本科毕业论文
题目：低磷处理对两个基因型燕麦酸性磷酸酶
活性和可溶性糖的影响
学院：生命科学学院
班级：2009级生物工程二班
姓名：白伟
指导教师：李利职称：助教
完成日期：2013年6月1日
低磷处理对两个基因型燕麦酸性磷酸酶活性和可溶性糖的
影响
摘要：燕麦在我国种植非常普遍，一般分为裸燕麦和皮燕麦，它含有较低的糖分，是一种具有较高营养和较高能量的食品。磷是作物生长的重要元素，以不同的方式参与植物酶活力、糖代谢等生理活动。本研究选用这两个燕麦品种，在低磷的条件下，研究了两种不同基因型燕麦对低磷的作出的适应反应。实验结果得出：在低磷条件下处理20 d，比正常的磷供应下相比，燕麦体内的酸性磷酸酶活性有所增加；低磷对两种不同基因型的影响不同，永118的内酸性磷酸酶活性的反应强度明显高于内农莜1号，对低磷忍受的程度较高；低磷条件下，燕麦的地上部和根系的可溶性糖百分含量都有不同程度的增加，而且地上部分糖的百分含量的相对增量较大。
关键字: 燕麦; 低磷处理; 磷酸酶活性;糖分
目录
1引言 (1)
1.1 植物在低磷条件下的状况 (1)
1.2 燕麦的价值研究 (2)
2 材料与方法 (2)
2.1 供试材料 (2)
2.2 实验材料的处理与培养 (2)
2.3 测定指标与方法 (3)
3 结果与分析 (3)
3.1 低磷处理对两个基因型燕麦酸性磷酸酶活性的影响 (3)
3.2 低磷处理对两个基因型燕麦可溶性糖的影响 (6)
4 结论 (7)
参考文献 (9)
致谢 (11)
1引言
燕麦Oats(Avena sativa)，就是中国的莜麦，俗称油麦、玉麦，是一种低糖、高营养、高能食品。燕麦是长日照作物，株高60～120 cm，是一个适应性强，产量较高的世界性栽培作物。燕麦对水分要求较高，在优良栽培条件下，各种土壤都可以得到一个不错的收获，但湿润的土壤富含腐殖质是最好的。燕麦在土壤为酸性的环境中的适应能力比其他类作物较强，在盐碱土栽培效果不佳。现在在燕麦加工方面比较有名的是西麦，一直坚持采用来自四季分明、日照长、昼夜温差大的澳洲西海岸产区的燕麦作为原料，阳光和新鲜的空气使每一颗燕麦都很饱满、充满能量，含有丰富的膳食纤维等营养物质。燕麦食品是西麦企业集团引入中国的主打产品。植物为适应磷素不足的环境而采取常常储存磷素，避免浪费。这个过程主要是降低生长速率，提高磷的利用效率，再循环利用体内的磷源，调整有赖于磷素的碳代谢以及影响呼吸途径[1-3]。低磷处理燕麦幼苗，酸性磷酸酶活性和可溶性糖都会发生不同程度的变化。
1.1植物在低磷条件下的状况
磷是植物的必需矿质营养元素之一，它对植物的众多方面，如细胞膜结构、酶活性调节及物质代谢等方面都有着非常重要的作用。在土壤中磷的含量很低，在含磷较低的环境中，植物的分裂、生长发育以及各种代谢都会受到不同程度的影响，从而植物就会表现出各种不同的症状。另外在低磷条件下，不同基因型的作物，磷的吸收也会表现出一定程度的差异。作物承受低磷的可能原因表现为植株吸收磷的能力或吸收效果不一样以及作物体内对磷同化代谢的能力表现为作为体内单位磷生产的生物量不同。生长正常的植物，组织中的磷大部分存在形式为核苷酸、核酸、磷脂和肌醇磷酸等。在土壤中，植物所吸收的正磷酸盐浓度很低（〈10 μM），而且扩散较慢，另外，在土壤溶液中植物容易形成根际有效磷亏缺区，同时从土壤中获得磷补充又比较慢[4-5]。针对以上原因，在农业生产中一般都是施用磷肥来满足植物生长所需要的磷素，然而，不适当地施用肥料，不但造成资源的浪费，还污染环境。因此，发掘作物自身磷营养高效利用的种质资源，改良作物磷营养性状，已成为目前植物磷营养研究的热点和重点[6]。孙海国[7]认为低磷条件下，燕麦对磷利用的效率高低的主要区别还体现在磷的吸收方面，它的主要影响因素并不是磷的利用效率以及磷的运输效率。植物中的酸性磷酸酶是植物在低磷条件下水解有机磷而产生的一种有机物质，它的活性与植物和土壤中
磷素的含量有着密切的关系。低磷可以诱导植物体内和根系分泌的酸性磷酸酶活性显著增加，而且酸性磷酸酶活性的增加又可以促进有机酸的水解[8]。酸性磷酸酶是一种诱导酶，其活性会明显受到植物供磷量的影响[9]。
1.2燕麦的价值研究
燕麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、B族维生素、尼克酸、叶酸、泛酸、钙、铁等营养物质，有美容护肤的效果，对肝和胃也有很大益处。燕麦作为一种古老的粮食作物，富含可溶性纤维，能大量吸收人体内的胆固醇并排除体外，降低血液胆固醇，以降低心血管疾病患者的风险，并且可以增加胆酸的排泄，这正符合我们所提倡的“食不厌粗”的饮食观。含有燕麦片的饮食结构有助于长期控制能力的摄入，缓解消化的碳水化合物对血糖的影响，有助于糖尿病患者控制血糖。燕麦纤维还可以减轻饥饿感，所以可有效控制体重。由于燕麦既能给我们补充丰富的营养成分又能控制食欲，所以我们都把燕麦列入日常生活中必须的菜谱当中。燕麦中所含的β-聚葡萄糖可以有效改善消化功能、促进肠胃蠕动，并改善便秘的情形。燕麦中所含的丰富的锌、钙、磷、铁等矿物质可以促进伤口愈合，防止贫血。燕麦中所含的维生素E可以扩张末梢血管，并改善血液循环，调整身体状况，所以能减轻使更年期障碍症状。燕麦中所含的锰可以间接预防骨质疏松。燕麦中还含有极其丰富的亚油酸，对脂肪肝、浮肿有辅助治疗的作用，对老年人增强体力，延年益寿也有很好的效果。据统计，我国裸燕麦含粗蛋白质达15.6%，脂肪8.5%，还有淀粉释放热量，与其他8中粮食相比，均名列前茅。燕麦中水溶性膳食纤维分别是小麦和玉米的4.7倍和7.7倍。由上述可知，燕麦丰富的营养、医疗价值，已被古大家认可。
2材料与方法
2.1供试材料
裸燕麦-内农莜1号幼苗、皮燕麦-永118幼苗
2.2实验材料的处理与培养
此实验以裸燕麦内农莜1号和皮燕麦永118为材料。将特殊选择的燕麦种子用10%过氧化氢溶液消毒8 min后用蒸馏水洗过，种植在盛有蛭石的苗钵中。11 d后地上部分真叶开展，抽取新叶，选着长势优良、高度均一的植株，用去离子水冲洗根部并且去除胚乳，然后放入不透光的水培箱子内，培养3 d后进行不同的处理。每三天要跟换一次培养液，每天要用NaOH或HCl将培养液的pH调节为6.5-7.0。要保证温度幅度为20 ℃左右,在适当的光照条件下培养 ,燕麦生长期
间的水分用秤重法维持在50%～70%持水量。
培养液组成：KH2PO4：0.25×10-3 mol/L，K2SO4：7.5×10-4 mol/L，MgSO4·7H2O：6.5×10-4 mol/L，KCl：1.0×10-4 mol/L，Ca(NO3)2·7H2O：2.0×10-3 mol/L，EDTA-Fe：1.0×10-4 mol/L，H3BO3：1.0×10-6 mol/L，MnSO4·H2O：1.0×10-6 mol/L，CuSO4·5H2O：1.0×10-7 mol/L，ZnSO4·7H2O：1.0×10-6 mol/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O：5.0×10-9 mol/L
将上述两种燕麦幼苗在以上所配置的营养液中生长3天后，将植株各分两批处理，开始进行低磷处理。设KH2PO4的浓度分别为0.25（P1）mmol/L、0.005(P2) mmol/L，低磷处理中缺少的K用KCl代替。将一部分裸燕麦和皮燕麦放入磷含量P2的培养液中，另一部分仍在P1全培养液中。为在低磷条件下培养20 d后进行取样测定。
2.3测定指标与方法
组织中酸性磷酸酶活性（APase）的测定方法：对硝基苯磷酸二钠-比色法取新鲜植株，在冷冻室内放置一段时间，使用时取出并称取1 g酶提取液10 mL，研磨后继续冷冻30 min，然后在离心率为4000 r/min的条件下离心30 min，上清液就是我们需要的酶初提取液。吸取酶初提取液2 ml，加入醋酸钠缓冲液1 ml和对硝基酚磷酸钠0.1 mL，混合均匀后，放入37 ℃恒定温度的水浴中保温。
30 min后取出来加入1 mL0.5 mol/L NaOH结束反应。
可溶性糖的测定方法：蒽酮比色法
称取2 g蒽酮溶解到80%硫酸中，以80%硫酸定容到1000 mL。称取大约5 g 新鲜的燕麦组织，放入研钵中，加少量的乙醚，仔细研磨成均匀的浆状物质，倒入烧杯中用70 ℃热水洗涤研钵，洗液也放入烧杯中，再加蒸馏水30-40 mL。接着把溶液放入100ml的容量瓶中，加蒸馏水定容，充分振荡。用干燥的漏斗过滤，接滤液的三角瓶瓶中要提前放有少量（约0.2─0.4g）固体草酸钠，将溶液再次过滤后，提取的透明滤液便为可溶性糖溶液。用滴管吸可溶性糖溶液液1mL，放入一洁净的试管里，加蒽酮试剂5mL，混合均匀，放入沸水中煮沸10 min，取出冷却后，在波长为625 nm的分光光度计上测定吸光度。从标准曲线上查得滤液中可溶性糖的含量，再进行计算可溶性糖的百分数。
实验数据的处理方法：利用Excel 2007表格处理绘图
3结果与分析
3.1低磷处理对两个基因型燕麦酸性磷酸酶活性的影响
酸性磷酸酶可以有效促进植物体内有机磷的重复使用，酸性磷酸酶的活性越
高，磷的重复利用率就会越高。如下面图表所示，低磷处理下，两个基因型燕麦的酸性磷酸酶活性均比高磷条件下有所提高，但增加的程度有所不同。不论低磷处理还是高磷处理，永118的酸性磷酸酶活性都高于内农莜1号的酸性磷酸酶活性，这说明永118在低磷处理下有着更强的耐低磷能力。低磷处理可诱导酸性磷酸酶大量产生，提高磷高效基因型燕麦对磷的吸收和利用能力，以确保地上部和根系对磷的吸收。低磷处理下，植物体内酸性磷酸酶活性的增加，但是分泌的酸性磷酸酶活性不同，可能是一种普遍的适应性机制[10]。
图1不同磷浓度对裸燕麦地上部酸性磷酸酶活性的影响
Figure 1 Different phosphorus concentration on naked oat shoot acid phosphatase enzyme activity
图2不同磷浓度对皮燕麦地上部酸性磷酸酶活性的影响Figure 2 Skins of different phosphorus concentration on oat shoot acid phosphatase enzyme
activity
由图1、2可知，低磷处理能使相同品种地上部酸性磷酸酶活性增加，而且差异显著。上述结果表明低磷处理对相同基因型燕麦幼苗地上部酸性磷酸酶活性的影响是一样的，即在低磷条件下，燕麦植株地上部酸性磷酸酶活性增加。
图3不同磷浓度对裸燕麦根部酸性磷酸酶活性的影响Figure 3 Different phosphorus concentration on naked oat roots of acid phosphatase activity
图4不同磷浓度对皮燕麦根部酸性磷酸酶活性的影响
Figure 4 Skins of different phosphorus concentration on acid phosphatase activity of oat roots
influence
由图3、4可知，低磷处理能使相同品种根部酸性磷酸酶活性增加，而且差异不显著。上述结果表明低磷处理对相同基因型燕麦幼苗根部酸性磷酸酶活性的影响是一样的，即在低磷条件下，燕麦植株根部酸性磷酸酶活性增加。
3.2低磷处理对两个基因型燕麦可溶性糖的影响
在低磷处理下，两个基因型燕麦的地上部分和根系的可溶性糖的含量都有着不同程度的增加。但是，低磷处理下，地上部分可溶性糖的百分含量增加较多，这可能是因为低磷处理影响了光合效率。
图5 不同磷浓度对裸燕麦地上部可溶性糖的影响
Figure 5 Different phosphorus concentration on naked oat soluble sugar of aboveground
图6 不同磷浓度对皮燕麦地上部可溶性糖的影响
Figure 6 Skins of different phosphorus concentration on oat soluble sugar of aboveground
由图5、6可知，低磷处理能使相同品种地上部可溶性糖含量增加，而且差异显著。上述结果表明低磷处理对相同基因型燕麦幼苗的地上部可溶性糖含量的影响是一样的，即在低磷条件下，燕麦植株地上部可溶性糖含量增加。
图7 不同磷浓度对裸燕麦根系可溶性糖的影响
Figure 7 Different phosphorus concentration on naked oat roots of soluble sugar
图8 不同磷浓度对皮燕麦根系可溶性糖的影响
Figure 8 Different phosphorus concentration on the skin of oat root soluble sugar
由图7、8可知，低磷处理能使相同品种根系可溶性糖的含量增加，而且差异不显著。上述结果表明低磷处理对相同基因型燕麦幼苗的根系可溶性糖含量的影响是一样的，即在低磷条件下，燕麦根系可溶性糖的含量增加。
4结论
在低磷条件下，根系分泌的酸性磷酸酶活性显著升高。低磷处理早期，植物根，尤其是植物根尖的酸性磷酸酶活性升高较为突出，随着磷的不足程度越来越严重，植株茎叶的酸性磷酸酶活性也越来越强。总之，为了适应低磷胁迫，植株便会提高酸性磷酸酶活性[11-12]。酸性磷酸酶活性的增强导致植物体内有机磷的分
解，以便磷的重复利用和吸收。通过本实验可知，在低磷条件下，两种不同基因型燕麦的地上部和根系中的酸性磷酸酶活性均会提高。随着供磷量的不断减少，两种不同基因型燕麦的不同之处主要表现在酸性磷酸酶活性的变化程度上。
参考文献
[1] Schachtman D P, Reid R J, Ayling S M . Phosphorus uptake by plants: from soil to cell. Plant Physiol,1998,116:447-453.
[2] Plaxton WC，卡斯威尔满代谢方面在植物磷饥饿应答.勒纳HR，ed.Plant环境压力的反应：从激素基因重组.纽约，NY，USA：马塞尔·德克尔，1999，350-372.
[3] Uhde-Stone C, Zinn K E, Ramirez-Ya ??ez M, Li A, Vance CP, Allan DL. Nylon ?lter arrays reveal differential gene expression in response to P deficiency.Plant physiological secretion of white lupine roots. 2003b. 131.
[4] Bieleski R L.磷酸盐池，磷酸盐运输，和磷酸盐的可用性.安启植物学报,1973,24:225-252.
[5] Barber S A . Soil Nutrient Bioavailability:A Mechanistic Approach.Wiley,New York. 1995.
[6] 陈珠.植物耐低磷机理的研究[J].湖南农业大学,2006,(1):44-45,46.
[7] 孙伟国.不同基因型燕麦在低磷情况下生理生态方面变化的研究[硕士论文].北京：北京农业大学,1998.
[8] 徐方森,张平伟.植物酸性磷酸酶的研究状况[J].华中农业大学报刊,2007, 27(2): 149-154.
[9] 刘正宇.植物体内磷素和土壤中磷的生物的研究进展[J].土壤,1993,24(1):98-101.
[10] Barber S A . Soil Nutrient Bioavailability:A Mechanistic Approach.Wiley,New York. 1995.
[11]Wang Q R，Li J Y，Li Z S .Studies on plant nutrition of efficiency utility for soil phosphorus．Acta Ecologica Sinica,1999,19（3）:417-421.
[12] Xu Q Z．Wheat leaf acid phosphates and Effects of loss phosphorus．Plant physiological communication,1989.（6）:20-23.
Low Phosphorus Treatment Effect of Two Genotypes of Oat Acid Phosphatase Activity And Soluble Sugar
Abstract : Oats planted in China is very common, generally divided into naked oats and oat，it contains less sugar, is a kind of high nutrition and high energy food. Phosphorus is an important element in crop growth, enzyme activity, plant in different ways sugar metabolism and other physiological activities. This study selected the two oat varieties, under low phosphorus conditions, two kinds of different oat genotypes to low phosphorus adaptation reaction. Experimental results show that: under low phosphorus condition for 20 days, compared to the normal P supply, oat in acid phosphatase activity increased; Phosphorus of the two different effects on different genotypes, Wing 118 acid phosphatase activity within the reaction intensity was significantly higher than within agriculture Naked Oats No. 1, stand to low phosphorus higher; under low P condition, the shoot and root of oat the soluble sugar content increased in different degrees, percent content and on the part of the relative increment of sugar.
Key words: Oat ; The treatment of low phosphorus; Phosphatase activity of soluble; Sugar
致谢
不知不觉，大学四年的时光马上就要接近尾声了，意味着我将踏入社会，接受新的挑战。回想起我的大学四年的学习生涯中，心中充满无限的感激之情，感谢母校为我提供良好的学习环境，感谢老师传授给我丰富的专业文化知识，感谢同学给我生活与学习上的帮助与支持。本次论文从选题、搜集材料、做实验、论文修改以及最终定稿都是在李利老师的热情帮助下完成的。经过了无数的困难与障碍，终于在规定时间内圆满完成了我的论文，这都多亏李老师亲切的关怀和热情、耐心的指导。
另外，父母的默默支持和关心是我完成学业的强大精神支柱和动力。他们多年的含辛茹苦才让我走到今天，他们的养育之恩，我毕生难以回报。
在这里，我把此文献给曾帮助过我的每一位亲人、领导、老师、朋友以及同学，向他们表达最深的敬意和由衷的感谢。
白伟
2009级生物工程二班
2013年6月1号
电子教案 第二十五章戊糖磷酸途径和糖的其他代谢途径 ≤课前回顾≥ 提问： 1. 呼吸链的概念、组成，及各成分的排列顺序？ 2. 氧化磷酸化的概念？ 3. 氧化磷酸化的偶联机制？ 4. 化学渗透学说？ ≤教学目的≥ 1 、掌握磷酸戊糖途径的反应特点、关键酶、调节、生理意义。 2 、掌握糖异生途径反应过程、限速步骤、限速酶；熟悉糖异生的调节、生理意义。 3 、熟悉糖的其它代谢途径 4 、寡糖类的生物合成与分解（自学） ≤重点难点≥ 磷酸戊糖途径的反应特点、关键酶、调节、生理意义 ≤教学内容≥ 一．戊糖磷酸途径的引出： 葡萄糖在生物体内的氧化分解代谢主要是通过酵解和三羧酸循环途径进行的，这也是生物产生能量的主要途径。但绝非唯一的途径。
戊糖磷酸途径（ Pentose Phosphate Pathway ）又称戊糖支路（ Pentose Shunt ）、己糖单磷酸途径（ Hexose Monophophate Pathway ）、磷酸葡萄糖酸氧化途径（ Phosphategluconate Oxidative Pathway ）、以及戊糖磷酸循环（ Pentose Phosphate Cycle) 等，这些名称强调从磷酸化的六碳糖形成磷酸化五碳糖的过程。 戊糖磷酸途径是糖代谢的第二条重要途径，是葡萄糖分解的另外一种机制，在细胞溶胶中进行，广泛存在于动植物细胞内 二．过程概述 磷酸戊糖途径是指从 G-6-P 脱氢反应开始，经一系列代谢反应生成磷酸戊糖等中间代谢物，然后再重新进入糖氧化分解代谢途径的一条旁路代谢途径。该旁路途径的起始物是 G-6-P ，返回的代谢产物是 3- 磷酸甘油醛和 6- 磷酸果糖，其重要的中间代谢产物是 5- 磷酸核糖和NADPH 。整个代谢途径在胞液中进行。关键酶是 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶。 三．过程详述 全过程可分为两个阶段：氧化阶段和非氧化阶段 （一）物质代谢 1 ．代谢途径（图） （ 1 ）反应和中间代谢物 （ 2 ）酶和辅酶 （ 3 ）能量和还原力的传递 （ 4 ）碳架的变化6C → 5C +CO2；5C + 5C → 3C + 7C ；3C + 7C → 4C + 6C ； 5C + 4C → 3C + 6C （ 5 ）抑制剂 （ 6 ）总反应式
磷酸戊糖途径(磷酸己糖支路) １、磷酸戊糖途径得生理意义:在组织中添加酵解抑制剂如碘乙酸或氟化物等葡萄糖仍可以被消耗,证明葡萄糖还有其它代谢途径。 ２。磷酸戊糖途径得全过程 涉及到二至七碳糖得相互转化 以６个分子得葡萄糖参与反应。 (１)在6—磷酸葡萄糖脱氢酶得催化下: 不可逆得,反应得产物ＮADPH就是此酶得负调节物。 (2)在6－磷酸葡萄糖酸-δ-内酯酶得催化下: (3)在６-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化下: CO2生成得特点:来源于6-磷酸葡萄糖得第一位碳原子。 (４)上一步反应得6分子5—磷酸核酮糖中,有２分子在磷酸核糖异构酶得催化下异构化成5—磷酸核糖:
在其异构化过程中,形成一个烯二醇式中间产物: 这种互变方式也就是其她醛糖-酮糖互变异构得方式。 (5)另有4分子５-磷酸核酮糖在磷酸戊酮糖表异构酶得催化下异构化成为5—磷酸木酮糖: (6)在转酮酶得作用下,以上反应生成得2分子5－磷酸核糖与2分子5—磷酸木酮糖起反应,形成7- 磷酸景天庚酮糖与3—磷酸甘油醛: (7)在转醛酶得催化下,7—磷酸景天庚酮糖与3—磷酸甘油醛进行反应,形成四碳化合物4—磷酸赤藓 糖与6—磷酸果糖。 (8)第５步反应中还剩下得2分子５-磷酸木酮糖在转酮酶得作用下,再与4－磷酸赤藓糖反应,生成３ —磷酸甘油醛与6—磷酸果糖。
(９)以上反应得产物中有１分子3－磷酸甘油醛异构化为磷酸二羟基丙酮: (１０)余下得1分子3—磷酸甘油醛与磷酸二羟基丙酮反应,生成１,6—二磷酸果糖: (１1)在二磷酸果糖磷酸酯酶得催化下,1,6—二磷酸果糖脱去1个磷酸基,转变成为6－磷酸果糖: (12)至此,共有５分子6—磷酸果糖生成,在磷酸己糖异构酶催化下,转变成6—磷酸葡萄糖: 磷酸戊糖途径得总反应式为: 说明: ①就是位于细胞质得代谢途径。 ②合成5分子6—磷酸葡萄糖并非就是开始反应时得分子骨架 磷酸戊糖途径得生物学意义 (1)NＡDPＨ得生成及其功能特点:就是生物体内NADPH来源得主要途径
组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2130 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。 标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。产品说明： ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。 在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。
试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100- 0.5μmol/mL标准品---100 上清液100--- 试剂一200200200200 试剂二200200200200 混匀后置于37℃水浴中保温15min 试剂三600600600600 上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。 三、ACP活性计算： 1.按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(Cpr×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr 2.按样本鲜重计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/g鲜重)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(W÷V提取×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W 3.按血液体积计算 活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mL)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷V样÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) C标准品：标准品浓度，0.5μmol/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL； T：反应时间，15min；V提取：加入提取液体积，1mL； W：样本鲜重，g。
植物学通报 2004, 21 (2): 139￣145 Chinese Bulletin of Botany 植物戊糖磷酸途径及其两个关键酶的研究进展① 黄 骥 王建飞 张红生② （南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室南京210095） 摘要戊糖磷酸途径是植物体中糖代谢的重要途径，主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的NADPH，可供核酸代谢的磷酸戊糖以及一些中间产物可参与氨基酸合成和脂肪酸合成等。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶是戊糖磷酸途径的两个关键酶，广泛的分布于高等植物的胞质和质体中。本文综述了植物戊糖磷酸途径及其两个关键酶的分子生物学的研究进展，讨论了该途径在植物生长发育和环境胁迫应答中的作用。 关键词戊糖磷酸途径，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 Advances on Plant Pentose Phosphate Pathway and Its Key Enzymes HUANG Ji WANG Jian-Fei ZHANG Hong-Sheng② (National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing210095) Abstract The pentose phosphate pathway in plant is a very important metabolic pathway which supplies the major sources of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) and the ribulose 5-phosphate, ribose 5-phosphate and erythrose 5-phosphate involved in synthesis of nucleotides, aromatic amino acids and fatty acids in non-photosynthetic tissues. This paper mainly reviews the advances of research on plant pentose phosphate pathway and its key enzymes: glu-cose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase. Its possible functions involved in plant development or responding to environmental stresses are discussed. Key words Pentose phosphate pathway, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluc-onate dehydrogenase 戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）是植物体中糖代谢的重要途径，其主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的NADPH以及可供核酸代谢的磷酸戊糖，一些中间产物则可参与氨基酸合成和脂肪酸合成等。已有研究表明，戊糖磷酸途径与植物的生长发育和各种环境胁迫等密切相关。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC1.1.1.49）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGDH, ①人事部优秀留学回国人员基金资助项目。 ②通讯作者。Author for correspondence.E-mail: hszhang@https://www.doczj.com/doc/8810476915.html, 作者简介：黄骥，1978年生，男，博士研究生。张红生，1962年生，男，教授，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种。 收稿日期：2003-03-10 接受日期：2003-06-19 责任编辑：孙冬花
植物根系酸性磷酸酶活性测定 1原理 该方法以对硝基苯磷酸二钠（即P-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化 下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根_ 据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤 酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的 对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（⑷h-1 g-1鲜根或口 g -1/i株）。 2?测定方法 1）称取（1.2 ±.1） g鲜根，加入8mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8）,然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。 2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入 2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于 37C水浴30min。 3）水浴后加入 2mL 0.5mol/L CaCI 2及2mL 2mol/L NaOH 以终止反应，摇匀。 4） 2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。 5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值 A410。 3?标准曲线的制作 1 ）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表 1加入试剂 表1对硝基苯酚标准曲线配制表
2）混匀后，在2500r/min下离心5min ,再在4000r/min下离心5min以0号作为对照， 在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n（ mol） a b A410。 4?计算方法 根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对 硝基苯酚（p-NP）的量来表示（° h-1 g-1鲜根或口 g心株）。 即根系酸性磷酸酶活性（g h 1 g 1鲜根）n M 稀释倍数/（W t） 式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（卩mo）; M —对硝基苯酚的相对分子质量（139.11g/mol）; t —反应时间（h）; W—样品鲜重（g）。 稀释倍数一8 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0 ） A: 0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL ） B: 0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C z H s O z Na 或27.2g C z H s O z Na - 3出0 定容至1000mL ） 14.8ml A + 35.2ml B 混合即得
土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1
碱性磷酸酶偏高的原因 当受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。[1] 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、、继发性肝癌、性等时，过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等[2]。 有何影响 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、、、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、、、时，血清碱性磷酸酶亦可升高，所以对人体的危害是比较大的。 酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于，定位于溶酶体内。ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。
(1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：白血病、、匹克病、、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。[1] (5)其他：，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP活性可增高。 是一种糖酵解酶。存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。是能催化乳酸脱氢生成的酶，几乎存在于所有组织中。同功酶有五种形式，即LDH－1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH－3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用方法将其分离。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。正常人血清中LDH2，〉LDH1。如有释放入血则LDH1〉LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。乳酸脱氢酶大于300，属于增高，600，高出1倍，有参考价值。如果排除急性心肌梗死、巨幼细胞性贫血及溶血性疾病后，首先要考虑恶性肿瘤。虽不是恶性肿瘤唯一的诊断，但确实对肿瘤诊断有重要的临床意义，最好做进一步检查，防患于未然。 糖的吸收途径： 小肠绒毛吸收小肠内葡萄糖的方式为二级。小肠内钠离子浓度高于小肠绒毛内的钠离子浓度，因而两者之间存在钠离子浓度差的，通过该钠离子的浓度差，葡萄糖和钠离子可以从小肠内通过离子通道进入小肠绒毛；
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求 掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。 2．方法原理 酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。 3．主要实验仪器及材料 干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。 4．掌握要点 掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。 5．实验内容 （1）酶液提取。称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。 （2）活力测定。取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。 （3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。 酶活性nmol/min.mg= ） （ ） （ 试样的 g W V V A ? ? ? min 10 1 1.3 019 .0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019； 3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol化为nmol乘上1000； V为酶制剂总体积； V1为每次用酶体积。
酸性磷酸酶的临床意义 酸性磷酸酶是一种广泛存在于人体组织内的一种物质，主要存在于细胞和体液里面，血液里面的酸性磷酸酶，主要来源于前列腺，来源于血小板，白细胞等，其中在前列腺里面，含量是最丰富的。在日常的医疗检查当中，通过对酸性磷酸酶的检查，能够取得前列腺癌的辅助诊断的作用，另外对于血液病、骨类疾病也有一定的诊断的作用和效果。 ★临床意义 正常人血清中的酸性磷酸酶来源于骨、肝、肾、脾、胰等组织，故不论男女老幼，其含量大致相同。而前列腺患者以及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力都会升高。为了鉴别血清中增加的酸性磷酸酶是来自前列腺还是来自其他器官，必须加以区别。为此可进一步采用某些抑制剂进行选择性抑制作用。例如：乙醇和酒石酸对前列腺酸性磷酸酶有显着的抑制作用，而对红血球酸性磷酸酶的抑制作用较弱。
ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。 (1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对前列腺癌的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：粒细胞白血病、高雪病、尼曼匹克病、原发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多发性骨髓瘤及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。 (5)其他：甲状腺功能亢进，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP
活性可增高。 正常男性血清中酸性磷酸酶1/3～1/2来自于前列腺，女性血清中的酸性磷酸酶主要来自肝脏、红细胞和血小板。酸性磷酸酶有20种同工酶，临床测定的同工酶大致为两大类：一类是前列腺酸性磷酸酶；另一类是非前列腺酸性磷酸酶。酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。
货号：MS2900 规格：100管/96样土壤酸性磷酸酶（Solid-acid phosphatase，S-ACP）活性测定试剂盒 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。 测定原理： 酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加576 μL无水乙醇（自备），24 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 粗酶液提取： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4 mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 测定步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 S-ACP活性计算公式： 第1页，共2页
磷酸戊糖途径（磷酸己糖支路） 1.磷酸戊糖途径的生理意义：在组织中添加酵解抑制剂如碘乙酸或氟化物等葡萄糖仍可以被消耗，证明葡萄糖还有其它代谢途径。 2.磷酸戊糖途径的全过程 涉及到二至七碳糖的相互转化 以6个分子的葡萄糖参与反应。 （1）在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的催化下： 不可逆的，反应的产物NADPH是此酶的负调节物。 （２）在6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯酶的催化下： （３）在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化下： CO2生成的特点:来源于6-磷酸葡萄糖的第一位碳原子。 （４）上一步反应的6分子5-磷酸核酮糖中，有2分子在磷酸核糖异构酶的催化下异构化成5-磷
酸核糖： 在其异构化过程中，形成一个烯二醇式中间产物： 这种互变方式也是其他醛糖-酮糖互变异构的方式。 （５）另有4分子5-磷酸核酮糖在磷酸戊酮糖表异构酶的催化下异构化成为5-磷酸木酮糖： （６）在转酮酶的作用下，以上反应生成的2分子5-磷酸核糖与2分子5-磷酸木酮糖起反应，形成7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛： （７）在转醛酶的催化下，7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛进行反应，形成四碳化合物4-磷酸赤藓糖和6-磷酸果糖。
（８）第5步反应中还剩下的2分子5-磷酸木酮糖在转酮酶的作用下，再与4-磷酸赤藓糖反应，生成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖。 （９）以上反应的产物中有1分子3-磷酸甘油醛异构化为磷酸二羟基丙酮： （１０）余下的1分子3-磷酸甘油醛与磷酸二羟基丙酮反应，生成1，6-二磷酸果糖： （１１）在二磷酸果糖磷酸酯酶的催化下，1，6-二磷酸果糖脱去1个磷酸基，转变成为6-磷酸果糖：
（１２）至此，共有5分子6-磷酸果糖生成，在磷酸己糖异构酶催化下，转变成6-磷酸葡萄糖： 磷酸戊糖途径的总反应式为： 说明： ①是位于细胞质的代谢途径。 ②合成5分子6-磷酸葡萄糖并非是开始反应时的分子骨架 磷酸戊糖途径的生物学意义 （1）NADPH的生成及其功能特点：是生物体内NADPH来源的主要途径 ①在许多物质（如：脂肪酸，胆固醇，类固醇）的生成合成中作为H和电子供体。 ②NADPH是生物体内一些酶的辅酶。 （2）在磷酸戊糖途径中，5-磷酸核糖是重要的中间产物。5-磷酸核糖是合成核苷酸、ATP、ADP、核酸的原料。 （3）磷酸戊糖途径中4-磷酸赤藓糖也是一个非常重要的中间产物。4-磷酸赤藓糖是合成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的原料，因而磷酸戊糖途径与蛋白质代谢关系密切。 （4）磷酸戊糖途径与糖酵解有着共同的中间产物，因而两条途径是可以互相转变的、互相协调的。
实验三植物体内酸性磷酸酶的组织定位 一、实验目的 1、掌握植物体内酸性磷酸酶的金属盐―铅法染色进行组织定位的原理与技术。 2、掌握制作徒手切片的技术。 二、实验原理 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体的标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。 酸性磷酸酶金属盐―铅法，其基本原理是在酸性环境下，底物β―甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕褐色硫化铅沉淀。 三、实验材料、试剂和仪器 1、实验材料：甘蓝叶片与小白菜叶片。 2、实验试剂：丙酮、β―甘油磷酸钠溶液、2%硫化铵等。 3、实验用品：刀片、镊子、培养皿、托盘等。 四、实验步骤 1、甘蓝叶脉染色 （1）徒手切片的制作：在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住甘蓝叶脉，右手平稳地拿住刀片。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，自左前方向右后方均匀地拉切。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用于材料染色。 （2）将一部分材料薄片铺在载玻片上，滴加蒸馏水铺平材料，加入1滴冰的丙酮溶液，固定15min。固定完成后，用蒸馏水水洗，一边滴加蒸馏水，一边用吸水纸吸，反复2-3次。用滴管慢慢的将切片挑起来，放置在含有10ml的底物溶液中，37℃保温1h。将切片用蒸馏水水洗2~3次后，放置在含有2% 的硫化铵溶液中1-2min，蒸馏水水洗2-3次。将染色的切片盖上盖玻片，制作成临时玻片。显微镜下观察，拍照记录染色结果。 （3）将另一部分切片放置蒸馏水中加热用作空白对照。其余操作同上。 2、小白菜根系染色 （1）将小白菜的根系蒸馏水洗净后，用刀切开，一半用于组织染色，另一半放在蒸馏水中加热煮死，作为空白对照。 （2）将根系放置在含有冰的丙酮溶液中固定15min，用蒸馏水水洗2~3次。固定完
骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。 研究应用 碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶（HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。 在研究中最常用的ALP如下： ◇细菌碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 来源：Escherichia coli C4 ； ◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 来源：一种北极虾 (Pandalus borealis) ; ◇ 小牛肠碱性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP); ◇ 胎盘碱性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比，SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域) ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中： ★分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团，用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接，从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态;同样，通过去磷酸化可用作放射标记示踪。通常用作这些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP)，因为在反应完成之后它是最容易灭活的。 ★酶免分析中应用最多的是ELISA，以竞争法测小分子抗原为例，抗体先与固相载体结合，然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合，洗去未反应的过量ALP-抗原，加入显色底物。则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而知道待测样品中抗原的浓度。ELISA中用的比较多的是辣根过氧化物酶(HRP)，底物为OPD，深桔黄色，检测波长492nm；TMB，蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯），黄色，检测波长405nm ★目前工业上一个普遍的应用是作为检验牛奶的巴斯的灭菌的标志：被巴斯德过高温灭菌的分子会被灭活，向其中和未巴斯灭菌的牛奶中加入ALP的底物，2分钟后未灭菌的样品应该显黄色，如果待测样品(指被巴斯灭菌过的牛奶)也能呈现相同颜色，则说明巴斯灭菌温度未过度。当然总有例外，因为有少数细菌会产生耐热的ALP。 测定方法 有很多种，我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法，但现在应用较多的是连续检测法。 原理为以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。 正常范围 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。
碱性磷酸酶(ALP或AKP) 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。其中第1 、2 、6 种均来自肝脏，第3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。 化学特征 碱性磷酸酶名字 alkaline phosphatase (ALP 或AKP) 碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如A TP，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。 ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。 碱性磷酸酶偏高的原因 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起血清中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等。 有何影响 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进
酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法) 简介： 酸性磷酸酶(acid phosphatase ，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH 为4.5～5.5。酸性磷酸酶是一个蛋白家族。 Leagen 酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)(Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是以磷酸苯二钠作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，通过Folin-酚(又称福林酚)显色，于分光光度计680nm 处检测吸光度，以酶促反应时间为横坐标以产物生成量为纵坐标绘制进程曲线。曲线的起始部分在某一段时间内呈直线。该试剂盒主要用于组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 离心管或试管 3、 水浴锅 4、 比色杯 5、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 编号 名称 TE0029 50T Storage 试剂(A): Phenol(10mM) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 样品稀释液 100ml RT 试剂(C): ACP assay buffer 15ml -20℃ 避光 试剂(D): ACP 终止液 100ml RT 试剂(E): Folin-酚显色液 15ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
碱性磷酸酶偏低是怎么回事 碱性磷酸酶偏高有正常的生理原因和不正常的病理原因，而碱性磷酸酶偏低一般为病理性原因。如果检测到自身碱性磷酸酶偏低，一般如果数值接近正常参考值没多大问题，但数值大大低于碱性磷酸酶正常值的时候就应该引起注意，及时到医院就诊。那碱性磷酸酶偏低到底是怎么回事？ 碱性磷酸酶偏低的原因 1、贫血引起的碱性磷酸酶偏低。 2、有可能是孕妇缺乏营养引起的，也有可能是由于疾病所致，常见的骨质流失是造成孕妇碱性磷酸酶偏低的最重要的病理性因素。 3、重症慢性肾炎引起的碱性磷酸酶偏低。 4、病毒性感染时其活性在正常范围或略低引起的碱性磷酸酶偏低。 5、营养不良、呆小症，维生素C缺乏症坏血病、乳糜泻、恶病质，遗传性低磷酸酶血症引起的碱性磷酸酶偏低。 6、除了以上几种情况之外，如果孕妇患有维生素c缺乏症、坏血病、乳糜泻和恶病质的时候，会影响碱性磷酸酶指数。 准妈妈碱性磷酸酶偏低怎么办 1、如果是因为营养不良和贫血造成的，则应该调整孕妇的饮食结构，多吃动物的肝脏，促进身体对铁质的吸收，多吃新鲜的蔬菜，通过补充叶酸，促进红血球的生成，达到辅助造血的功能。为了避免孕妇碱性磷酸酶由于缺乏营养造成偏低。孕妇要适量的多食用一些高钙食物比如说像豆类食品、奶类食品、一些水果和瘦肉。除此之外，还应该多吃含有丰富蛋白质的食物，比如牛奶、鱼虾、豆制品等等。妊娠期是一个特殊时期，一定要多加强营养，补充微量元素，可以让体内的胎儿更好的成长。 2、如果是因为肝功能导致碱性磷酸酶偏低，您应该在医生的指导下做出相应的药物服用，以安全地度过妊娠期，肝病不是一朝一夕就能治疗好的，孕期服药更是容易对宝贝的发育产生影响，建议您一定要谨遵医嘱，不要冲动行事。 3、保持好的心态是治疗的关键，碱性磷酸酶指数偏低是很多孕妇都有的现象，您不必过于担心和过度服药。焦虑和烦闷不仅不能治疗碱性磷酸酶偏低，还会让自己的身体机能下降，影响宝贝的发育。所以，在积极乐观的情绪下正常饮食、规律作息。
货号：MS2001 规格：100管/48样组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。 测定原理： 在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。 标准品：液体×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。 2.细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建 议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血液可直接测定，或者适当稀释后测定。 测定方法： 1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37 o C水浴中预热30 min。 3. 空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。 4. 标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。 5. 对照管：取EP管，加入4μL上清液，40μL蒸馏水，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。 6. 测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。 第1页，共2页