝇抗菌肽产品。
6 家蝇抗菌肽的应用前景
家蝇抗菌肽具有分子量小,受温度影响小,水溶性好,无免疫原性,广谱的生物活性等特点,可以抑杀多种细菌、真菌、病毒,更令人兴奋的是还能杀伤多种肿瘤细胞,但不损伤正常的体细胞,无毒副作用。因此它可以被广泛用于农业、医药、食品等领域。农业方面,采用分子生物学和基因工程的方法将家蝇抗菌肽基因导入动、植物体内获得优良的抗病品系并在其种内遗传,降低成本,增加收入。东京大学药学部教授名取俊二从苍蝇蛹中分离出一种由39个氨基酸组成的抗菌肽,并将其基因进行克隆成功地导入烟草,获得抗野火病菌的烟草品系[41]。将抗菌肽基因表达于真核细胞,获得大量抗菌肽,进行构效关系研究并进行分子设计,筛选出高活性抗菌肽,然后可以通过基因工程大量生产。医药方面,由于其抗菌谱广,还具有抗肿瘤等重要药用价值,不损伤人体正常细胞,与传统阻断生物大分子合成的抗生素具有不同作用机理,且不易产生抗药性,在目前抗生素抗药性问题非常突出,而开发新型抗生素又非常困难的情况下,家蝇抗菌肽有望开发成为新一代肽类抗生素。如已有应用基因工程技术开发的具有抗病功能的高新技术保健品工程蝇抗菌肽问世[42]。还可通过基因工程方法将家蝇抗菌肽基因导入肿瘤癌细胞,对癌症基因治疗提供帮助。家蝇抗菌肽对人体无毒副作用,也可以作为绿色食品添加剂。当然,抗菌肽在家蝇体内含量少,分离和纯化比较困难,体外易被蛋白酶水解,要得到大量能用于生产实践的抗菌肽还需要作出更多的研究和努力,如抗菌肽抗菌谱广,需要用基因工程获得大量抗菌肽,需稳定的表达载体;抗菌肽富含碱性氨基酸易被蛋白酶水解,急需研究其构效关系,进行分子设计,结构修饰,提高稳定性,增加活性。
值得指出的是,人们还从家蝇体内外提取到其它抗菌活性成分。如张文吉等从家蝇幼虫饲料残渣中提取出抗植物病害活性物质[43,44]。陈美等从家蝇幼虫饲料残渣中提取出抗植物线虫活性物质[45]。苏水莲等从家蝇蛆表皮和蛹壳中提取出几丁质,发现对植物生长发育具有调节作用[46];几丁质也具有直接杀菌、抑菌作用[47];还可以诱导植物合成植物保护素,增强植物抗病虫的能力[48]。曹小红等从家蝇蛹中提取出具有抑菌和抗癌作用的凝集素[49],丁友真等从家蝇幼虫体内分离出对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等致病菌有很强抑制作用存在于消化道内的粪产碱菌,并揭示了家蝇蛆粉治疗疮伤的机理[50]。K aren等用甲醇从家蝇末龄幼虫体内提取具有抗真菌和细菌活性物质12 LPE,分子量为45112Da[51]。苍蝇体内蛋白质代谢还可产生尿囊素,而尿囊素具有杀菌作用,可医治皮肤伤口,防止恶性化脓[52]。家蝇体内外具有多种抗菌物质是其在杂菌横生的环境中得以生存的重要物质基础。目前,对血淋巴抗
菌肽研究得比较深入,对家蝇体内外其他活性物质的研究还处于探索阶段,对家蝇抗菌活性物质的进一步研究具有十分重要的理论意义和应用价值。
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一、抗菌肽概念 抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸数目小于100，常带正电荷，并具广谱抗菌性的一类小肽，是生物体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成成分,与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统,这类生物活性小分子是非专一性的免疫应答产物,具有广谱抗菌作用,它对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用,还可以抗原虫、病毒,杀伤动物体内的肿瘤细胞,却不破坏动物体内的正常细胞。抗菌肽抗菌时一般没有特殊受体，直接通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，因而不会诱导抗药株的产生，它属于小分子多肽，在动物体内容易降解，并且无毒副作用及药物残留问题，因而是绿色环保型药物。抗菌肽具有广谱的抗菌性，包括抗革兰氏阴性菌(G -)和阳性菌(G +)、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等尤其对耐药性细菌有杀灭作用。 二、抗菌肽分类 抗菌肽在自然界分布广泛，来源不一，种类繁多，分类也多种多样。抗菌肽除了具有广谱抗菌、抗真菌、抗病毒功能外，还具有抑制一些肿 瘤细胞生长的作用。（一）根据抗菌肽的结构分类 根据抗菌肽的结构可将其分为五 类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽。(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽。(3)含1个二硫键的抗菌多肽。(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽。(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。 （二）根据抗菌肽的来源分 类 根据来源分类可分为4类： (1)昆虫抗菌肽包括天蚕素类和昆虫防御素。天蚕素是从美洲天蚕的蛹中分离到的抗菌多肽。此后，人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中分离到了此类多肽抗生素。第1种昆虫防御素(M-asturyama)于1988年在一种双翅目昆虫肉蝇中发现,至今昆虫纲中已有15大类30多种防御素被报道。杀菌肽类对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。（2）植物源抗菌肽是植物自身合成的能够防御环境中微生物侵害的一类小分子多肽。包括硫素、 植物防御素、脂转移蛋白、橡胶蛋白类、打结素类、凤仙花素、蜕皮素等。(3)鱼类抗菌肽是鱼体天然免疫的重要组成部分，是一类小分子蛋白质，其结构与组成复杂多样。鱼类抗菌肤的分布范围相对比较广，在鱼类体表黏液、皮肤、鳃、血液、血清、小肠和肝脏组织等均有过分离得到抗菌肽的报道。成熟肽具有很强的抑菌活性，其最小抑制浓度多在毫摩尔水平。(4)哺乳动物中，抗菌肽在吞噬细胞和黏膜上皮细胞表达。主要有3类，分别是防御素、cathelicidins 和histatins。 三、抗菌肽作用机制 抗菌肽的结构影响其生物学活性，因为抗菌肽存在着多种结构所以其生物学活性也多种多样。 （一）抗菌肽的抗菌作用 抗 菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等常见细菌都有很强的杀灭作用。 国内外已报道至少有113种以上的不同细菌能被抗菌肽所杀灭。目前对于其作用机制并不是很清晰，国内外学者对此研究很多,但在认 抗菌肽研究及进展 王 涛，常维山 （山东农业大学动物科技学院预防兽医系，山东泰安 271018） 胺一类药物时, 以间隔8 h 为佳。 2.中毒时注意停药和补充饮水。出现中毒时，应立即停药，并给予充足的饮水，在饮水中加0.50%～1.00%的碳酸氢钠或5%的葡萄糖液。中毒严重的鸡可肌注V B121～2μg 或叶酸50～100μg。 3.产蛋鸡禁用。蛋鸡如果用了此类药物，此药物就会与碳酸酐酶 结合，使其降低活性，从而使碳酸盐的形成和分泌物减少，使鸡产软蛋和薄壳蛋。从而影响产蛋量。 4.配伍禁忌。磺胺类药物忌与酸性药物(如维生素C、氯化钙等) 配伍,用药期间,禁用普鲁卡因等含对氨苯甲酸的制剂。不能与拉沙菌素、莫能菌素、盐霉素配伍 5.肾受损伤及3周龄以内的雏 鸡应慎用。磺胺类药物体内代谢主要在肝脏中进行, 而出壳不久的雏鸡肝脏中的代谢酶系统不健全, 解毒功能低,容易发生中毒。 6．勿在免疫接种时使用。畜禽在接种活菌疫苗时，不能同时使用磺胺类药物，否则会导致免疫效果差甚至失效。■
抗菌肽（antimicrobial peptide）：抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。 1分类：结构分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成 的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。 来源分类可将其分为6类：（1）昆虫抗菌肽（2）哺乳动物抗菌肽（3）两栖动物抗菌肽（4）鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽（5）植物抗菌肽（6）细菌抗菌 2效应：抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用。 3作用机制：一般认为抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象， 造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。 4.抗菌肽对细菌的杀伤作用 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。 5.预防败血症：天然抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。败血症是由细菌感染引起的，伴随有全身性炎症反应综合症状的一种危重疾病。病原微生物感染诱导促炎症因子大量释放，导致多种重要器官衰竭，具有较高死亡率。 6.总结：抗菌肽要成为药物，还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源 有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽必须解决的问题。其次，与传统抗生素相比，昆虫抗菌肽的抗菌活性还不够理想。改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是创造高活力抗菌肽的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据
一、概述 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌队是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibactetial pepiides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之 为”peptide antibiotics”一多肽抗生素。 二、抗菌肽的理化性质、作用机理和作用范围 天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。 抗菌肽功能从目前的研究结果来看，一般认为抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，亦有学者提出抗菌肽是否存在特异性的膜受休及有无其它因子的协同作用等问题。不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。 抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。 1. 抗菌肽对细菌的杀伤作用 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113 种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。
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鱼类抗菌肽的研究进展 作者：江丽娜， 赵瑞利， 雷连成， 王教玉， 韩文瑜 作者单位：江丽娜,赵瑞利,雷连成,韩文瑜(吉林大学畜牧兽医学院)， 王教玉(吉林省水产技术推广总站) 刊名： 中国水产 英文刊名：CHINA FISHERIES 年，卷(期)：2008(5) 本文读者也读过(8条) 1.张书剑.Zhang Shujian几种鱼类抗菌肽的研究进展[期刊论文]-饲料研究2007(12) 2.李华.杨桂文.温武军鱼类抗菌肽研究概况[期刊论文]-科技信息2010(2) 3.黄平.章怀云.HUANG Ping.ZHANG Huai-yun鱼类抗菌肽研究进展[期刊论文]-中南林业科技大学学报2009,29(2) 4.杨学明.江林源.蒋和生.YANG Xue-ming.JIANG Lin-yuan.JIANG He-sheng水生动物抗菌肽及其基因工程研究[期刊论文]-生物技术通讯2006,17(1) 5.王克坚.林志勇.杨明.任洪林.黄文树.周红玲.邓尚龙.陈君慧.蔡灵.蔡晶晶海水养殖鱼类抗菌肽hepcidin基因的研究进展[会议论文]-2005 6.王小玲.尹建文.Wang Xiaolin.Yin Jianwen鱼类的先天性抗菌和抗病毒机制[期刊论文]-现代渔业信息2006,21(7) 7.叶星.白俊杰抗菌肽的研究及其在水产上的应用前景[期刊论文]-大连水产学院学报2000,15(4) 8.单晓枫.郭伟生.张洪波.钱爱东鱼类体液中的几种抗菌因子研究进展[期刊论文]-河南农业科学2010(5) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/8710846195.html,/Periodical_zhongguosc200805040.aspx
目录 第1章文献综述 (1) 1.1 家蝇及其危害 (1) 1.2 昆虫抗菌肽的研究进展 (1) 1.3 家蝇抗菌肽的研究进展 (2) 1.3.1 抗菌肽的鉴定和提取 (2) 1.3.2 抗菌肽构型上的研究 (3) 1.4 研究展望 (3) 第2章实验材料和方法 (5) 2.1 实验材料 (5) 2.1.1 昆虫来源 (5) 2.1.2 实验试剂 (5) 2.1.3 实验菌种 (5) 2.2 实验方法 (6) 2.2.1 总RNA提取和反转录 (6) 2.2.2 muscin和domesticin基因cDNA序列的克隆 (6) 2.2.3 muscin和domesticin基因序列的生物信息学分析 (7) 2.2.4 家蝇幼虫各组织中muscin和domesticin基因表达量分析 (7) 2.2.5 数据统计与分析 (7) 2.2.6 免疫诱导后家蝇muscin和domesticin基因表达量分析 (7) 2.2.7 Muscin和Domesticin成熟肽合成 (8) 2.2.8 Muscin和Domesticin合成肽的抑菌活性测定 (8) 2.2.9 c-Muscin和Domesticin合成肽的溶血活性测定 (8) 第3章实验结果 (10) 3.1 家蝇抗菌肽Muscin的克隆及功能分析 (10) 3.1.1 家蝇muscin基因cDNA序列及分析 (10) 3.1.2家蝇幼虫组织中muscin基因表达量分析 (11)
3.1.3 免疫诱导后muscin基因表达量分析 (12) 3.1.4 Muscin合成肽的纯度检测 (12) 3.1.5 Muscin合成肽的抑菌实验结果 (13) 3.1.6 c-Muscin合成肽溶血实验结果 (14) 3.2 家蝇抗菌肽Domesticin的克隆及功能分析 (15) 3.2.1 家蝇domesticin基因cDNA序列及分析 (15) 3.2.2 家蝇幼虫组织domesticin基因的表达分析 (17) 3.2.3 免疫诱导后domesticin基因表达量分析 (18) 3.2.4 Domesticin合成肽的纯度检测 (18) 3.2.5 Domesticin合成肽的抑菌实验结果 (19) 3.2.6 Domesticin合成肽溶血实验结果 (20) 第4章讨论 (21) 结论 (24) 参考文献 (25) 致谢 (30) 攻读学位期间取得的科研成果 (31)
抗菌肽的临床应用及应用前景 4.1 抗菌肽的作用范围 抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。 4.1.1 抗菌肽对细菌的杀伤作用 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。 4.1.2 抗菌肽对真菌的杀伤作用 最先发现具有抗真菌作用的抗菌肽是从两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素（Magainins），它不仅作用于C+、C-，对真菌及原虫亦有杀伤作用。Defensins 是一种动物细胞内源性杀菌多肽，是从吞噬细胞中分离出来的，具有很宽的抗菌谱，对G+的杀伤作用大于对G-的杀伤作用，它也作用于真菌和部分真核细胞。Cecropin A及其类似物如天蚕素——蜂毒素杂合肽对感染昆虫的真菌具有一定的杀伤作用。 4.1.3 抗菌肽对原虫的杀伤作用 抗菌肽Magainins对原虫有杀伤作用。实验证明抗菌肽可以杀死草履虫、变形虫和四膜虫。柞蚕抗菌肽D对阴道毛滴虫亦有杀伤作用。 4.1.4 抗菌肽对病毒的杀伤作用 Melitiin和Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖。Magainin-2及合成肽Modelin1 和Moderln－5对疱疹病毒HSV－1和HSV－2有一定的抑制效果。这些肽对病毒被膜直接起作用，而不是抑制病毒DNA的复制或基因表达。
4.1.5 抗菌肽对癌细胞的杀伤作用 抗菌肽对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞无不良影响，但对癌细胞株则有明显杀伤作用。这种选择性机理可能与细胞骨架有关。已有有关抗菌肽对宫颈癌细胞、直肠癌细胞及肝癌细胞的杀伤作用与剂量相关的效应的报道。 4.2 抗菌肽的临床应用 4.2.1 在医药领域 …此处省略,详情请见六鉴网(https://www.doczj.com/doc/8710846195.html,)《抗菌肽市场调研报告》 4.2.2 在转基因领域 天然抗菌肽由于分子量小，直接从动植物组织中提取时，分离提纯存在一定的困难，合成肽价格昂贵。因此将抗菌肽基因利用基因工程转化进微生物表达系统或导入动植物体内，不仅可获得量丰的抗菌肽，而且为改造物种获得优良抗病品种提供了有效途径。 4.2.2.1 转抗菌肽基因动物 转抗菌肽基因昆虫：DURVASULA等成功地获得一个转天蚕素A基因共生菌。此天蚕素A转入昆虫长红猎蝽(Rhodniusprolixus)中。昆虫携带了此转基因的共生菌后，感染昆虫的锥虫数量明显减少或消失。 转抗菌肽基因鼠：REED等将Shiva1a基因与小鼠IL- 2基因的5c端从- 593到+110区域以及SV40的多聚腺苷酸，剪接信号肽基因片段一起以微注射法转入小鼠中，结果表明转基因鼠对布鲁氏杆菌病抵抗力明显增加，而且这个重组基因对其他哺乳动物也同样起作用。 转抗菌肽基因蚊子：在Cecropin B基础上构建成杂合肽Shiva-3，以蚊肠道特异性胰蛋白酶基因5c端区域作启动子、融合基因GST-Shiva-3作报告基因构建质粒导入蚊子产生一种转基因蚊。此蚊子肠道内可合成并分泌的融合蛋白GST-Shiva-3
综述与专论 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第3 期 海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在 食品保鲜中的应用 宫晓静 1, 2 吴燕燕 八、、八、、 (1中国水产科学研究院南海水产研究所, 广州510300; 2上海海洋大学, 上海201306 海洋无脊椎动物抗菌肽抑菌广谱, 稳定性高, 且对生物体本身无害, 其应用日益引起大量研究者的关注。综述了抗菌肽的几种类型、抑菌机理, 介绍了海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展、存在的问题并分析其在食品保鲜中的应用前景 关键词: 海洋无脊椎动物抗菌肽 抑菌机理
结构 活性 食品保鲜 Review on Research Progresses and Application in the Food Preservation of Antimicrobial Peptides from Marine Invertebrates Gong Xiaojing 1, Wu Yanyan 1 (1South China Sea Fisheries Research Institute , Chinese Academy of Fishery Sciences , Guangzhou 510300; Shanghai Ocean University , Shanghai , 201306 Abstract :Antimicrobial peptides from marine invertebrates are wide bacteriostatic , high stability and harmless to organism．So their applications have attractedlarge researchers ' attention day．bRyedvaieyws on the several types , mechanism of antimicrobial , the updated research progress , actual problems and the application in the food of antimicrobial peptides from marine invertebrates were elu- cidated． Key words : Antimicrobial peptides from marine invertebrates Bacteriostatic mechanism Structure Activity Food preservation
抗菌肽的研究进展 青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素,对保护人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用,不断产生出诸多新问题。如β-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。于是人们开始寻找新一代抗菌剂。近期的研究发现,某些阳离子型多肽具有广谱的抗菌活性,同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性:不会诱导抗药菌株的产生,有希望成为新一代抗菌剂[1]。抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。研究的内容包括:抗菌肽的分离与纯化,氨基酸序列的分析,蛋白质构型与功能的关系,抗菌肽的作用机理[3,4],应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视[5,6]。目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界,包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用,更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物,尤其对耐药性细菌有杀灭作用,并能选择杀伤肿瘤细胞,抑制乙型肝炎病毒的复制。 1. 抗菌肽的分类迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种,仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据抗菌肽的结构,可将其分为5类:(1)单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由无规则卷曲连接的两段а-螺旋组成的肽。该类包括天蚕素Cecropins, Magainins等。Magainins最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的,它是爪蟾的皮肤在一定的环境压力下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分,由两个紧密相连的肽链组成,每一个肽链有23个氨基酸,低浓度便可抑制许多细菌和真菌生长[7]。(2)富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽。如从猪肠内分离的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一个二硫键的抗菌肽,该二硫键的位置通常在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins[9]。(4)有两个或两个以上二硫键,具有β 折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素(Phormindefensin),分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键,肽链C末段是带有拟β 转角的反向平行的β片层[10]。实验证明,分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。(5)由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。 2. 抗菌肽的作用及机理 2.1抗菌肽的抗菌作用及其机理抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成细菌细胞膜结构破坏,引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上,接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中,最终通过膜内分子间的相互位移,抗菌肽分子聚集形成离子性通道,使细菌失去了膜势而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出
昆虫抗菌肽的分离纯化技术Technical standard for isolation and purification of insect antimicrobial peptides
昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准 1范围 本标准规定了昆虫抗菌肽的分离纯化技术要求，本标准以家蝇作为材料提纯血淋巴的抗菌肽。 本标准适用于以家蝇为材料的抗菌肽分离纯化，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。 本规程规定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS-PAGE电泳、抗菌肽活性测定方法等技术要求。 本规程适用于抗菌肽的快速分离。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。 GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 GB/T6682-2016《分析实验室用水规格和试验方法》 GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 3术语 下列术语和定义适用于本文件： 3.1抗菌肽（antimicrobial peptides） 抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是一种基因编码的、在体内诱导的、具有抗菌活性的碱性多肽物质，强碱性、热稳定性、对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性。某些抗菌肽还具有抑杀肿瘤、中和内毒素、促进伤口愈合、调节免疫等多种生物学功能。 3.2家蝇（Musca domestica） 在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。 3.3多肽（polypeptides） 介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。
抗菌肽的药物开发与临床应用 【摘要】抗菌肽是一种广泛存在于生物界的抵抗病原微生物入侵的小分子多肽，具有抗细菌、真菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞等多种活性，对多种癌细胞及动物实体瘤有明显杀伤作用。并具有抗菌广谱、作用强而迅速，是机体免疫防御的重要组成部分，不易产生耐药等众多优点。随着患者多耐药菌临床感染的日趋加重，抗菌肽成为一类潜力巨大的新型抗感染制剂。 【关键词】抗菌肽；药物开发；临床应用 抗菌肽(antimicmbia1 peptide，AMPs)是生物体防御系统产生的一类小分子多肽，广泛存在于植物、昆虫及哺乳动物中，不仅能够直接抑制和杀灭病原微生物，还具有多种免疫调节活性，在宿主抵抗病原体的侵入中起着非常重要的作用。人类抗菌肽主要包括抗菌素(cathe1icidins)和防御素(defensins)两大家族，具有广谱抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌及有包膜病毒的作用，并对某些耐药菌(如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)也具有杀菌活性[1]。这些抗菌肽除了具有病原体溶解活性以外，还具有抗肿瘤、促进细胞分裂以及作为信号分子的作用，抗生物肽由于分子量较小，具有良好的热稳定性和水溶性，广谱抗菌活性等特点，同时具有与抗生素完全不同的抗菌机理，已成为动植物的基因来源和新型抗菌、抗癌药物研究开发的重要候选者，其研究和应用已越来越成为人们关注的焦点[2]。抗菌肽有望开发成为新一代抗细菌、抗真菌、病毒和抗癌药物，其具有高效的抗菌活性和极低的耐药性。 1抗菌肽的结构特点 1.1抗菌肽的早期发现：早在几个世纪以前,人类就知道蛙皮有药用价值。直到1962年Kiss和Michl在铃蟾皮肤分泌物中发现一些能抗菌而且具血溶性(能破坏正常人体红血细胞)的肽类,并从中分离出由22个氨基酸组成的铃蟾抗菌肽(bombinin),人们才了解蛙皮之所以具有如此大的功效,是由于含有抗菌肽之类的活性物质。1972年,有人从蜜蜂的毒液中分离到蜂毒素(melittin)之后,人们开始对抗菌肽的结构和功能进行了研究。 在植物界中,抗菌肽的发现更早。大约50多年前,人类已从植物中分离到硫素(thionin),实验表明,它们在体外能抑制细菌及真菌的生长,但直到1972年才第一次证实硫素可以杀死许多种病原菌,对植物具有保护功能。 目前,国内外学者已经发现分离了2 000多个抗菌肽。有的种类分布极广,如防御素(defensin)在植物、昆虫及哺乳动物体内都有分布。近年来,还从猪小肠中分离到与抗菌肽相似的肽(cecp)[3]。 1.2抗菌肽的分子结构：抗菌肽是一种小分子多肽,天然的抗菌肽通常由30多个氨基酸残基组成,碱性,含有4个或4个以上带正电荷的氨基酸,N端亲水,C端疏水.水溶性好,分子量约为4KD。大部分抗菌肽具有热稳定性,在100℃加热
抗菌肽 一、抗菌肽概述 抗菌肽是本公司历经数年研发准备，于2013年发布的全新生物动物营养保健产品品牌，致力于从根本上减少人类食物链中抗生素使用，改善食品安全状况，增加饲料价值和养殖回报。 二、抗菌肽研究背景 近年来滥用抗生素引发耐药性病菌产生，又因抗生素残留在肉、奶、蛋中有害于人的健康，加以我国进入WTO以后，欧共体、日本及美国以抗生素超标问题用技术壁垒限制我国动物源产品出口，为此寻求新型饲料添加剂是人们迫切要求解决的问题。 随着传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，许多致病菌几乎对现有的抗生素均产生耐药性，对人类的健康构成了巨大的威胁。寻找真正安全、高效的抗细菌和病毒感染药物已成为人们关注的焦点。抗菌肽及其衍生物以其广谱抗菌、独特的作用机制、无残留无耐药性和绿色安全，成为后抗生素时代的最佳选择，已经在医药、食品、畜牧业、农业等领域显示出广泛的应用前景。 三、抗菌肽 抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。抗菌肽在医药、食品和农业都有广泛应用。抗菌肽用于饲料
添加剂既可以增强动物抵抗力，促进动物生长，同时还减少药物残留，是一种绿色饲料添加剂。 抗菌肽来源于天然抗菌物，具有两亲性α-螺旋和β- 折叠结构，最佳作用分子量分布在5000-10000道尔顿之间，是采用现代生物基因工程技术将设计合成的抗菌肽基因转化于芽孢中表达并分泌到胞外，通过发酵工程生产获得对革兰氏阳性如金黄葡萄球菌，绿脓杆菌有效，对革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌有效又能抑制真菌白色念珠菌及曲霉菌等，抗菌肽能抑制乙型肝炎病毒DNA的增殖，有选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用。本产品易溶于水可直接吸收到体内，对消化酶钝性，对热稳定，100℃水浴30分钟，不影响其杀菌作用。 四、抗菌肽作用机理 1、桶板模型：首先，由于抗菌肽带正电荷，与细胞膜负电荷相互吸引而结合在细胞膜表面；然后，单体的抗菌肽分子形成多聚体，其疏水基团插到磷脂双分子层，以与膜表面垂直的方式排列，形成横跨细胞膜的离子通道，离子通道一旦形成，外界的水分即可渗入细胞内部，细胞质也可渗透到外部，细胞膜崩解而导致细胞死亡。 2地毯模型：与前一种机制相比，抗菌肽并不插人细胞膜内部，同样在电荷作用下，抗菌肽在膜表面的展开，像地毯平行排列在细胞膜表面；在疏水作用和分子张力作用下改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽分子也可通过此孔洞进入细胞。 五、抗茵肽作用机理的特点 1、作用部位的有效性
抗菌肽的研究进展 摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。 关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景 抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。广泛存在于各种生物体内。1980 年，瑞典科学家Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。目前世界上已知的抗菌肽共有1 700余种。由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景。 1 .抗菌肽的结构 1 .1 一级结构 据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种，且一级结构都比较相似，具有以下典型的特征：由20~70多个氨基酸残基组成的肽链，其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C 端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部分则富含脯氨酸，且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的， 1. 2 二级结构 通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，结果表明，抗菌肽在一定条件下形成a-螺旋和β-折叠结构。a-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变a-螺 旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。抗菌肽有许多保守序列,在N端易形成a-螺旋,中间部分易形成β-折叠或铰链。a-螺旋肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽ma g a i n i n 、c a t h e l i n d i a 等，β-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等。 2 抗菌肽的来源 2.1微生物抗菌肽
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.5 综 述 昆虫抗菌肽研究现状 陈留存 王金星 (山东大学生命科学学院生物系 济南 250100) 摘要 近年来鉴定了的化学结构的昆虫抗菌肽的数目有迅速上升的趋势,一些新型昆虫抗菌肽相继被分离纯化。不同结构的抗菌肽其抗菌特性及其抗菌谱存在着巨大差异,抗菌机制也不同。昆虫免疫与动物免疫机制既存在着区别也存在着某些相似性。 关键词 昆虫免疫 抗菌肽 天蚕素 防御素 1 引言 昆虫抗菌肽是昆虫血淋巴中产生的一类小分子肽,当昆虫受到外界微生物的刺激时,可大量迅速地合成。它具有热稳定性强,强碱性,抗菌谱广的特点,可以抗革兰氏阳性菌,也可以抗革兰氏阴性菌,有些甚至对病毒和肿瘤细胞均具有抗性[1]。因此,自从1980年Baman发现第一种抗菌肽——天蚕素(cecropin)以来,许多昆虫抗菌肽相继被分离、纯化,氨基酸一级结构被确定,有些抗菌肽的基因结构也已确定。但80年代人们主要集中研究鳞翅目、鞘翅目等大型经济昆虫,进入90年代以来,除继续研究大型昆虫外,一些小型种类日益引起有关学者的重视,如双翅目、膜翅目、同翅目等,而且除昆虫外,在其他许多无脊椎和某些脊椎动物中也发现了抗菌肽。因此抗菌肽逐渐成为昆虫免疫学及分子生物学的研究热点之一。一些昆虫抗菌肽已有专文论述[2,3],但关于抗菌肽的分类及抗菌机制却很少涉及,本文结合近年来新发现的昆虫抗菌肽,就其结构、性质及抗菌机制分类作一介绍。 2 昆虫抗菌肽的类型 迄今为止,仅在昆虫中发现的抗菌肽已达100多种[4],根据结构及功能的不同可以分为4类,即天蚕素类(cecropins),昆虫防御素(insect defensins),富含脯氨酸(Pro)的抗菌肽(proline-rich peptides),富含甘氨酸(Gly)的抗菌肽(gly sine-rich piptides)。 2.1 天蚕素类(Cecropins) 天蚕素是最早发现的抗菌肽。1980年, Bom an等成功地把天蚕素与天蚕的溶菌酶在生化性质及功能上区分开,同年分离到纯的天蚕素A和B。1981年,Boman与Bennic合作测定了天蚕素A和B的一级结构,随后在柞蚕、肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类似天蚕素的抗菌肽。由表1可以看出,这类抗菌肽分子结构相似,都有31-39个氨基酸残基组成,分子量4kD左右,半胱氨酸(Cys)含量少,不能形成分子内二硫键,有强碱性的N端和缩水性强的C端,在肽的许多特定位置有较保守的残基,如2位的色氨酸(T ry),5、8、9位具1个或1对赖氨酸(Lys),11位具天冬氨酸(Asn),12位具精氨酸(A rg),有些位置尽管残基不同,但仍是保守替换。 1988年,Halak等人利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的三级结构,其分子结构含有两段 -螺旋,N端1-4位4个氨基酸是非螺旋化的,5-21位为第一个 -螺旋,该螺旋中极性与非极性氨基酸含量相当,因此该螺旋对水和脂都具有亲和性,称为双亲的 -螺旋,22-24 55
抗菌肽的概念 抗菌肽（Antibacterial peptide）又叫抗微生物肽（Antimicrobial peptide）、抗生素肽（Antibiotics peptide），是在多种生物体内存在的具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等多种作用的一类活性多肽。1974年，瑞典科学家Boman等人向眉纹天蚕蛾(Samia cynthia)蛹注射阴沟通杆菌及大肠杆菌时，在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质。随后诱导惜古比天蚕(Hyalophra Cecropia)蛹也发现了类似的抗菌活性物质。1981年，这种具有抗菌活性的物质被命名为cecropin，这是人们第一次真正意义上发现抗菌肽。目前科学家已在昆虫、哺乳动物、两栖动物和细菌的体内或分泌物中发现了上千种的抗菌肽。 1．抗菌肽理化特性和结构 抗菌肽一般由10～50 个AA组成，分子量较小，无（弱）免疫原性。富含疏水和碱性aa，所以多数抗菌肽都带正电荷。由于抗菌肽分子量小，大多数抗菌肽只具有二级结构，这就决定了抗菌肽耐高温能力较强，并且在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性。 抗菌肽的二级结构包括（1）α-螺旋结构，如天蚕素（Cecropins），蛙皮素（ Magainins）等。（2）β-折叠型，该类抗菌肽是在分子内有2～6个二硫键的抗菌肽类，有代表性的是动物防御素。β-防御素广泛存在于不同的上皮组织中，可能参与上皮和黏膜的抗感染防御。利用射线晶体衍射研究人嗜中性粒细胞中分离到的防御素(HNP-2)的结构时发现，在晶体状态下，防御素是以二聚体形式存在的。每个单体都有3股反平行的折叠片以二硫键连接，不对称的2个单体分子紧密靠近，并对二次旋转轴对称。（3）伸展性螺旋结构，该类抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸等，由15～34个氨基酸残基组成，在两性分子内部形成分子内α-螺旋，如从蜜蜂体内分离到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33% 和17 %。（4）环链结构，该类抗菌肽在C末端有一个分子内二硫键，在C末端形成一个环链结构，而N末端为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的brevinins和bactenecin。 2 .抗菌肽的分类 目前，抗菌肽的分类还比较复杂，没有统一的标准。本文就对目前大家普遍比较认可的几种分类方式做一概述。 2.1根据抗菌肽对不同病原体的作用分 根据抗菌肽对细菌、真菌及肿瘤细胞的作用不同，可将抗菌肽分为抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽、既抗真菌又抗细菌的抗菌肽、既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等。 2.2根据抗菌肽的结构分 根据其化学组成、二级结构以及功能来划分，Hoffmann1966年将抗菌肽根据空间结构分为线肽和环肽两类，随后Bomalm1998年根据抗菌肽基因研究的成果，将抗菌肽分为四大类[3]，（1）不含半胱氨酸的线肽，包括具有α-螺旋和不具有α-螺旋两类；（2）含等量半胱氨酸的抗菌肽；（3）富含1-2种氨基酸的线肽，最早发现的该类抗菌肽是蜜蜂中的apidaecin，富含脯氨酸和精氨酸；（4）高突变的防御肽。 2.3根据抗菌肽的来源分 : 根据来源可将抗菌肽分为哺乳动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽、病毒抗菌肽等。
抗菌肽 抗菌肽概述 抗菌肽(Antibacterial Peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides),是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞等活性作用的多肽。由于抗生素的广泛使用导致了微生物耐药性,新型抗菌药物研发成为近年研究热点,而抗菌肽是生物天然免疫重要的效应分子,具有调节宿主免疫的作用,所以有极大的临床应用潜力。目前已有2200 多种的抗菌肽,来源有细菌、真菌、人体、昆虫等,其中有些抗菌肽的基因序列已得到测定。抗菌肽具有多种优点,如无毒副作用(仅少数种类具有溶血活性)、无污染、无残留,难以产生耐药性,能抑制癌细胞扩增,调节机体免疫反应、抗炎功能,已经成为近些年来生物学及药学领域研究的热点。 抗菌肽是带有正电荷的、螺旋的、序列较短的具有抑菌作用物质的总称,一般是指从各个生物体包括单细胞生物、植物、昆虫、鱼类、鸟类以及哺乳动物等分离出来的，由12~60个氨基酸残基组成的多肽,分子质量一般小于 10 ku,被认为是先天免疫的重要组成部分,因为其可以抵抗外来微生物的入侵。抗菌肽由于富含疏水基团,通常存在疏水区和亲水区,并且对细胞膜显现出两亲性。目前已经有很多学者从食源性蛋白质中分离出抗菌肽,其中研究最早的是 1966 年从牛乳酪蛋白中分离得到的对多种细菌均具有抑菌作用的 抗菌肽。在 1972 和 1980 年,瑞典科学家Boman 等和 Hultmark 等分别通过诱导眉纹天蚕蛾蛹和惜古比天蚕( Hyalophora cecropia) 发现了类似的具有抑菌活性的物质。而第一个真正意义上的抗菌肽就是由 Boman 命名的天蚕素( cecropins) , 该物质对革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用。此 后各种抗菌物质陆续被发现,其中昆虫和某些非 脊椎动物被广泛研究，迄今为止已发现超过 2 000种天然存在的抗菌肽。 1 抗菌肽的来源 1.1 来源于昆虫的抗菌肽 昆虫家族抗菌肽的一个典型例子就是天蚕素(cecropins),包括天蚕素A、B、C、D、E5 种结构。天蚕素具有广谱抗菌活性,其作用机理是天蚕素抗菌肽分子可以在细菌细胞膜上穿孔后形成离子孔道, 造成细菌细胞膜结构破坏而发挥抑菌作用。它们的分子中不含半胱氨酸,呈线性α- 螺旋结构,对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强活性,并且所有昆虫抗菌肽的 C 端都被酰胺化,这一性质对其广谱抗菌性极为重要。 昆虫抗菌肽的另一大家族是昆虫防御素( insect defensins)。所有昆虫防御素均带一个净的正电荷, 都含有 6 个Cys 并形成 3 个分子内二硫键,呈反平行β-折叠结构。昆虫防御素对革兰氏阴性菌的抗菌活性较弱,且对真核细胞和真菌不起作用,但可以抗革兰氏阳性菌。 除以上两种,还有多种昆虫抗菌肽,如来自蜜蜂的apidaecin 和abaecin,来自天蚕H.cecropia 的attacin A – F,来自家蚕 B.mori 的moricin。 1.2 来源于植物的抗菌肽 自第一种植物抗菌肽(Triticumaestivum)从禾本科植物小麦中被分离出以来,至今已有多种有活性的植物抗菌肽被发现并鉴定,除了硫堇蛋白( Thionins),还有环蛋白、富含甘氨酸的蛋白、snakins 和hevein 状蛋白。硫堇蛋白是一类分子量约5kD、氨基酸残基数45~47、富含半胱氨酸的碱性蛋白。近来研究表明,硫堇蛋白能抑制多种病原细菌(如革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)及真菌的生长。 目前关于防御素的研究是最多的,细胞防御素(Defensin)对许多种细菌有抑制作用,尤其能抑制病原体的增殖。不同种类的植物防御素的一级结构呈多样性,氨基酸组成相差较大,高含量的Cys 形成稳定的二硫键,可能与其生物学特异性功能相关。然而某些抗菌肽,如椰汁中以及石榴种子中富含甘氨酸的肽,只有多个正电荷不含二硫键。目前,已分离的大多数植物
?综述?生物抗菌肽研究进展及应用前景 周义文综述 尹一兵 涂植光审校 【摘要】 生物抗菌肽(antibacterial peptides)广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内,有非特异性抗 细菌、真菌、病毒和肿瘤细胞的作用,又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。抗菌肽是通过其两亲性正 电荷与细菌细胞膜磷脂分子负电荷的静电吸引而结合在细菌膜上,疏水端插入细胞膜中,最终通过膜 内分子间的位移而聚集在一起形成离子通道,使细菌失去膜电势,不能维持正常渗透压而死亡。抗菌 肽杀菌力强,抗菌谱广,不良反应少,将会给临床医学、临床药学、食品防腐、动植物转基因等领域带来 广阔的开发应用前景。 【关键词】 生物抗菌,肽; 抗菌机制; 分子结构 自从青霉素被发现以来,人们对病原菌引起的感染性疾病不再束手无策,特别是β2内酰胺类抗生素的发现,对病原菌感染性疾病的治疗产生了革命性飞跃,抗生素已成为临床治疗病原菌感染的强有力武器。但是,随着抗菌药物的广泛应用和滥用,耐药菌株不断增加,使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。为了应对耐药菌感染,人们一方面对传统抗生素进行结构改造降低细菌的耐药性,另一方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽(antibacte2 rial peptides)就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物,它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽[1,2] ,广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内,除有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用外[3,4],还有抗肿瘤细胞作用,因此又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。抗菌肽抗菌谱广,对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用,甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征(severe acute kespiratory syn2 drome,SARS)病毒的作用。因此有着广阔的开发应用前景,是目前国际学术研究的活跃领域之一。 抗菌肽的分类及功能特征 抗菌肽最早由瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕(hyatophora cecropia)蛹中诱导分离出来,被称为天蚕素(cecropin)。随着人们研究的深入,又陆续发现cecropin A、B、C、D等亚型,并相继在其他昆虫、哺乳动物、两栖动物以及植物中分离到了cecropin类似物。抗菌肽的结构与功能密切相关,来自不同物种的抗菌肽分子结构有一定的差别,因此生物学功能及活性也有一定的差异。其分子构型不论是α2螺旋或是β2折叠,都有一个共同的特性就是都具有两亲性。按分子结构及功能特征可将其分为4类。 11α2螺旋结构类:此类抗菌肽分子量约4kD,不含半胱氨酸,不形成分子内二硫键,N2末端区域富含亲水性碱性氨基酸残基,如赖氨酸和精氨酸,所带正电荷有利于与细菌膜上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附到细菌膜上;C末端含较多的疏水性氨基酸残基,疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。分子的两端各形成一个两亲性α2螺旋,两个α2螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区,这种α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构,当抗菌肽结合到细菌细胞膜上时,α螺旋相互聚集使细胞膜形成孔洞,细胞质外溢而致细菌死亡。若减少抗菌肽的α螺旋,其破坏细胞膜的能力降低,用圆二色谱法研究抗菌肽的高级结构发现,cecropin A的第1～11位氨基酸残基有很强的形成α螺旋倾向。抗菌肽在磷酸盐缓冲液中呈自由卷曲的构象,加入六氟丙醇降低溶液的极性以模拟细胞膜的疏水环境时,抗菌肽的α螺旋数量明显增多,这说明抗菌肽只是在结合或接近细胞膜时才形成发挥功能的高级结构。 天蚕素是α2螺旋结构,广泛存在于昆虫体内,如家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇、伊蚊等,目前已从昆虫体内发现20多种cecropin类似物,如从果蝇分离出的an2 dropin,从麻蝇分离出的sarcotoxinⅠ和Ⅱ等,还有从猪小肠、双卷螺等分离出的cecropin的报道。cecropin 对革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌均具有杀伤力[5]。爪蟾抗菌肽(magainins)也是一类具有两亲性α2螺旋的抗菌肽,存在于蛙的皮肤和胃中。 21伸展性螺旋结构类:该类抗菌肽不含半胱氨酸,但富含脯氨酸和/或精氨酸或色氨酸等,由15～34个氨基酸残基组成,在两性分子内部形成分子内的α螺旋。如从蜜蜂体内分离到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33%和17%。从果蝇分离到的dorsocin在分子结构上与apidaecins具有一定的相似性。昆虫防御素首先从肉蝇(phormia terranovae)中分离得到,当时认为与哺乳动物的防御素具有高度同源性而命名为昆虫防御素(insect defensin)。但研究 作者单位:400016重庆医科大学检验医学系