分配系数m ：
式中，cs 和cm 分别为组份在固定相和流动相中的浓度。
m 类型：A 、B 型曲线是一条典型的吸附等温线，吸附色谱法属于这类曲线。C 和D 型吸附等温线很少遇到。C 曲线为线性分配等温线。
线性色谱：溶质浓度低时，m 为常数时的色谱
意义：容易理解，溶质流过色谱柱时，m 大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m 小的组份需要的时间短；当样品中各组份在两相的m 不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。
按原理分类(P122 掌握)
吸附等温线
当吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量q*同溶液中溶质的平衡应与温度有关。
当温度一定时，吸附量只和浓度有关，q* = f(c) --- 吸附等温线。
A)、Henry type
q *与液相溶质浓度c 之间的关系为线性函数：
适应条件：在低浓度范围之内成立。当浓度较高时，上式无效。
B)、Freundlich type
其经验公式为
其中，k 和β为常数，β一般在0.1-1之间。 当吸附剂对溶质的吸附作用非常大的时候，β可能小于m
s c c m =
0.1，此时游离浓度对吸附浓度的影响很小。
Freundlich 等温线可以描述大多数抗生素、类固醇、甾类激素等在溶液中的吸附过程。
C)、Langmuir type
当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，这时存在
β<0.1 ，或用前式表示Kb 非常大，这时游离的溶质浓度对吸附浓度影响极小，接近不可逆吸附。
D)、Rectangle type
如在固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附中，一般存在β<0.1。
1.塔板理论（plate theory ）
塔板理论的假设：
(1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；
(2) 将载气看作成脉动（间歇）过程；
(3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；
(4) 每次分配的分配系数相同。
● n 称为理论塔板数(theoretical plate number)。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n 的增加而增
加，随塔板高H 的增大而减小。
n 与半峰宽及峰底的关系式为:
式中tr(或Y1/2)应采取同一单位(时间或距离)。上式示：在tR 一定时，如果色谱峰越窄，则说明n 越大，H 越小，柱效能越高。
● 在实际工作中，按上式计算出来的n 和H 值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR
计算时，没有扣除死时间tM ，所以，常用有效塔板数n 有效表示柱效：
有效塔板高为：
例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A 在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A 峰的半峰宽及有效塔塔板高度。
塔板理论的特点和不足
(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。
(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气(流动相)流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
●速率方程（也称范.弟姆特方程式）---影响柱效的因素
他们吸收了塔板理论中塔板高的概念，并同时考虑影响塔板高的动力学因素，指出：谱峰扩宽受三个动力学因素的控制，即涡流扩散，分子扩散项，传质阻力项。这样, 上述塔板高方程表示
H = A + B/u + C·u
H：理论塔板高度，
u：载气的线速度(cm/s)
●A─涡流扩散项
A = 2λdp
dp：固定相的平均颗粒直径
λ：固定相的填充不均匀因子
固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
●B/u —分子扩散项
B = 2 νDg
ν：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。
Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;
(3) 分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;
(4) 扩散系数：Dg ∝(M载气)-1/2 ；M载气↑，B值↓。
●C·u —传质阻力项
传质阻力包括气相传质阻力C g和液相传质阻力C L即：
C =（C g + C L）
载气流速高时：
传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速?，柱效?。
载气流速低时：
分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速?,柱效?。
●速率理论的要点
1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。
(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。
(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。
分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比，即
一般来说，当Rs < 1时，两峰总有部分重叠；当Rs =1时，两峰能明显分离；Rs >1.5时，两峰才能完全分离。当然，更大的Rs值，分度效果会更好，但会延长分析时间。
利用上式，可以直接从色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。而下式清楚地指出了，分离度受柱效n、选择性α和容量因子k三个参数的控制：
意义：
第一，增加塔板数，可以增加分离度，若通过增加柱长来增加塔板数，就会延长分析时间。所以，设法降低塔板高H，才是增大分离度的最好方法。
第二，加大容量因子可以增加分离度，但是会延长分析时间，至造成谱带检测困难。一般来说，当k > 10时，分离度的提高并不明显；而当k < 2时，洗脱时间会出现极小值。因此，在色谱分离中，通常将k控制在2——7之间。
第三，选择性参数α的微小增大，都会使分离度得到较大的改善。当α > 2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。当α≈ 1时，要完成分离，必须增加柱长，延长分析时间。例如，为了达到同样的分离度，当α = 1.01时，所需的时间是α = 1.1时的84倍。显然，当α = 1时，无论怎样提高柱效，加大容量因子等，Rs均为零。在这种情况下，两组份的分离是不可能的。
液相色谱
●凝胶色谱
●排阻极限（exclusion limit）
凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD, 即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。
●sephadex葡聚糖凝胶G-25(50,75,100,100)的粒度的选择：
组别分离时，选用孔径小的颗粒，虽然分辩率低，但由于组分的Kd值差异大，也能得到较好的分离。
分级分离时，以孔径大的凝胶为主，而且要求颗粒大小均匀，以保证较高的分辩率。
●分子筛操作中的注意点
?上样体积要足够的小（一般为整个柱体积的1％～5％），样品中可以含有一定的盐成分（—脱盐柱），柱子要有合适的长度。
?洗脱一般为无梯度的洗脱。
?针对分离的目的和样品的特性要选用不同特性的色谱柱（各个厂家会有说明其适用的分子量范围），以达到最佳的分离效果。
?
●
Sephadex: 交联葡聚糖
Sepharose：琼脂糖凝胶
Bio-Gel A ; Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N,N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶
离子交换色谱（IEC）
定义：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。荷电溶质在离子交换剂上的分配系数：
m(I)＝A/IB＋m∞
I：流动相的离子强度；
m∞：为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配；
常数A和B为pH的函数；
B：溶质的静电荷数与离子交换基的离子价数之比。蛋白质为多价电解质，在pH偏离等电点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故B值比较大。
●IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法、逐次洗脱法。
●离子交换层析的基本步骤：平衡、上样吸附、洗脱、再生
1.层析柱平衡
缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍
平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速
平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要
2.样品进柱
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%
为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
●样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般无特殊的限制。
疏水性相互作用层析（HIC）
定义：是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。
●配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。
●疏水性相互作用层析的应用及特点
1.互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC
的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。
2.与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。
3.可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适
当的吸附剂。
4.疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
反相层析（RPC）
定义：利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。
●前述HIC同样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被
非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
●RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用
于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。
●因此RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。
●分离能力：SEC 使样品变性的趋势：SEC 1.液相色谱按分离机制分为那几大类？ 2.简述柱层析系统的工艺流程。 3.何谓保留值、分配容量K、分离度？ 4.何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？ 5.简述IEC的工作原理？ 6.简述凝胶色谱的工作原理？ 7.IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法（linear gradient elution）、逐次洗脱法 （stepwise elution）,为什么？ 思考题 1.液相色谱按分离机制分为那几大类？ 2.简述柱层析系统的工艺流程。 3.何谓保留值、分配容量K、分离度？ 4.何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？ 5.简述IEC的工作原理？ 6.简述凝胶色谱的工作原理？ 7.IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法（linear gradient elution）、逐次洗脱法 （stepwise elution）,为什么？ 第二章发酵液预处理 ●发酵液预处理目的 1.便于固液分离 黏度大的悬浮液，不宜过滤 目标产物在发酵液中的浓度通常较低 成分复杂，固体粒子可压缩性大，悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大 2.除去部分杂质和改变发酵液的过滤性能 ●发酵液预处理的内容： 1.发酵液杂质的去除，包括除去蛋白质、无机离子、色素、热原、毒性物质等； 2.改善培养液的处理性能，主要是通过降低黏度、调节适宜的pH值和温度、絮凝和凝聚等操作来实 现。 无机离子的去除 高价无机离子，如Ca2+、Mg2+、Fe3+等的存在，会影响离子交换树脂对生物活性物质的交换容量。 1.钙离子的去除 ?加入草酸，生成草酸钙，沉淀去除。 ?草酸与镁离子结合生成草酸镁，去除Mg2+ ?草酸酸化发酵液，改变其胶体状态，有助于目标产物转入液相。 ?在用量大时，可用其可溶性盐。 ?反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。 2.镁离子的去除 ?可加入三聚磷酸钠，形成络合物。 ?还可用磷酸盐处理，大大降低钙和镁离子。 3. 铁离子的去除 ?一般用黄血盐去除，形成普鲁士蓝沉淀。 可溶性蛋白质的去除 ?杂蛋白的存在，对分离纯化会产生三种影响 –降低离子交换法和大网格树脂吸附法的树脂吸附能力 –在用有机溶剂或双水相萃取时，会产生乳化现象； –常规过滤及膜过滤，会污染滤膜。 ?去除方法主要有：盐析法、等电点沉淀法、加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法、其他沉淀法。 盐析法 水溶性蛋白质溶液是亲水胶体体系，其分子与水有很大的亲和力。 水化层和双电层是胶体体系稳定的必要条件。 离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果比较好，含高价离子的盐比1-1价型盐的盐析效果好。 硫酸铵是使用最普遍的盐，硫酸钠和氯化钠也常用于盐析。 等电点沉淀法 在等电点状态时，所带电荷为0。处于等电点时，蛋白质分子之间的静电排斥力最小，使它失去了作为胶体体系稳定的基本因素，迅速结合成聚集体，极易沉淀析出。 等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行。 等电点沉淀法一般多用于疏水性较大的蛋白质。 与盐析沉淀法相比，等电点沉淀省去了后续的脱盐操作。 有机溶剂沉淀法 ?有机溶剂的加入，使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，即破坏蛋白质胶体的 水化膜，同时也可降低溶液的介电常数，导致蛋白质分子间的静电引力增大，产生凝聚和沉淀。 ?在低离子强度和等电点附近，较易生成沉淀，所需有机溶剂用量较少 ?蛋白质分子量越大，有机溶剂沉淀越易进行，所需有机溶剂用量越少 ?由于有机溶剂易引起目标蛋白变性，沉淀必须在低温下进行。只适用于处理量较少的情况。 吸附法 ?杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。 ?利用黄血盐和硫酸锌的协同作用，生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质，应用于四环素类抗生素的生产中。 发酵液处理性能的改善 1.降低发酵液的黏度 ?降低液体黏度可提高过滤速率。 ?常用方法有加热法和加水稀释法。 2. 调节pH值 ?pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可改善其过滤特性。 3. 絮凝 采用细胞絮凝技术，可增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速率，再结合其他的预处理方法降低发酵液黏度，就能采用普通过滤方法，简单有效地实现固液分离。 絮凝和凝聚的区别 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。凝聚是指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低（或由于微粒所带电荷被加入的带有相反电荷的高价离子中和），而使胶体体系不稳定，微粒互相黏着在一起的现象。 细胞絮凝的种类 按是否添加絮凝剂分为两类： （1）自身絮凝 酵母细胞产生絮凝，由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露聚糖结合所引起。 （2）絮凝剂絮凝： 从化学结构看，主要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂和表面活性剂。 根据活性基团在水中解离情况，可分为非离子型、阴离子型（含羧基）和阳离子型（含胺基）。 ●高聚物絮凝剂具有长链状的结构，利用长链上的活性基团，通过静电引力，形成桥架连接，从而生成 菌团沉淀。 ●微生物絮凝剂：微生物在代谢过程中所分泌的特殊的高分子产物，能使液体中不易沉降的固体颗粒、 菌体细胞及胶体粒子等凝集沉降。主要成分是多糖、糖蛋白、蛋白质和核酸。壳聚糖就是其中一种。 ●蛋白质为主的絮凝剂对温度变化敏感，多糖组成的絮凝剂则热稳定好。 絮凝机理与动力学 絮凝机理：（1）胶体理论（2）高聚物架桥理论（3）双电层理论 絮凝动力学 ?絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅拌应剧烈些；絮凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅拌速率应降低。 ?增加颗粒（细胞）的浓度，有利于聚并絮凝。 ?加大搅拌，增加速率梯度，有利于颗粒聚并；但搅拌速率过大时，剪切力会导致絮凝体破裂。 絮凝的优化 影响絮凝效果的因素： 1)絮凝剂浓度：浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使 絮凝团的粒径变小 2)絮凝剂分子量：分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量不能超过一定的限度，因为 随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量的选择应适当。 3)絮凝剂类型： 4)溶液的pH：溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度 增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。 5)搅拌速度和时间 6)助凝剂 思考题 ?为什么要进行发酵液预处理？处理的目标及内容分别是什么？ ?发酵液金属离子的去除方法分别有哪些？杂蛋白去除的方法和机理分别是什么？ ?发酵液处理性能的改善有哪些方法？ ?有哪些絮凝剂可以使用？ ?影响絮凝效果的因素？ 第三章固液分离技术 固液分离的方法 有分离筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤等。用于发酵液固液分离的主要是离心和过滤 1. 过滤：利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分离的方法。 ?深层过滤 深层过滤所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭和塑料颗粒等，过滤介质填充于过滤器内形成过滤层。过滤介质起主要作用。适用于固体含量少于1g/L、颗粒直径在5-100μm的悬浮液。 ?滤饼过滤 滤饼过滤的过滤介质是滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被阻拦形成滤饼，滤饼起主要过滤作用。适用于固体含量大于1g/L的悬浮液。 按过滤推动力的不同，滤饼过滤又分为常压过滤、加压过滤和真空过滤三类。 过滤理论 （1）过滤速率：单位时间内通过过滤面积的滤液体积，又称滤液的透过速率。 （2）滤饼阻力 ?发酵液过滤的滤饼比阻与一般的可压缩滤饼不同。当滤饼中所含固形物浓度达到一定的界限时，比阻会突然升高，过滤速率会迅速下降，甚至不能过滤。 ?对于不可压缩性滤饼，比阻值为常数。但对于可压缩性滤饼滤饼的比阻值是α，是操作压力差的函数，随操作压力差的提高而增大的。因此开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地逐步地升高压力。 过滤速率的影响因素 影响过滤速率的因素主要有两个： （1）过程的推动力 ?真空过滤最大真空度一般在85kPa以下； ?加压过滤的压力差一般在500kPa以下。 （2）过滤阻力 ?与悬浮液的性质有关，黏度越大越不利于过滤 ?与过滤介质和滤饼的性质有关，滤饼阻力是由菌种和发酵条件决定。 改善过滤性能的方法 （1）絮凝 （2）加助滤剂：助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒。工业上常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、白土、炭粒、淀粉等。助滤剂可预先涂在过滤介质表面;厚2mm;也可直接加入发酵液中，用量约等于悬浮液中固体含量，滤速最快。助滤剂的种类应根据目标产物、过滤介质来确定，粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺 寸相适应。 （3）加入反应剂 ?加入不影响目标产物的反应剂； ?反应剂之间能互相或能和发酵液中的杂质反应，生成不溶性沉淀，从而那你呢提高过滤速率。 ?如果发酵液中含有不溶性多糖，过滤前最好用酶将其转化为单糖。 过滤设备及选择 常用的过滤发酵液的设备主要有板框过滤机、加压叶滤机和鼓式真空过滤机三类。 膜过滤和微滤 ?膜分离是利用具有一定选择透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化，过程的实质是物质通过膜传递速率不同而得以分离，过程近似于筛分。 ?经预处理的发酵液为悬浮液，可使用微滤进行固液分离 离心原理 依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程。适用于两相密度差较小，颗粒粒度较细，在重力场中的沉降效率很低的非均相体系。 区带离心：可分为差速区带离心和平衡区带离心。 两种区带离心的共同之处是：离心之前要先用某种低分子量溶液（如蔗糖溶液）调配好密度梯度，然后将待处理的料液加在已形成密度梯度的溶液之上，进行离心。 平衡区带离心与差速区带离心的不同之处：其密度梯度比差速区带离心的密度梯度大。离心操作后，料液中的高分子溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质浓度以该处密度为中心，呈高斯分布。 思考题 1. 固液分离的方法有哪些？其原理分别是什么？ 2. 生物产业过滤和离心分离常用的设备是什么？ 3. 改善过滤过程的方法有哪些？ 第四章细胞破碎和分离提取技术 细胞破碎技术：利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。 ●机械方法破碎：包括珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波法等。 优点： a)处理量大，速度快，时间短，效率高，是工业规模细胞破碎的重要手段。 b)细胞受到挤压、剪切和撞击作用。 c)机械搅拌产生热量，破碎需冷却。 （1）珠磨法 细胞悬浮液与极小的研磨剂［如玻璃小珠、石英砂、氧化铝（d＜1mm）］一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物。 优点：操作简便稳定、破碎率可以控制、易放大。特别适用于有大量菌丝体的微生物和一些有质地坚硬亚细胞器的微生物。 （2）高压匀浆法 利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲撞造成细胞破裂。在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和从高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。 优点：操作参数少，且易于稳定；操作时样品损失量少，适用于酵母和大多数细胞。 ●对于易堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不适用。含有包涵体的 基因工程菌也不宜该设备。 （3）超声波破碎法 原理：利用频率高于20kHz的超声波在水中传播，产生能释放巨大能量的激化和突发，即空穴作用。 空穴作用产生的空穴泡由于受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个高达数百个大气压的冲击力压力，由此引起悬浮细胞上产生剪切力，使细胞液体产生流动而破碎细胞。 优点：处理少量样品操作方便，液体损失量少，破碎率高。 缺点：有效能量利用率极低，产生大量的热，操作需在冰水中进行或通入冷却剂，不易放大，不适于大规模操作，实验室小规模破碎常用。 细胞物理破碎方法 (1)渗透压冲击法 先将细胞放在高渗介质中，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入低渗溶液中。由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而将产物释放出来。 ●适用于破碎易破细胞或细胞壁预先经酶处理的细胞，以及合成受抑制而强度减弱的细胞 (２)冷冻-融化法 通过水结晶的形成和随后的融化而使细胞破碎的方法。 细胞化学法破碎 （1）碱处理： pH11.5-12.5碱处理细胞20-30min可导致细胞溶解。 ●易破坏蛋白的活性，使蛋白失活。 (2)酸热法 利用盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和蛋白）的水解作用，改变其空间结构，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，同时经沸水浴处理，造成细胞膨胀并加速水解，破坏胞壁结构，使得内含物释放。 化学试剂法 (1) EDTA EDTA可处理革兰氏阴性菌（E.coli），对细胞的外层膜有破坏作用。处理其它革兰氏阴性菌，可提高通透性。 (2)有机溶剂法 异丙醇处理酵母细胞释放超氧化物歧化酶。 (３)表面活性剂 表面活性剂或多或少地溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞渗透作用增强。 生物破碎法:利用酶反应分解、破坏细胞壁上特殊的化学健而达到破壁的目的，又称酶溶法。常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等 ●溶菌酶对细菌类细胞有效，主要是革兰氏阳性菌 超临界细胞破碎技术 超临界流体是指温度和压力处于临界条件之上的流体，它具有类似于气体的低黏度和类似于液体的高密度，有较好的流动性、传质性能和溶解性能。 选择性释放目标产物的一般原则 ⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破 碎程度。 思考题 ? 1. 珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法分别是什么原理？常用什么设备？ ? 2. 选择破碎方法的原则？ ? 3.酶溶法的原理是什么？对细菌和酵母分别常用什么酶？ 革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。 但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶。 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。 细胞破碎后，细胞碎片的分离是一个难题，以下为细胞碎片分离的有效方法。 双水相分离技术 因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。 双水相萃取的特点： ?具有特殊的物理性质：含水量高（75%-90%），两相界面张力极低（10-7-10-4mN/m），相间密度差低，这有助于保持生物活性和强化相间的物质传递。 ?分相时间短（5-15min） ?萃取环境和条件温和 ?生物相容性好，有时有稳定作用 ?分配系数可控，容易放大 ?大量杂质能够与固体物质一起去除 缺点和不足 ?双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法 ?成本较高。 ?选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离 具体操作： ?萃取：适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。 ?上下相的分离：在萃取达到平衡后，就必须使上下相分离。有两种方法：重力沉降和离心分离。 ?多聚物的分离：当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中（细胞或细胞碎片全部分配在下相中，只有目标产物分配在上相中），相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。 膨胀床分离技术 膨胀床吸附技术（EBA或EB）,亦称扩张床吸附。膨胀床吸附集澄清、浓缩和初步纯化于一体的分离纯化技术，它兼具流化床和填充床吸附的优点，既能比较容易地让固体颗粒通过填料层，又可以填充床的模式来吸附目标产物。 膨胀床的操作按顺序可分为五个部分:(1)平衡、(2)吸附、(3)冲洗、(4)洗脱和(5)在位清洗。 泡载分离技术 泡载分离又称为泡沫分离，根据表面吸附的原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体，对液相中的溶质或颗粒进行分离。待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂) ?泡沫分离的优点：1）特别适合于对低浓度的产品进行分离；2）分辨率高，可浓缩表面活性高的成分；3）富集率高；4）运行成本低；5）操作简便。 ?缺点：表面活性剂难以回收，消耗量大，返混现象影响分离效率，稳定性差，浓度难以控制。 思考题 ? 1.双水相去除细胞碎片分离目标产物的原理和一般过程？ ? 2.膨胀床的概念？膨胀床吸附分离的特点和原理是什么？一般的操作过程？ ? 3.何谓泡沫分离技术？其原理是什么？ ? 4.比较双水相分离技术、膨胀床分离技术和泡沫分离技术的优缺点。 第六章沉淀和膜分离技术 沉淀分离技术（主要包括有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。） ●沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。 优点：过程简单，成本低，原料易得，便于小批量生产，在产物浓度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高 缺点：过滤困难，对于复杂产品体系，分离度不高，产品质量较低，需重新精制。 主要包括有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。 ●沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液各种成分的溶解度，根据不同物 质在溶剂中溶解度不同而达到分离的目的。 有机溶剂沉淀法的原理：有机溶剂沉淀是指在溶液中加入极性有机物（如甲醇、乙醇、丙醇等），使溶质从溶液中沉淀析出，达到分离的目的。 有机溶剂沉淀法机理 A降低溶剂介电常数（介电常数D有机< D水），使蛋白质或酶分子间静电引力增大，因相互吸引而聚合沉淀。 B破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀。 C疏水基团暴露：有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使疏水集团暴漏。 有机溶剂沉析剂选择依据： 水溶性要好、介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中、容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 有机溶剂沉淀法的影响因素 温度：有机溶剂沉淀一定要在低温下进行 pH值 样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.5－2％为好，多糖则以1－2％较合适。 中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.01－0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等 优点在于： 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）沉淀不用脱盐； 缺点是： 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 2）操作要求在低温下进行。 3）成本高 4）易燃溶剂 盐析沉淀法 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析法机理 （1）破坏水化膜：将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围 的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）中和电荷，减少静电斥力：中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果： PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子 蛋白质溶解度与盐浓度的关系 ㏒S=β-ＫsＩ β和Ks的物理意义 β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。 用盐析法分离蛋白质的二种方法 第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。 盐析的影响因素 pH值为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白等电点处 温度在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。（β随温度升高减小，热促失水膜Ks不随温度而变）蛋白质浓度，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 盐析法特点： 1. 成本低，不需要特别昂贵的设备。 2. 操作简单、安全。 3. 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 4. 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 高聚物沉淀（非离子性聚合物(PEG)：是一种水溶性的高分子聚合物） 机理：这些亲水性高分子上有许多可结合水分子的羟基，加入后结合自由水分子，破坏蛋白质的水化膜。 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难回收，成本高 思考题 常用的沉淀方法包括哪些？ ?有机溶剂沉淀法的原理是什么？ ?影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ ?何谓盐析？其原理是什么？ ?何谓“Ks”分级盐析法？何谓“β”分级盐析法？ ?常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ ?高聚物沉淀的原理是什么？常用的高聚物是什么？ 第十一章电泳分离技术 电泳：指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳技术：利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称。 等电聚胶电泳（IFE）：分离蛋白质 以特殊的两相电解质为载体，在外加电场的作用下形成PH梯度场，具有特定等电点的蛋白质在PH梯度场中形成蛋白质区带，从而得到蛋白质组分。分辨率高，分离效率高，但两性电解质价格昂贵，只能一次性使用，成本较高 一、电泳的基本原理 当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。 影响电泳速度的相关因素 ?颗粒性质带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。 ?电场强度E愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 ?溶液性质 pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度加大，电流加大，泳动速度加快;泳动速度与溶液黏度成反比。 ?电渗（P225）是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 ?焦耳热电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率(即电泳谱带的展宽和组分的热混和)，严重时甚至烧断或熔化支持介质。 筛孔在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。 聚丙烯酰胺凝胶： 分离效果比琼脂糖好，适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高 由丙烯酰胺通过交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联形成三维网状结构 特性：机械性能，弹性，透明度，黏着度，孔径大小 两个单体总百分浓度：T=(a+b)/m×100% 与总浓度有关的交联百分浓度：C=b/(a+b)×100% A为丙烯酰胺的质量，g；b为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺质量，g；m为水或缓冲溶液的终体积，mL a:b<10，则凝胶脆，硬，呈乳白色 a:b>100，T=5%，则凝胶呈糊状 a:b在30左右，凝胶富有弹性、且完全透明 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度T，有效孔径随T的增加而降低。 当T<2.5%，可以筛分相对分子质量为106以上的大分子，T>30%，可以筛分相对分子质量小于2kDa的多肽。 聚合引发剂：过硫酸铵和核黄素等；增速剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，3-二甲胺乙腈 丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：对中枢神经有毒 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ） 一、基本原理 ?以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点及分子构型(P227)。 缓冲体系的选择 ?PH值的选择：从理论上来说，聚丙烯酰胺凝胶电泳可在各种PH值中进行。但实际上在过酸或过碱的条件下将发生某种水解反应，所以PH值应限制在3-10间。为保持天然蛋白质的生物活性，PH范围可能更窄。有三种不连续系统可选用：高PH值系统（PH9.5，PH8.9）;中PH值系统（PH8.0）；低PH值系统（PH5.5，PH4.9,PH3.6） ?离子强度的选择：一般使用较低离子强度，因为此时导电性低，产热较少，同时可被分离的带点颗粒对电流的贡献最大，从而加快电泳速度。但它必须能够缓冲被分离样品中带点颗粒对凝胶PH值的影响，所以不可过低，且蛋白质在过低的磷脂强度下凝聚。一般0.01-0.1mol/L,最常用0.05mol/L 凝胶浓度选择 凝胶浓度太大，孔径小于样品分子的尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，电泳后样品仍在加样位置。凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲溶液流向前推进而不能得以很好地分离 ? 能把较稀的样品通过大孔径凝胶的迁移作用而使样品在进入分离胶前被浓缩至一个狭窄的区带中 分离胶，又称电泳胶。孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好地分离 两者主要区别在于孔径和PH值，但常使用相同的缓冲系统。前者用PH6.8的Tris-HCl，后者用PH9.0的Tris-HCl。前者凝胶浓度常用4%，后者根据被分离样品而定 ? 单组分的样品分离 梯度胶：分离胶部分由一定的浓度梯度组成，可以是线性梯度，也可以是指数梯度。通常从阴极到阳极，浓度梯度逐渐增大，孔径变小（阴极电压相反），利用分子筛作用提高分辨率，适合于复杂样品的分离 染色方法：蛋白染色：考马斯亮蓝；银染色方法（灵敏100倍） 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。 3. 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应 ?凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 ?大分子在凝胶中的分离是受其电荷、大小、和形状因素的影响。 ?凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力，故将此现象称为分子筛效应。 三.不连续凝胶电泳的分离原理 （一）原理 系统的不连续性表现在以下几个方面： ?凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 ?缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 ?电位梯度的不连续性 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 1. 浓缩效应 ?电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为低电导区。 ?电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。 ?蛋白质和慢离子在快离子后加速移动。 ?当快离子和慢离子移动速度相同时，在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。 ?样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩300多倍）。 浓缩胶为大孔径（烯） T＜5％，分离胶一般为小孔径（浓）T﹥7.5％。样品在浓凝胶中移动快，当进入分离胶时受到较大阻力，移动速度减慢。因而，在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带，得到浓缩。然后，再依据分子量大小和电荷性质进行电泳分离。 2.分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强度消失。故蛋白质分子在均一的电压梯度和pH 值条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子量的大小而分开。 3.电荷效应 蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按电荷顺序排列，从而导致分离。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 在聚丙烯酰胺凝胶中加入去污剂和还原剂（如SDS），蛋白质电泳迁移率主要取决于分子量的大小，而蛋白质的电荷因素可以忽略 ?SDS是一种阴离子表面活性剂，可与蛋白质分子结合,形成SDS-蛋白质复合物。 ?在强还原剂巯基乙醇存在下,能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂,形成蛋白质亚基。 ?SDS-PAGE是目前用于测定蛋白质亚基分子量的一种最好的方法。 一、基本原理（P228） 在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，它们与SDS充分结合形成带负电荷的SDS－蛋白质复合物，所带的电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子原有的电荷差异。电泳的迁移率不再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子量大小有关。 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能通过断裂分子内和分子间的氢键，使分子失去折叠，从而破坏蛋白质分子的二级和三级结构。巯基乙醇和二硫苏糖醇等还原剂则能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，可把分子解聚成多肽。由SDS与解聚后的氨基酸侧链充分结合形成的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这使得不同分子之间原有的电荷差异减少。这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，主要取决蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的相对分子质量在15-200kDa时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 所以，SDS电泳不仅可分离蛋白质，还可以定量测定蛋白质亚基的相对分子质量 lgM= a - bR f 影响SDS-蛋白质结合的因素（P228） 1.溶液中SDS单体的浓度：单体浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，当SDS 总浓度增加到一定时，溶液中单体浓度不再随SDS总浓度的增加而升高。为了保证蛋白质与SDS充分结合，质量比为1:4或1:3 2.样品缓冲液的离子强度：只有在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度 3.二硫键是否完全被还原：只有二硫键被彻底还原使得蛋白质分子彻底解聚后，SDS才能定量结合到亚基上而给出相对迁移率和相对分子质量对数的线性关系 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 ?等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF ?利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 ?利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。 ?根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度和固定化PH值梯度。 ?前者是通过电场中两性缓冲电解质建立PH值梯度，后者是将缓冲基团固定化在凝胶介质上建立PH 值梯度。后者比前者分辨率高 ?将两种介质结合在一起，即在固定化PH值梯度介质中加入载体两性电解质，屏蔽蛋白质表面的疏水基团，明显增加了蛋白质的溶解度，同时载体两性电解质导电性加强，缩短了电泳时间 原理 ?蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectric point pI）。 ?蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。 ?可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析 载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理 载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。 载体两性电解质和pH梯度的形成 ?等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 ?载体两性电解质的概念： 作为载体两性电解质应该具有以下特点： ?应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置； ?应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。 pH梯度的形成 ?在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。 ?当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。 ?其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。 等电聚焦的主要应用 在蛋白质的分离纯化中应用较多，特别是蛋白质组学的研究上，可制备少量纯化蛋白质。是目前测定 蛋白质等电点的标准方法 ?同工酶分离、分析 ?pI 测定 实际应用当中，等电聚焦的操作过程要复杂得多，具体内容可参考《蛋白质电泳实验技术》，作者：郭尧君，科学出版社。 双相电泳：双向PAGE，是在平板凝胶上由两个单项PAGE组合而成。在第一向电泳后，再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。 ?第一相等电聚焦 ?第二相 SDS－PAGE 目的：为了获得更详细的组分信息 目前已经广泛应用于蛋白质组研究中 两个常用的技术：IEF/SDS-PAGE双向电泳、IEF/PG-PAGE双向电泳 应用：低丰度蛋白质的检测、蛋白质检测和分析、蛋白质组学和代谢组学 本章作业 ? ?电泳的基本原理 ?电泳技术的分类 ?常用的凝胶电泳技术有哪些？ ?聚丙稀酰胺凝胶电泳与SDS-PAGE的异同 ?琼脂糖电泳的特点及其应用 ?等电聚焦电泳的基本原理 ?双相电泳的概念及其特点 《生物化学》绪论 生物化学可以认为是生命的化学，是研究微生物、植物、动物及人体等的化学组成和生命过程中的化学变化的一门科学。 生命是发展的，生命起源，生物进化，人类起源等，说明生命是在发展，因而人类对生命化学的认识也在发展之中。 20世纪中叶直到80年代，生物化学领域中主要的事件： （一）生物化学研究方法的改进 a. 分配色谱法的创立——快捷、经济的分析技术由Martin.Synge创立。 b. Tisellius用电泳方法分离血清中化学构造相似的蛋白质成分。吸附层析法分离蛋白质及其他物质。 c. Svedberg第一台超离心机，测定了高度复杂的蛋白质。 d. 荧光分析法，同位素示踪，电子显微镜的应用，生物化学的分离、纯化、鉴定的方法向微量、快速、精确、简便、自动化的方向发展。 （二）物理学家、化学家、遗传学家参加到生命化学领域中来 1． Kendrew——物理学家，测定了肌红蛋白的结构。 2． Perutz——对血红蛋白结构进行了X-射线衍射分析。 3． Pauling——化学家，氢键在蛋白质结构中以及大分子间相互作用的重要性，认为某些protein具有类似的螺旋结构，镰刀形红细胞贫血症。 （1．2．3．都是诺贝尔获奖者） 4．Sanger―― 生物化学家 1955年确定了牛胰岛素的结构，获1958年Nobel prize化学奖。1980年设计出一种测定DNA内核苷酸排列顺序的方法，获1980年诺贝尔化学奖。 5．Berg―― 研究DNA重组技术，育成含有哺乳动物激素基因的菌株。 6．Mc clintock―― 遗传学家发现可移动的遗传成分，获1958年诺贝尔生理奖。 7．Krebs―― 生物化学家 1937年发现三羧酸循环，对细胞代谢及分生物的研究作出重要贡献，获1953年诺贝尔生理学或医学奖。 8．Lipmann―― 发现了辅酶A。 9． Ochoa——发现了细菌内的多核苷酸磷酸化酶 10．Korberg——生物化学家，发现DNA分子在细菌内及试管内的复制方式。（9．10．获1959年的诺贝尔生理医学奖） 11．Avery―― 加拿大细菌学家与美国生物学家Macleod,Carty1944年美国纽约洛克菲勒研究所著名实验。肺炎球菌会产生荚膜，其成分为多糖，若将具荚膜的肺炎球菌（光滑型）制成无细胞的物质，与活的无荚膜的肺炎球菌（粗糙型）细胞混合 －>粗糙型细胞也具有与之混合的光滑型的荚膜－>表明，引起这种遗传的物质是DNA 1 / 29 题库名称:生物分离技术 一、名词解释 1.质量作用定律:化学反应得速率与参加反应得物质得有效质量成正比。 2.凝聚:在电解质作用下,破坏细胞菌体与蛋白质等胶体粒子得分散状态,使胶体粒子聚集得过程。 3.分配系数:在一定温度、压力下,溶质分子分布在两个互不相溶得溶剂里,达到平衡后,它在两相得浓度为一常数叫分配系数。 4.干燥速率:干燥时单位干燥面积,单位时间内漆画得水量。 5.CMSephadex C50:羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂,吸水量为每克干胶吸水五克。 6.絮凝:指在某些高分子絮凝剂存在下,在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大得絮凝团得过程 7.过滤:就是在某一支撑物上放过滤介质,注入含固体颗粒得溶液,使液体通过,固体颗粒留下,就是固液分离得常用方法之一。 8.萃取过程:利用在两个互不相溶得液相中各种组分(包括目得产物)溶解度得不同,从而达到分离得目得 9.吸附:就是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附得能力,使其富集在吸附剂表面得过程。 10.反渗析:当外加压力大于渗透压时,水将从溶液一侧向纯水一侧移动,此种渗透称之为反渗透。 11.离心沉降:利用悬浮液或乳浊液中密度不同得组分在离心力场中迅速沉降分层,实现固液分离 12.离心过滤:使悬浮液在离心力场作用下产生得离心力压力,作用在过滤介质上,使液体通过过滤介质成为滤液,而固体颗粒被截留在过滤介质表面,从而实现固液分离,就是离心与过滤单元操作得集成,分离效率更高 13.离子交换:利用离子交换树脂作为吸附剂,将溶液中得待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适得洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离得目得。 14.固相析出技术:利用沉析剂(precipitator)使所需提取得生化物质或杂质在溶液中得溶解度降低而形成无定形固体沉淀得过程。 15.助滤剂:助滤剂就是一种具有特殊性能得细粉或纤维,它能使某些难以过滤得物料变得容易过滤 16.沉降:就是指当悬浮液静置时,密度较大得固体颗粒在重力得作用下逐渐下沉,这一过程成为沉降 17.色谱技术:就是一组相关分离方法得总称,色谱柱得一般结构含有固定相(多孔介质)与流动相,根据物质在两相间得分配行为不同(由于亲与力差异),经过多次分配(吸附解吸吸附解吸…),达到分离得目得。 18.有机溶剂沉淀:在含有溶质得水溶液中加入一定量亲水得有机溶剂,降低溶质得溶解度,使其沉淀析出。 19.等电点沉淀:调节体系pH值,使两性电解质得溶解度下降,析出得操作称为等电点沉淀。 20.膜分离:利用膜得选择性(孔径大小),以膜得两侧存在得能量差作为推动力,由于溶液中各组分透过膜得迁 移率不同而实现分离得一种技术。 21.化学渗透破壁法:某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或细胞膜得通透性,从而使胞内物质有选择地渗透出来。 22.超临界流体:超临界流体就是状态超过气液共存时得最高压力与最高温度下物质特有得点——临界点后得流体。 23.临界胶团浓度:将表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团得最小浓度称为临界胶团浓度,它与表面活性剂种类有关。 24.反渗透:在只有溶剂能通过得渗透膜得两侧,形成大于渗透压得压力差,就可以使溶剂发生倒流,使溶液达到浓缩得效果,这种操作成为反渗透。 25.乳化液膜系统:乳化液膜系统由膜相、外相与内相三相组成,膜相由烷烃物质组成,最常见得外相就是水相,内相一般就是微水滴。 26.树脂工作交换容量:单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附得一价离子得毫摩尔数称为树脂交换容量,在充填柱上操作达到漏出点时,树脂所吸附得量称为树脂工作交换容量。 27.色谱阻滞因数:溶质在色谱柱(纸、板)中得移动速率与流动相移动速率之比称为阻滞因数,以Rf表示。 28.胶团:两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成得,内含微小水滴得,空间尺度仅为纳米级得集合型胶体。 29.膜得浓差极化:就是指但溶剂透过膜,而溶质留在膜上,因而使膜面浓度增大,并高于主体中浓度。 30.超滤:凡就是能截留相对分子量在500以上得高分子膜分离过程称为超滤,它主要就是用于从溶剂或小分子溶质中将大分子筛分出来。 31、生物分离技术:就是指从动植物与微生物得有机体或器官、生物工程产物(发酵液、培养液)及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质得技术过程。 32、离心分离技术:就是基于固体颗粒与周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度得固体颗粒加速沉降得分离过程。 33.物理萃取:即溶质根据相似相溶得原理在两相间达到分配平衡,萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 34.化学萃取:则利用脂溶性萃取剂与溶质之间得化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相得分配。 35.盐析:就是利用不同物质在高浓度得盐溶液中溶解度得差异,向溶液中加入一定量得中性盐,使原溶解得物质沉淀析出得分离技术。 2009级《生物分离工程》复习内容提要 第一章绪论：重点节：第二节、第三节 1、生物分离工程的一般流程Page4 2、生物分离纯化工艺过程的选择依据Page5 3、生物分离过程的特点Page6 第二章发酵液的预处理：重点节：第一节 1、发酵液的一般特性Page9 2、发酵液预处理的要求Page10-11 3、发酵液预处理的方法Page11-16 4、凝集&絮凝Page11-12 5、转筒真空过滤机的结构和工作原理Page27-28 第三章细胞分离技术：重点节：第二节 1、差速离心&密度梯度离心Page31 2、比较不同细胞破碎方法（机械法、化学法、物理法和酶溶法）的原理和优缺点Page34-39 3、比较珠磨法、高压匀浆法和超声波细胞破碎法的优缺点Page34-36 4、细胞破碎的方法主要有哪些？选择破碎方法时应考虑哪些因素？（自己总结） 5、蛋白质复性及其主要复性方法（稀释与透析、色谱、反胶束）Page41-45 第四章沉淀技术：重点节：第三节 1、盐析的原理Page51 2、K s和β分级盐析法Page52 3、什么是饱和度？盐析沉淀操作曲线的制作实验步骤Page54 4、盐析操作计算Page53-54 5、主要的沉淀方法（盐析、有机溶剂、等电点、变性沉淀等）及其优缺点比较Page27-28 第五章萃取技术：重点节：第二节（二）、第三节（二、三）、第四节（一、二、四）、第六节（一、二）、第八节（一、二、三、四） 1、萃取分配系数、相比、萃取分离系数Page65 2、单级萃取、多级逆流萃取、多级错流萃取理论收率和萃余率的计算Page67-70 3、物理萃取&化学萃取Page72-73 4、水相条件如何影响有机溶剂萃取过程Page73-74 5、有机溶剂萃取剂的选择原则Page74 6、解释双水相相图Page81 7、常用的双水相系统有哪些？Page80-81 8、什么是道南电位Page82，试述道南平衡理论在双水相萃取、纳滤膜分离机制和离子交换 树脂分离机制解释中的应用。（自己总结） 9、影响双水相分配系数的主要因素有哪些？Page83-84 动物考古整理 第一部分 动物考古概论 一、什么是动物考古? 定义:动物考古是研究考古遗址出土动物遗存的学科,其主要目标是理解人类与其所处环境之间的关系,尤其是人类与其他动物种群之间的关系。 二、命名 ? 民族:混血(交叉学科) ? 家庭成员(血统):考古学、动物学、人类学、生态学、埋藏学、地理学、历史学 三、研究材料 ? 研究内容 ：骨骼、牙齿、角、蛋壳、毛发、羽毛、鳞片、昆虫、寄生虫、虫卵、粪便、血迹、鞭虫卵、DNA、稳定同位素、微量元素 四、动物考古可以告诉我们什么 ? 史前年代序列（动物群的构成、绝灭种） ? 复原古环境和古气候 （生物学、生态学） ? 遗址的形成过程（埋藏学） ? 取食方式（狩猎?食腐?）/生业经济模式（狩猎采集/畜牧/农业、动物驯化和家畜的出现、食物构成、食物的加工方式、消费模式 ） ? 动物驯化与“次级产品”的利用（毛、乳品、血 、畜力） ? 社会层面（仪式、葬俗、祭祀、占卜、宠物、社会分层、交换与贸易） ? 手工业（骨角器、艺术品、装饰品） 五、动物考古研究的流程 ? 材料获取:取样 – 手选à 较大的标本 – 筛选:小动物,资料有效保存,更多信息 ? 记录 ? 鉴定与观测（种属、部位、年龄、性别、骨骼保存情况:完整/破碎、破碎模式） –测量 鉴定很重要，分析和研究更重要 六、动物考古学简史 ? 欧美:开始、形成、发展、成熟四个阶段 ? 19世纪：开始期 – 人们对动物遗骸的关注几乎与考古学同时,发现一些燧石工具与绝灭动物共存。18世纪达尔文进化论和地质学、地层学的发展使人们认识到石器所代表 的人类文化比圣经记载的历史早得多。 – 以绝灭动物为“标准化石”，根据人类留下的遗物形状与共出的动物群的种类 选择题： 1．HPLC是哪种色谱的简称（）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（）。 A.凝胶过滤 B.离子交换层析 C.亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（） A.蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C.比活力最高 D.Km最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 8．适合小量细胞破碎的方法是（） 高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 9．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH 到等电点 10．蛋白质分子量的测定可采用（）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C.凝胶层析 D.聚酰胺层析 11．基因工程药物分离纯化过程中，细胞收集常采用的方法（） A．盐析 B.超声波 C.膜过滤 D.层析 12．离子交换剂不适用于提取（）物质。 A．抗生素 B.氨基酸 C.有机酸 D.蛋白质 13．人血清清蛋白的等电点为4.64，在PH为7的溶液中将血清蛋白质溶液通电，清蛋白质分子向（） A ：正极移动；B：负极移动；C：不移动；D：不确定。 14．蛋白质具有两性性质主要原因是（） A：蛋白质分子有一个羧基和一个氨基；B：蛋白质分子有多个羧基和氨基；C：蛋白质分子有苯环和羟基；D：以上都对 15．使蛋白质盐析可加入试剂（） A.氯化钠； B.硫酸； C.硝酸汞； D.硫酸铵 16．凝胶色谱分离的依据是（）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 17．非对称膜的支撑层（）。 A、与分离层材料不同 B、影响膜的分离性能 C、只起支撑作用 D、与分离层孔径相同 18．下列哪一项是强酸性阳离子交换树脂的活性交换基团（） A 磺酸基团（-SO3 H） B 羧基-COOH C 酚羟基C6H5OH D 氧乙酸基-OCH2COOH 19．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（）。 A、Fe3+﹥Ca2+﹥Na+ B、Na+﹥Ca2+﹥Fe3+ C、Na+﹥Rb+﹥Cs+ D、Rb+﹥Cs+﹥Na+ 20．乳化液膜的制备中强烈搅拌（）。 第一篇生物大分子的结构与功能 第一章氨基酸和蛋白质 一、组成蛋白质的20种氨基酸的分类 １、非极性氨基酸 包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸 ２、极性氨基酸 极性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸 其中：属于芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 属于亚氨基酸的是：脯氨酸 含硫氨基酸包括：半胱氨酸、蛋氨酸 注意：在识记时可以只记第一个字，如碱性氨基酸包括：赖精组 二、氨基酸的理化性质 １、两性解离及等电点 氨基酸分子中有游离的氨基和游离的羧基，能与酸或碱类物质结合成盐，故它是一种两性电解质。在某一ＰＨ的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的ＰＨ称为该氨基酸的等电点。 ２、氨基酸的紫外吸收性质 芳香族氨基酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰，由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，氨基酸残基数与蛋白质含量成正比，故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。 ３、茚三酮反应 氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。 三、肽 两分子氨基酸可借一分子所含的氨基与另一分子所带的羧基脱去１分子水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成多肽。10个以内氨基酸连接而成多肽称为寡肽；39个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称为多肽；51个氨基酸残基组成的胰岛素归为蛋白质。 多肽连中的自由氨基末端称为Ｎ端，自由羧基末端称为Ｃ端，命名从Ｎ端指向Ｃ端。 人体内存在许多具有生物活性的肽，重要的有： 谷胱甘肽（GSH）：是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。GSH的巯基具有还原性，可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中巯基免被氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。 四、蛋白质的分子结构 １、蛋白质的一级结构：即蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。 主要化学键：肽键，有些蛋白质还包含二硫键。 ２、蛋白质的高级结构：包括二级、三级、四级结构。 １）蛋白质的二级结构：指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链骨架原子的 管理心理学笔记整理 第一章管理心理学的对象、任务与方法 第一节管理心理学的对象 1、管理心理学的对象 一、管理心理学的定义：管理心理学是研究管理活动中人的个体与社会心理活动及行为规律， 用科学的方法改进管理工作，通过协调人际关系，满足员工需要，充分 调动人的积极性、主动性、创造性，来提高管理效率与效益的科学。二、管理心理学的研究对象主要是企业的内部结构系统。 生产与技术系统 企业的内部结构系统市场营销与公关系统 财务经济管理系统 人力资源管理与开发系统 研究与发展系统 现代企业的生产经营过程包括输入、转换与输出过程。 三、管理心理学研究对象的特点： 1、突出以人为中心的人本管理思想、机制与方法。 根据人的个体与社会心理规律、行为规律；运用动机与激励、竞争与压力、规范与约束、保证与保障、选择与培养、组织与团队环境影响等形成与建立有效的人本管理机制；通过尊重人、关心人、激励人、改善人际关系等方法，充分发挥人的积极性与创造性，从而提高劳动效率和管理效率。（主观能动性、生命的价值、生存的需要、团队意识、个人素质）2、在面临知识经济的到来，知识智力资本转化的过程中，智力资本作为企业组织的重要资 产，起着越来越重要的作用。 现代企业重视人力资源的重要性和人力资源管理与开发的理念，发挥人力资源的核心竞争力。 3、组织结构资本与人力资本是紧密联系并相互作用的。 强调员工的主体意识和主人翁精神，强调其主体地位。依靠员工个人、团体、组织和领导行为来实现企业目标。 4、关系资本（市场资本）作用的发挥，必须以人力资本为核心与结构资本形成良好的互动 关系。 内部人际关系、市场与公共关系、团队心理气氛、组织形象、文化建设。 2、管理心理学的内容范围 （一）人性假设与管理理论（基本理论，人性假设是管理理论的哲学基础） （二）关于个体心理研究（核心） 个体心理与行为研究的核心是激励及核心创造力问题，即如何调动员工的积极性、主动性、创造性的问题。他涉及个体的需要、动机、态度等；同时还涉及人的认识差异、能力差异、个性差异等问题。 《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术 生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。 第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂 第一章绪论 一、生物化学的的概念： 生物化学（biochemistry)是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学，它是介于化学、生物学及物理学之间的一门边缘学科。 二、生物化学的发展： 1．叙述生物化学阶段：是生物化学发展的萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。 2．动态生物化学阶段：是生物化学蓬勃发展的时期。就在这一时期，人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。 3．分子生物学阶段：这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。 三、生物化学研究的主要方面： 1．生物体的物质组成：高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成，此外还含有一些低分子物质。 2．物质代谢：物质代谢的基本过程主要包括三大步骤：消化、吸收→中间代谢→排泄。其中，中间代谢过程是在细胞内进行的，最为复杂的化学变化过程，它包括合成代谢，分解代谢，物质互变，代谢调控，能量代谢几方面的内容。 3．细胞信号转导：细胞内存在多条信号转导途径，而这些途径之间通过一定的方式方式相互交织在一起，从而构成了非常复杂的信号转导网络，调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。 4．生物分子的结构与功能：通过对生物大分子结构的理解，揭示结构与功能之间的关系。 5．遗传与繁殖：对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究，也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。 第二章蛋白质的结构与功能 一、氨基酸： 1．结构特点：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。 2．分类：根据氨基酸的R基团的极性大小可将氨基酸分为四类：①非极性中性氨基酸(8种)；②极性中性氨基酸(7种)；③酸性氨基酸(Glu和Asp)；④碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。 二、肽键与肽链： 肽键(peptide bond)是指由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基经脱水而形成的共价键(-CO -NH-)。氨基酸分子在参与形成肽键之后，由于脱水而结构不完整，称为氨基酸残基。每条多肽链都有两端：即自由氨基端(N端)与自由羧基端(C端)，肽链的方向是N端→C端。 三、肽键平面(肽单位)： 肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转；组成肽键的四个原子及其相邻的两个α碳原子处在同一个平面上，为刚性平面结构，称为肽键平面。 四、蛋白质的分子结构： 腔肠动物门珊瑚纲（一）四射珊瑚亚纲化石代表 Tachylasma Grabau，1922（速壁珊瑚）小型阔锥状单体，隔壁作四分羽状排列，对部隔壁较主部多。二个侧隔壁和二个对侧隔壁在内端特别加厚，形成棍棒状。主隔壁萎缩，主内沟明显。二级隔壁短，横板上凸，无鳞板。（图4-4，1） Hexagonaria Gurich，1896（六方珊瑚）复体块状，个体多角柱状。一级隔壁伸达中央，横板分化为轴部与边部，轴部横板近平或微凸（图4-4，2）。中一晚泥盆世。 Kueichouphyllum Yu，1931（贵州珊瑚）大型单体，弯锥柱状。一级隔壁数多，长达中心；二级隔壁长为一级的1/3—2/3。主内沟明显。鳞板带宽，鳞板呈同心状。横板不完整，向轴部升起（图4-4，7）。早石炭世。 Lithostrotion Fleming，1828（石柱珊瑚）复体多角块状或丛状。隔壁较长，具明显中轴。横板呈帐蓬状，有的在横板带的边缘有具水平的小横板。鳞板小，鳞板带一般较宽（图4-4，3）。早至晚石炭世。 Wentzellophyllum Hudson，1958（似文采尔珊瑚）复体块状，个体呈多角柱状，具蛛网状中柱。边缘泡沫带宽，泡沫板较小而数目多。横板向中柱倾斜，与鳞板带的界线不明显（图4-4，6）。早二叠世。 Calceola Lamarak，1799（拖鞋珊瑚）单体，拖鞋状，一面平坦，一面拱形。具半圆形萼盖。隔壁为短脊状，位于平面中央的对隔壁凸出。体内全为钙质充填，少数具稀疏上拱 的泡沫鳞板（图4-4， 10）。早—中泥盆世。 （二）横板珊瑚亚纲化石代表Cystiphyllum Lonsdale，1839（泡沫珊瑚）单体珊瑚，外形锥状或柱状。体内充满泡沫板。隔壁短刺状，发育于个体的周边部分及泡沫板上，泡沫板带与兆沫状横板带界线不清（图4-4，5）。志留纪。 无图Waagenophyllum 卫根珊瑚，复体丛状，个体圆柱状，具中柱，横板泡沫状，向中心陡倾，横板带窄。P Polythecalis(多壁珊瑚)，块状复体，个体多为不规则的多角状，外壁常部分消失。具边缘泡沫带，泡沫带内缘占隔壁相接处有明显的“内墙”，为隔壁加厚形成。中柱典型，边缘泡沫板凸度大，横板向中心下倾（图4-3，5）早二叠世。 Favosites Lamarck，1816（蜂巢珊瑚）各种外形的块状复体。个体多角柱状，体壁常见中间缝。联结孔分布在壁上（壁孔），具1—6纵列。隔壁呈刺状或瘤状（图4-4，11）。志留纪至泥盆纪。 Hayasakaia Lang Smith et Thamas，1940，emend Sokolov，1947（早坂珊瑚）复体丛状，由棱柱状或部份呈圆柱状个体组成。个体由联结管相联。联结管呈四排分布在棱上。横板完整或不完整，凸或倾斜状。边缘有连续或断续的泡沫带（图4-4，8）。晚石炭世至早二叠世。 第二章工业微生物基础 ●知识要点和教学要求 1）、了解微生物的特点 2）、了解常见的工业微生物 3）、掌握工业微生物菌种的分离和选育 4）、掌握工业微生物菌种的改良 5）、掌握工业微生物菌种的保藏 6）、掌握工业微生物菌种的扩大培养 ●能力培养要求 通过本章节的学习，学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法，以及菌种扩大培养的基本工艺。 ●教案内容 2.1微生物的特点 （1）种类多，分布广 目前已发现的微生物在10万种以上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式，能分解各式各样的有机物质和无机物质，当前国内外积极利用微生物来防治公害，分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另一方面，不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品，如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。 （2）高面积-体积比，代谢能力强 （3）生长迅速，繁殖快 （4）适应性强，容易培养 （5）易变性 2.2常见的工业微生物 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。 微生物工业的范围 微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系，涉及的范围十分广泛，而且越来越大，大致可分为下列14类： （1）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等） （2）食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等） （3）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等） （4）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等） （5）酶制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） （6）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等） （7）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） （8）核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等） （9）维生素发酵工业（维生素B2、维生素B12等） （10）生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等） （11）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等） （12）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等） （13）生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质） （14）微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等） 现代生物分离技术及其应用举例生物物质的分离（Bioseparation）是生物工程的一个重要部分。国外文献中，常称之为下游过程（Downstream Process），国内则称之为产品的分离或回收。其目的是把生物反应液，如发酵液或酶反应液内的有用物质分离出来，获得所需的目标成品。 不同的生物产物，其溶解度、分子大小、形状、极性、电荷性质、专一结合位点等理化和生物学性质有或大或小的差异，所以采用适当的分离技术可将其分离纯化。 根据分离过程的基本原理，分离可分机械分离和传质分离两大类。机械分离的对象是非均相物系，是依据物质相态的不同（例如液体、固体），以及依据物质大小、密度的差异进行分离，如过滤、重力沉淀和离心降解等。传质分离的对象主要是均相物系，通常是溶液，可分为速度分离和平衡分离两种。速度分离根据物质溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离，亦可称为输送分离，其传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等，如滤超、反渗透、电渗析、电泳和磁泳等；平衡分离则根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离，又称扩散分离法，其传质推动力为偏离平衡态的活度差或浓度差，如蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附和离子交换等。对于特定的目标产物，应根据其自身的性质以及共存杂质的特性，选择适宜的分离方法，以 获得最佳分离效果。即在保证目标产物的生物活性不受（或少受）损伤的同时，达到所需的纯度和对回收率的要求，并使回收过程成本最小，以适应大规模工业生产需求。 生物工艺中目前常用的生物分离提纯原理及方法如下表所示： 分离提纯原理分离纯化方法分离对象举例 溶解度的差异 分配系数的差异 分子大小和形状的差异 电荷性质的差异盐析法、等电点沉淀 法、有机溶剂沉淀法、 PEG沉淀法 有机溶剂萃取法、双水 相萃取法、反胶束萃取 法、液膜萃取法、超临 界流体萃取法 离心过滤法、离心沉降 法、超离心法、微滤法、 超滤法、纳滤法、透析 法、凝胶过滤法 离子交换层析法、电泳 法、色谱聚焦法、等电 聚焦法 蛋白质 有机酸、氨基酸、 抗生素、蛋白质、 香料、脂质 菌体、菌体碎片、 细胞、细胞碎片、 蛋白质、核酸、 糖类 蛋白质、氨基酸、 核酸 复旦大学生物化学笔记完整版 第一篇生物大分子的结构与功能 第一章氨基酸和蛋白质 一、组成蛋白质的20种氨基酸的分类 １、非极性氨基酸 包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸 ２、极性氨基酸 极性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸 其中：属于芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 属于亚氨基酸的是：脯氨酸 含硫氨基酸包括：半胱氨酸、蛋氨酸 注意：在识记时可以只记第一个字，如碱性氨基酸包括：赖精组 二、氨基酸的理化性质 １、两性解离及等电点 氨基酸分子中有游离的氨基和游离的羧基，能与酸或碱类物质结合成盐，故它是一种两性电解质。在某一ＰＨ的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的ＰＨ称为该氨基酸的等电点。 ２、氨基酸的紫外吸收性质 芳香族氨基酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰，由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，氨基酸残基数与蛋白质含量成正比，故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。 ３、茚三酮反应 氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。 三、肽 两分子氨基酸可借一分子所含的氨基与另一分子所带的羧基脱去１分子水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成多肽。10个以内氨基酸连接而成多肽称为寡肽；39个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称为多肽；51个氨基酸残基组成的胰岛素归为蛋白质。 多肽连中的自由氨基末端称为Ｎ端，自由羧基末端称为Ｃ端，命名从Ｎ端指向Ｃ端。 人体内存在许多具有生物活性的肽，重要的有： 谷胱甘肽（GSH）：是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。GSH的巯基具有还原性，可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中巯基免被氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。 四、蛋白质的分子结构 １、蛋白质的一级结构：即蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。 主要化学键：肽键，有些蛋白质还包含二硫键。 ２、蛋白质的高级结构：包括二级、三级、四级结构。 西方民族音乐学思想发展的历史轨迹 《西方民族音乐学思想发展的历史轨迹》，汤亚汀，《中国音乐学》，1999年第2期·文章大框架： 文艺复兴到东方主义 比较主义（学科的创建） 民族主义（过渡） 美国人类学与欧洲音乐学（对立面磨合） 结构主义（语言学的转向） 后现代主义（多元的杂交） ·学科100年来的思想发展： （比较）音乐学 →（音乐）人类学 →音乐学（语言学分析） →人类学（后现代思潮影响） 以上发展历程可多维地概括为（从不同角度）： 1）母学科角度：（多学科→单一学科→多学科） 自然科学（生物学、地理学、物理学、心理学等） →文化人类学 →语言学 →社会科学（政治学、经济学、历史学、文化学等） 2）时态 脱胎于历时主义 →共时主义的长期主宰（从比较音乐学、人类学到语言学） →历时主义再度兴起 3）文化范畴 文化普遍主义（同构） →文化相对主义（异质） →文化普遍主义（认知同构） →文化相对主义（异质、差异） 4）哲学角度 理性主义（形式主义） →经验实证主义（非形式主义） →理性主义（二元对立的形式主义） →反理性主义（反形式主义） ·文章引言 西方民族音乐学的形成与发展得益于多种社会文化思潮的影响 80年代后半期西方民族音乐学界弥漫反思气氛 1988 波尔曼（Philip Bohlman）提出民族音乐学“思想史”的概念 ·内容小结 从文艺复兴到东方主义——早期的酝酿 文艺复兴（13世纪末始，16世纪盛）思想两大特征：同古希腊比较自然科学的精神。 -同古希腊比较： Eg.蒙田1533-1592，法国思想家、散文家《食人的蛮族部落》，囚犯的情歌与古希腊诗歌相类似，“食人的音乐基本上同欧洲人的差不多” -科学观察的精神： Eg.基歇尔Athanasius Kircher,1602-1680,德国博物学家《世界音乐》，扉页插图，非洲土著仪式舞在风景画中，音乐同大地、大自然的联系，反对《圣经》中音乐的上帝创造说 +音程表、记谱、乐器图像等，力图使“他文化”的音乐为欧洲读者接受 Eg.拉菲陶https://www.doczj.com/doc/816965737.html,fitau,法国民族志作家《美洲蛮族习俗、原始时代习俗比较》，比较南美、北美、印第安各部族的乐器（按结构或仪式功能），认为，这些乐器的合理功能一点不比类似的希腊乐器少 早期著作的特点： 以古希腊文化为比较的楷模； 以欧洲为中心的文化普遍主义的比较模式，意在缩短两种文化中音乐之间的距离； 反对神学，提倡自然科学的客观精神 对一国文化行为的描述，某种程度上成了扩展西方殖民者权力的手段，积极的方面是动摇了西方音乐文化的主宰地位，在欧洲的音乐话语中为非欧音乐确立了一席之地，同样也丰富了欧洲的思维。（波尔曼，1991） ·研究非欧音乐的兴趣源自早期航海发现 理论依据源自启蒙运动（18世纪初-1789年法国大革命） 启蒙运动： 1.卢梭音乐现象二元论 音乐不仅仅是自然的，也是文化的，是一种“记忆信号”，来自于各种文化的习俗和环境所产生的各种联想，音乐的基本事实产生自文化的多样性。 该“自然-人性”的理性思想一直影响着今天的民族音乐学理论与方法。 2.田野工作（经验，客观性） 实地观察兴盛，许多基于第一手资料的著述 启蒙运动对非欧音乐研究最深刻的影响： 全新概念“他者”，即非欧世界有着不同于欧洲的历史与文化 著述通过客观地观察“他者”的音乐，重新审视欧洲自己的音乐以及二者之间的关系，便产生了一种比较研究的方法，预示了下一世纪末比较音乐学的诞生 「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点 流式细胞术可以同时分析单个细胞的多个参数。目前广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量等方面，在流式流式细胞术实验过程中，以下操作要点一定要注意，避免影响实验结果。 1、上机前处理 小心荧光淬灭 操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办?可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。 注意染色顺序 在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。 选好染色方案 染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。(考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。) 做好阴性对照及同型对照试验 细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。 同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。 选择合适的抗体 通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。 2、参数设定 数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。 电压 电压的调节需根据阴性对照管来调节。 生物分离技术 一、名词解释 1．凝聚：在解作用下，破坏胞菌体和蛋白等胶体粒子的分散状，使胶体粒子聚 集的程。 2．分配系数：在一定温度、力下，溶分子分布在两个互不相溶的溶里，达到平衡后，它在两相的度一常数叫分配系数。 3．絮凝：指在某些高分子絮凝存在下，在浮粒子之生架作用而使胶粒形成粗大的絮凝的程 4．萃取程：利用在两个互不相溶的液相中各种分（包括目的物）溶解度的不同，从而达到分离的目的 5．吸附：是利用吸附液体或气体中某一分具有性吸附的能力，使其富集在吸附 表面的程。 6．离子交：利用离子交脂作吸附，将溶液中的待分离分，依据其荷差异， 依靠力吸附在脂上，然后利用合适的洗脱将吸附从脂上洗脱下来，达到分离的目的。 7．助：助是一种具有特殊性能的粉或，它能使某些以的物料得容 易。 8．色技：是一相关分离方法的称，色柱的一般构含有固定相（多孔介）和 流相，根据物在两相的分配行不同（由于和力差异），多次分配（吸附 - 解吸 - 吸附 - 解吸?），达到分离的目的。 9．等点沉淀：体系pH ，使两性解的溶解度下降，析出的操作称等点沉淀。10．膜分离：利用膜的性（孔径大小），以膜的两存在的能量差作推力，由于溶液中各分透膜的迁移率不同而分离的一种技。 11．超界流体：超界流体是状超气液共存的最高力和最高温度下物特有的点 ——界点后的流体。 12．反渗透：在只有溶能通的渗透膜的两，形成大于渗透的力差，就可以使溶生倒流，使溶液达到的效果，种操作成反渗透。 13．膜的差极化：是指但溶透膜，而溶留在膜上，因而使膜面度增大，并高于主 体中度。 14．盐析：是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐，使原溶解的物质沉淀析出的分离技术。 15．反相色谱：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 16．亲和层析：是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 二、选择 1． HPLC是哪种色谱的简称（C）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C. 高效液相色谱 D. 凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（ C ）。 A. 凝胶过滤 B.离子交换层析 C. 亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A. 降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C. 与蛋白质结合成不溶性蛋白 D. 调节蛋白质溶液pH 到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（C） A. 蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C. 比活力最高 D.Km 最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（B）。 A．活性炭 B.氧化铝 C. 硅胶 D. 磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（B） A. 该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C. 酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E. 酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（C） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C. 凝胶过滤色谱 D. 反相色谱 8．盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A. 降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C. 与蛋白质结合成不溶性蛋白 D. 调节蛋白质溶液pH 到等电点 9．蛋白质分子量的测定可采用（C）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C. 凝胶层析 D.聚酰胺层析 10．氨基酸的结晶纯化是根据氨基酸的（A）性质。 学校代码：__11059__学号：1302021035 Hefei University 下游处理技术 XIAYOUC HULIJIS HUZONGS HU 论文题目：表面活性剂在细胞破碎的应用 学位类别：本科 学科专业：生物技术 作者姓名：刘壮 导师姓名：于宙 完成时间：2016.4.29 表面活性剂在细胞破碎的应用 摘要 表面活性剂的结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。表面活性剂的结构特性赋予了其既能和水也能和脂类作用的特性。表面活性剂是一类具有表面活性的物质，溶于溶液后，能显著降低液体表面张力，并能改变溶液的增溶能力。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，同时也含有蛋白质和脂质。用表面活性剂处理后可增大细胞壁的通透性[1]，这就是表面活性剂在细胞壁的破碎的原理。而细胞破碎是提取胞内产物的必由之路。本文将重点讲述表面活性剂在细胞破碎的应用。 关键词：表面活性剂；cmc；原理 沿革 在工业生产中有些目标产物不再发酵液中，而在生物体中，尤其是基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分分泌到发酵液中，而是在细胞内乘积。脂类物质和一些抗生素也是包含在细菌体中。这时就需要进行细胞破碎。 细胞破碎的方法很多，但是他们适用的范围和破碎效率不同。许多方法仅适合与实验室和小规模破碎。目前工业上生产应用最广泛的是高压匀浆法和珠磨法，由于他们处理量大，速度非常快而备受青睐。但是由于消耗机械能而产生大量的热量，使料液温度升高，容易造成生物活性的丧失容易造成活性物质的破坏[2]。化学方法如增溶法，通过添加表面活性剂，溶解细胞壁的脂，造成细胞壁通透性的改变，从而达到细胞破碎的目的。通过添加表面活性剂要比上述两种方法相对温和。表面活性剂处理制成细胞悬液后可用离心分离除去细胞碎片，在用其他方法如吸附柱或萃取剂分离制得产品。生物化学笔记(整理版)1
生物分离技术题库(带答案)
《生物分离工程》复习内容提要
动物考古整理
生物分离技术复习题
[考研]生物化学笔记
管理心理学笔记整理
《生物分离与纯化技术》授课教案
生物化学笔记(完整版)
古生物化石鉴定讲解
第二章 微生物菌种选育(笔记类)
现代生物分离技术及其应用举例
复旦大学生物化学笔记完整版
西方民族音乐学思想发展文献阅读笔记整理
「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点
(完整word版)生物分离技术题库.docx
表面活性剂在细胞破碎的应用
相关主题
文本预览