植物学通报 2005, 22 (2): 163￣168①福建省科技厅重点项目(99-Z-193)和福建省教育厅项目(K04037)资助。②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: xielh@https://www.doczj.com/doc/837443138.html,
收稿日期：2003-10-16 接受日期：2004-06-28 责任编辑：白羽红
绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个
cDNA 及其下游非编码区
①
林 毅 谢荔岩 陈国强 吴祖建 谢联辉② 林奇英
(福建农林大学植物病毒研究所，生物农药与化学生物学教育部重点实验室 福州 350002)
摘要 通过3'RACE 克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum )核糖体失活蛋白(ribosome-inac-tivating protein,RIP) Gynostemmin 的5个cDNA 序列gynostemmin Ⅰ~Ⅴ及其下游非编码区(3' untranslated region, 3'UTR)。它们的编码区长度除gynostemmin Ⅱ为825 bp 外，其余均为831 bp 。其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171 bp 。在3'UTR 中，gynostemmin Ⅰ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU 的不稳定子元件，其mRNA 的稳定性可能因此受到影响。关键词 绞股蓝，核糖体失活蛋白，3'RACE ，3'UTR
Five cDNA Sequences and Their 3'Untranslated Region
Encoded Ribosome-Inactivating Protein from
Gynostemma pentaphyllum
LIN Yi XIE Li-Yan CHEN Guo-Qiang WU Zu-Jian XIE Lian-Hui ② LIN Qi-Ying
(Institute of Plant Virology, Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education,
Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002)
Abstract Five cDNA sequences and their 3' untranslated regions (3' UTR) of ribosome-inacti-vating protein from Gynostemma pentaphyllum were isolated and analyzed. The coding region of gynostemmin Ⅱ is 825 bp in length, and those of the other four are 831 bp long. Their 3' UTRs are 279, 174, 170, 161 and 171 bp in length, respectively. Two small stem-loop and one AU-rich element were found only in the 3' UTR of gynostemmin I.
Key words Gynostemma pentaphyllum , Ribosome-inactivating protein, 3' RACE, 3' UTR
核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)是一大类能抑制蛋白质生物合成的蛋白质超家族，广泛分布于高等植物中。根据结构的不同可分为Ⅰ型单链和Ⅱ型双链两种，其中对Ⅰ型RIP 的研究最为深入。RIP
具有非常广谱的植物病毒抗性，还能抵抗多种植物病原真菌以及农业害虫，具有很好的植物保护前景(Wang and Tumer, 2000；Zhou et al., 2000；Peumans et al., 2001)。此外，RIP 及其单链免疫毒素对肿瘤、骨髓移植、自身
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免疫及艾滋病(AIDS)等疾病的治疗有着潜在的应用前景，有的已在临床应用试验中取得了令人瞩目的进展(McGrath, 1989；Shaw et al., 1994；Au et al., 2000；Witte, 2001)。
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是葫芦科多年生草质落叶藤本植物，是目前除人参属外含人参总甙类似物的唯一植物(叶能干等，1996)。我们首次从绞股蓝中分离到核糖体失活蛋白，并克隆了其编码基因片段，对应的203个氨基酸与其他葫芦科RIP对应区段的同源性为37% ~ 42%(林毅等，2003)。在此基础上，本研究利用3' RACE技术获得5个cDNA 序列及其下游非编码区序列。
1 材料和方法
1.1 供试材料
1.1.1植物绞股蓝(G y n o s t e m m a pentaphyllum)采自福建农林大学校园。
1.1.2 菌株和质粒克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。E. coli DH5α为福建农林大学植物病毒研究所保存。
1.1.3 试剂 SMART TM RACE cDNA Ampli-fication Kit试剂盒购自Clontech公司。总RNA提取试剂盒、λDNA/Eco RⅠ+Hin dⅢmarker、氨苄青霉素(Amp)、IPTG、X-Gal 和核酸内切酶购自上海博亚公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 方法过程
1.2.1 绞股蓝总RNA的提取取绞股蓝幼嫩叶片0.5 g，冰冻2~3小时后研磨，然后按试剂盒的操作说明提取总RNA。
1.2.2 3' RACE模板的制备利用试剂盒中的3'-CDS primer制备3'-RACE-Ready cDNA。
1.2.3 3'RACE扩增根据已知序列设计正向特异引物609A(CGGGATCCGACATTAAC-TTTAGCCTGGCGGGT)和3GSP(GACATTAA-CTTTAGCCTGGCGGG)，均对应成熟蛋白N 端第一个氨基酸的密码子，不同的是609A的5'端引入Bam HⅠ酶切位点，3GSP的5'端不含修饰碱基。以3'-RACE-Ready cDNA为模板，用609A和试剂盒中的UPM进行PCR扩增，进一步以3GSP和试剂盒中的NUP对前一扩增产物进行半嵌套扩增。扩增反应在T3 Thermocycler(BiometraR)基因扩增仪上进行，反应程序为：94 ℃变性50秒，68~60 ℃退火50秒(每2个循环降2 ℃，60 ℃时17个循环)，72 ℃延伸2分钟。RACE扩增采用试剂盒中的Advantage2 Polymerase Mix，其中含有少量具有校正功能的聚合酶，因此扩增序列的保真性较好。
1.2.4 克隆和序列测定 PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5α，以5GSP2为测序引物对阳性重组克隆子进行序列测定。
1.2.5 生物信息学分析核酸或氨基酸序列比较与同源性分析在https://www.doczj.com/doc/837443138.html,/ blast和https://www.doczj.com/doc/837443138.html,/tools/clustal上进行。基因及蛋白质理化性质分析在DNATOOLS生物学软件上进行。亚细胞定位在http://psort. nibb.ac.jp上进行。5'UTR二级结构的预测用RNAdraw生物学软件分析。信号肽剪切位置和穿膜螺旋的预测通过www.cbs.dtu.dk/ser-vices上的相应软件进行。
2 结果分析
2.1 3'RACE扩增和序列测定
以3'-RACE-Ready cDNA为模板，用609A/UPM进行PCR扩增，产生约1 100 bp 和1 000 bp 2种不同大小的产物。进一步以3GSP/NUP对前一扩增产物进行半嵌套PCR，产物中除上述2个条带外，还有2个非常微弱的条带，约900 bp和850 bp(图1)。分别将其克隆到pMD18-T 载体上进行序列测定。获得了5个R I P序列，分别命名为gynostemminⅠ (AY134616)、gynostemmin Ⅱ(A Y134617)、g y n o s t e m m i nⅢ
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林 毅等: 绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个cDNA 及其下游非编码区
(AY160767)、gynostemmin Ⅳ (AY160768)和gynostemmin Ⅴ (AY160769)。它们的编码区长度除gynostemmin Ⅱ为825 bp 外，其余均为831 bp 。其3'UTR 的长度分别为279、174、170、161和171 bp 。
2.2 5个cDNA 及其编码区的比较
根据序列中缺失的情况，将绞股蓝RIP 的5个cDNA 分为2组。组1，发生6 bp 缺失(535 GAAAAC 540，与574~579间的序列完全一样)，包含gynostemmin Ⅱ，编码275aa ，它与组2各成员的同源性为93%~94%；组2，包含gynostemmin Ⅰ、Ⅲ~Ⅴ，不发生6 bp 缺失，编码277 aa ，成员间的氨基酸水平同源性为98%~99%。
gynostemmin Ⅰ~Ⅴ共有41个碱基变异。其中32个发生在gynostemmin Ⅱ上(含6 bp 缺失)，4个在g y n o s t e m m i n Ⅳ上，2个在gynostemmin Ⅰ上，2个在gynostemmin Ⅴ上，还有1个发生在gynostemmin Ⅲ。41个变异中，除A-G 729外，其余40个均只发生在gynostemmin Ⅰ~Ⅴ中的一个成员上。
gynostemmin Ⅰ~Ⅴ编码蛋白之间发生23个氨基酸残基变异(图2)。其中18个发生在Gynostemmin Ⅱ上(包含6 bp 缺失编码的E 和N 2个残基)，3个在Gynostemmin Ⅳ上，1
个在G y n o s t e m m i n Ⅰ上，另有1个在Gynostemmin Ⅴ上。Gynostemmin Ⅳ发生独一无二的变异：17(r-F)，而其他植物RIP 的相应位点处均为F 。G y n o s t e m m i n Ⅲ与Gynostemmin Ⅰ有2个氨基酸发生差异：154(m-V)和184(p -T )。G y n o s t e m m i n Ⅴ与Gynostemmin Ⅰ之间只有1个氨基酸不同：184(p-T)。
2.3 绞股蓝RIP 5个cDNA 的下游非编码
区的比较
就3'UTR 而言, C%为9.94~11.49, (G+C)%为24.37~26.71，符合3'UTR 的一般特征。gynostemmin Ⅰ的长度为279 bp ，而其余4个仅161~174 b p ，其差别主要是因为gynostemmin Ⅰ的poly(A)信号与poly(A)之间的距离长达123 bp ，而其余的仅为14~24bp 。与α-luffin 、β-luffin 和trichoanguin 一
样，绞股蓝RIP 基因家族采用TGA 为终止密码子，而TCS 、α-momorcharin 和BD1的终止密码子则为TAG 。绞股蓝RIP 基因家族的poly (A)信号为“AATAAATAAA ”，不同于常见的“A A T A A A ”。
gynostemmin Ⅱ~Ⅴ的3'UTR 其二级结构基本相似(图3A)，而gynostemmin Ⅰ则多了两个小的茎环结构(图3B)。gynostemmin Ⅰ的3'UTR 中还含有不稳定子元件ARE(AU-rich element)。两个小的茎环结构和ARE 可能对其mRNA 的稳定性有所影响，绞股蓝可能
因此对RIP 基因家族实施不同的调控策略。2.4 分析
绞股蓝RIP 前体的加工，除了发生N-末端信号肽切除外，还可能在转运到目的地之后发生C-末端延伸序列切除。目前已证实发生C-末端延伸序列切除的RIP 至少有TCS(19aa)、Sechiumin(15 aa)、PAP(29 aa)、Bouganin(29 aa)和Saporin-6(22 aa)(Chow et al., 1990；Benatti et al., 1991；Tumer et al.,1997；Wu et al., 1998；den Hartog et al.,
图1 3'RACE 扩增产物
Fig.1 The amplified products of 3'RACE
M. λDNA cleaved with Hin d Ⅲ and Eco R Ⅰ; lane 1.
The PCR products (M, MW marker)
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2002)。迫切的任务是确定绞股蓝RIP 的C-末端延伸序列的氨基酸个数，可通过测定Gynostemmin 的C-末端氨基酸序列确认延伸序列的位置，或者应用相关的分析软件预测出大致的切除位置，并据此寻找合适的切除物质。
单碱基变异也可能造成重大影响。绞股蓝RIP 基因家族成员间存在的天然变异，可能包含了大部分重要的变异位点，为今后利用点突变技术研究RIP 的结构与功能指明了方向。
3'UTR 对mRNA 表达的调控作用极其重要，它更多地决定特定mRNA
的个性，调
图2 推导的Gynostemmin Ⅰ~Ⅴ氨基酸序列的比较
Fig.2 Comparison of the deduced amino acid sequences of Gynostemmin Ⅰ~Ⅴ
The sequence alignment was carried out with CLUSTAL W (1.81). Dashes denote gaps introduced to obtain maximal homology. The identical amino acid residues are marked by asterisks (*).
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林 毅等: 绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个cDNA 及其下游非编码区
控特定mRNA 在特定条件下能否正常表达或表达的效率。绞股蓝RIP 基因家族中，3'UTR 的poly(A)尾的长度、ARE 不稳定子元件以及二级结构等对mRNA 稳定性的影响有待考察。可将其3'UTR 与GUS 基因融合，导入烟草原生质体，研究不同3'UTR 对翻译的调控作用。
图3 Gynostemmin Ⅰ~Ⅴ的下游非编码区的二级结构比较
Fig.3 Comparision of secondary structure of 3'UTR of Gynostemmin Ⅰ~ⅤA. Gynostemmin Ⅱ~Ⅴ; B. Gynostemmin
Ⅰ
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核基因编码的蛋白质（多肽）可能成为细胞质基质的“永久居民”，也可能运送到细胞核、线粒体、内质网等结构，其“命运”取决于自身的氨基酸序列中是否包含了分选信号序列以及是哪种分选信号序列，如下图所示： ⑴某些蛋白质经⑧过程可以穿过进入细胞核，这种运输方式（具有、没有）选择透过性。 ⑵线粒体所需的蛋白质（全部、部分）来自细胞质基质，蛋白质进入线粒体多数需要位于其外膜上的TOM复合物和内膜上的TM23复合物的协助，据此推测TOM复合物和TM23复合物在功能上很可能相当于主动运输所需的。 ⑶多肽在进入内质网之后需要继续完成翻译并进行，成为具有一定___________的蛋白质，研究发现，源于内质网的蛋白质其结构中并不包含分选信号序列，据此推测内质网中可能含有切除分选信号序列的酶。 ⑷内质网可以通过“出芽”形成，包裹着蛋白质定向移动到高尔基体并与之融合，“出芽”和融合的基础是生物膜具有性。（5）经②③过程形成的蛋白质经过④途径送往溶酶体、成为膜蛋白或____________。分泌蛋白（或“分泌至细胞外”） （6）在内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质，会在内质网中大量堆积，此时细胞通过改变基因表达减少新蛋白质的合成，或增加识别并降解错误折叠蛋白质的相关分子，进行细胞水平的__________调节。反馈
（7）某些蛋白质经⑥、⑦过程进入线粒体、叶绿体时，需要膜上_____________的协助。线粒体和叶绿体所需的蛋白质部分来自⑥、⑦过程，部分在___________的指导下合成。蛋白质（或“膜蛋白”）线粒体或叶绿体基因（DNA） （8）除了图中⑤以外，送往不同细胞结构的蛋白质具有________________，这是细胞内蛋白质定向运输所必须的。（5）不同的信号序列