小麦HMW 谷蛋白亚基基因克隆研究进展
*
张发云
1,2
晏月明2 胡英考2 胡赞民
1**
周奕华
1
(1中国科学院遗传研究所 北京 100101;2首都师范大学生物系 北京 100037)
摘要 高分子量麦谷蛋白亚基(HMW -GS)作为小麦胚乳中的重要贮藏蛋白,其组成及含量对小麦面粉的烘烤品质具有重要的决定作用。因此,改变小麦中H MW -谷蛋白的组成及含量是小麦品质改良的主要内容。而定向克隆小麦HMW -GS 基因则为利用基因工程方法改良小麦品质提供新的基因资源,从而为优质小麦的发展起到积极的推动作用。综述了近20年来国内外小麦HMW -GS 基因克隆的研究进展,并讨论了近年来发展起来的一些新的基因克隆方法及其在小麦HMW -GS 基因克隆上的应用前景。关键词 小麦 HMW -GS 基因克隆 *国家自然科学基金资助项目(批准号:39770465,39880024);
北京市自然科学基金资助
**通讯作者,电子信箱:zmhu@gene https://www.doczj.com/doc/885223914.html,
小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的重要农作物。它被广泛地应用于食品加工及家畜饲料上。麦谷蛋白在面团中起到 骨架 的作用,并赋予面包、面条以及其他食品生产所需的粘弹性。虽然麦谷蛋白也包含许多种其他蛋白,但HMW 蛋白亚基在组成高分子聚合体(提供面粉弹性)中尤其重要[1]
。我国现有小麦推广品种的品质状况已与人们日益增长的生活质量消费水平不相适应。每年国家都需要进口小麦专用粉才能满足需要。因此,品质改良是目前小麦育种的主攻方向之一。
1 HMW -GS 及其与面包烘烤品质的关系
大量研究证实,小麦烘烤品质主要由种子胚乳内贮藏蛋白的组成及含量决定的。成熟种子
贮藏蛋白由麦谷蛋白(Glutenin)和麦醇溶蛋白(Gliadin)组成。谷蛋白包括两类亚基,即分子量较大的高分子量谷蛋白亚基(HMW -GS)和分子量较小的低分子量谷蛋白亚基(LMW -GS)[2]
。其中HMW 谷蛋白亚基约占成熟种子总蛋白量的10%,分子量在90~150ku 之间,具有比其他蛋白相对较高的甘氨酸含量(14%~21%)
[3-4],其
组成和功能可直接影响小麦面粉的烘烤品质[5-7]。运用小麦缺体 四体系以及双端体系,已将小麦高分子量谷蛋白亚基基因定位于染色体1A 、1B 和1D 的长臂近着丝点处,即Glu -A 1、Glu -B 1、Glu -D 1三个位点[8-9]
。每个基因位点由两个紧密连锁的基因(Glu -1-1和Glu -1-2)组成,分别编码蛋白质分子量较高的X 型和分子量较低的Y 型亚基
[10]
。由于在某些位点上的基因不表达
或处于 沉默 状态,往往不编码Y 型亚基,所以每个普通小麦品种仅含有3~5种HMW -GS,其中0~1种由Glu -A 1编码(A1位点的Y 型亚基基因总是处于 沉默 状态)、1~2种由Glu -B1编码、2种由Glu -D1编码
[11]
。不同小麦品种的
HMW -GS 的组成是品种的遗传特性,不受环境的影响而发生变化。
HMW -GS 对面包烘烤品质所起的重要作用已被众多的研究者所证实。早在1979年,Payne 等即提出单个HMW 麦谷蛋白亚基1与小麦面包烘烤品质具有高度相关性[12]
。1982年,Hanada
等又提出麦谷蛋白尤其是HMW 麦谷蛋白为面
团提供强度和抗延伸力
[13]
。之后,不少研究表
明:具有1Dx5+1Dy10亚基(由1D 染色体上Glu -D1位点上的基因编码)的品种面包烘烤品质明显优于其它亚基组合
[14-15]
。马传喜等
[16]
对烘烤
品质差异较大的44个品种进行分析,发现以1或2*亚基代替N,以7+8亚基代替7+9亚基,
第22卷第6期
中 国 生 物 工 程 杂 志
J OURNAL OF C HINESE BIOTEC HNOLOGY
2002年12月
以5+10亚基代替2+12亚基将显著改善小麦的烘烤品质。一般认为:具有1Dx5+1Dy10亚基组合(品质评分为4)的品种具较好的烘烤品质,其次是1Ax1、1Ax2、1B x17+1By18以及1B x7+ 1By8(品质评分均为3),而具有亚基组合2+12的品种烘烤品质较差[17]。经调查,我国推广品种中5+10、17+18等优质亚基组合的频率很低,这可能是造成我国小麦品质普遍较差的重要原因之一。因此,改善麦谷蛋白的高分子量亚基构成,将是改良我国小麦品种烘烤品质的重要途径。
2 HMW-GS的遗传模式及其编码基因的
结构特点
国内外对HMW-GS的遗传模式都开展了不少研究,结果显示,高分子量谷蛋白亚基由复等位基因控制,已检测到20多个不同的H MW-GS 等位基因[18]。通常每个染色体上的两个基因紧密连锁,如同一个孟德尔遗传单位,在杂种F1代呈共显性遗传模式。等位基因的表达存在剂量效应,非等位基因之间存在互作效应[19~20]。研究表明,Glu-1位点对烘烤品质的效应分两种情况:当5+10亚基存在时,以Glu-D1位点的加性效应为主;当5+10亚基不存在时,表现为加性效应和互作效应并存,以Glu-B1位点的加性效应和Glu-B1与Glu-D1位点的互作效应占主导地位。
随着研究的不断深入,已对HMW-GS的基因结构有了进一步的了解。序列分析表明,编码HMW-GS的DNA序列可划分为三个结构区段,一个没有重复的5 -末端区段、一个有重复的中间区段和一个没有重复的3 -末端区段。其对应编码的高分子量谷蛋白亚基也是由三个区域组成:中间是一个大的重复区(含400-670个氨基酸),N-末端和C-末端是保守性很高的非重复区域[21]。其中X型亚基的N-末端含有3个半胱氨酸残基,Y型亚基含有5个半胱氨酸残基;C-末端的X型与Y型亚基中均包含1个半胱氨酸残基,而Y型亚基的C-末端附近有一个附加的半胱氨酸残基,这个半胱氨酸残基有时也会靠近X型亚基的N-末端。中部重复区域包括六肽、三肽和寡肽氨基酸序列(三肽仅在X-型亚基中存在),亚基大小的差异主要是由于中部重复结构区域的变异所致,尤其是六肽和三肽的数量不同引起[22]。D Ovidio等[23]的研究结果证实了这一点。他们采用PC R技术研究1Dx2、1Dx2*和1Dy12等基因的差异,发现等位基因的DNA序列大小不同,而这种差异主要由基因中部重复序列大小及重复次数不同所引起,变异也是由该区域内DNA序列的插入或缺失产生。对HMW-GS的二级结构进行分析发现:中部重复区由 -螺旋组成主体结构,两端的非重复区则由 -螺旋构成两个球状的结构[18]。通过基因的核苷酸序列分析发现,编码HMW-GS的基因间具有高度的同源性,一般只有几个核苷酸的差别,这为利用PCR技术扩增未知X-型或Y-型高分子量谷蛋白亚基基因奠定了基础。例如,D Ovidio 等[24]利用PCR特异扩增技术成功地从普通六倍体小麦中得到了6种HMW谷蛋白基因的完全编码区。Allaby等[5]也用PC R技术以小麦高分子量谷蛋白基因组为模板扩增得到有关系统发育信息的顺序。
3 HMW-GS基因的分子克隆
由于高分子量谷蛋白亚基对品质具有重要作用,国内外都试图克隆优质HMW-G S基因,然后通过基因工程定向改良小麦品质。这已成为近10多年来的研究热点。迄今为止,已有多个基因被克隆和测序,并在转基因优质品种的培育方面取得重要进展。
有关特定HMW-GS对小麦品质的影响,过去开展了大量研究,并评定了不同蛋白亚基对品质的相对重要性。对于已知功能的HMW-GS基因的克隆,可采用先分离纯化特定蛋白亚基并测定氨基酸序列,然后推测其相应的cDNA编码序列,再设计引物扩增目的基因或设计探针从基因文库中钓取目的基因。目前常采用不同模式的凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)等方法来分离纯化目的蛋白亚基。最早关于小麦HMW-谷蛋白亚基的氨基酸顺序的报道是在1984年[26], Shewry等从几种不同小麦中提取了9种谷蛋白亚基,经离子交换色谱纯化(由A与D基因组编码的所有亚基都成功地得到纯化,而由B基因组
34中 国 生 物 工 程 杂 志第22卷
编码的8种蛋白亚基中只有6和7两个亚基被纯化)、SDS-PAGE分离、LKB4400分析仪对分离后蛋白的氨基酸顺序进行分析,最后用Beckman890B自动测序仪进行N-末端的测序。由于多种蛋白亚基在测序过程中完全受阻而发生Edman降解,因此最终只获得了1Dx2、1Dx5、1Dy10、1Dy12、1Ax1和1Bx7六种高分子量麦谷蛋白亚基的N-末端氨基酸顺序。其中因小麦品种的不同,1Dy12与1Ax1亚基分别有两种不同的N-末端氨基酸顺序。
对编码小麦HMW-GS的基因的完整核苷酸序列的克隆测序工作始于1985年,并完成了3个HMW-GS基因的全序列。Forde与Thompson 在同一期Nucleic Acid Research分别发表了他们所得到的1Dy12和1Ay基因的碱基顺序[27~28]。两个月后,Sugiyama又用类似的方法得到了1Dx2亚基的基因序列[29]。此后,不断有新的麦谷蛋白高分子量亚基被克隆测序。到目前为止,约有11个HMW-GS基因或基因片段完成测序。其基因编码区长度、基因来源及文章出处如表1。
表1 已克隆的HMW-GS基因
种等位基因(HMW-GS)长度(bp)参考文献
T.aestivum Var.Che ye nne Glu-A1-1b(Ax2*)2445Anderson and G reene(1989) T.aestivum Var.Che ye nne Glu-A1-2a(Ay)1815Forde et al.(1985)
T.aestivum Var.Che ye nne Glu-B1-1a(Bx7)2373Anderson and G reene(1989) L86-69Glu-B1-1b(Bx17)2270Reddy and Appels(1993) T.aestivum Var.Che ye nne Glu-B1-2b(By9)2115Halford et al.(1987)
T.aestivum Var.Che ye nne Glu-D1-1b(Dx5)2543Anderson e t al.(1989) T.aestivum Var.Che ye nne Glu-D1-2a(Dy10)1943Anderson e t al.(1989) T.ae stivum Var.Chinese Spring Glu-D1-2b(Dy12)1978Thompson et al.(1985) T.aestivum Var.Ho pe Glu-A1-1d(Ax1)2490Halford et al.(1992)
T.aestivum Var.Yamhill Glu-D1-1a(Dx2)2513Sugiyama e t al.(1985)
Ae gilops squarrosa Glu-D1-2c(Dy12t)2809Mac kie et al.(1996)
对HMW-GS基因的克隆,关键是要先分离制备出待克隆的靶基因。这是最具挑战性的一步。通过对已发表的HMW-GS基因的克隆方法进行比较分析后发现,其克隆策略可概括为两种:一种是以HMW-GS克隆作为探针筛选cDNA或gDNA文库,从而获得所需的靶基因序列,然后再选择合适的载体进行克隆测序。另一种则是采用PCR技术,即利用HMW-GS基因两端序列高度保守的特点,依据保守区序列设计引物,用PC R直接扩增谷蛋白基因,然后用Southern杂交和非整倍体材料进行定位,再亚克隆后测序;或者利用PC R扩增所得到的片段作为探针,对包含有HMW麦谷蛋白基因的文库进行筛选,以钓取具有全序列的靶基因。到目前为止,除了Mackie等[30]利用PCR直接扩增法得到小麦HMW谷蛋白亚基基因Dy12t全序列外,还通过PC R方法得到了一些HMW谷蛋白亚基的基因片段[31~33]。下面就已克隆基因所处的染色体位点分别加以阐述。
3 1 Glu-A1座位编码的HMW-GS基因
普通六倍体小麦的Glu-1座位上至少有26个等位基因,目前已确定4个位于Glu-A1,14个位于Glu-B1,8个位于Glu-D1。其中,在Glu-A1座位已有3个H MW-GS基因被克隆测序,即1Ay,1Ax2*和1Ax1。
1985年,Forde[27]把从HMW麦谷蛋白亚基克隆pTaE-c256得到的cDNA插入片段用32P标记后与小麦的基因组文库杂交,从杂交的60个克隆中随机挑取6个纯化。然后用EcoR1消化克隆、0 8%琼脂糖凝胶电泳分离。经鉴定其中3个克隆含8 2kb EcoR1酶切片段,将其中的一个亚克隆到pUC8,从而得到pHr26克隆,Southern 杂交证明其为HMW谷蛋白亚基基因。进一步分析确定其为1Ay基因。1Ax2*基因的克隆[34]首先是通过缺口补平法(nick-translated)标记包含有钱尼(Cheyenne)1Ay基因编码区的DNA,而后用该标记的DNA作探针和钱尼(Cheyenne)的基因组文库杂交,从而分离得到1Ax2*基因,然后再亚克隆测序。Halford等[35]则从Hope小麦品种分离得到了1Ax1亚基基因。其实验技术路线也是构建基因组文库、标记探针、杂交筛选、亚克隆测序。把由1Ax1基因序列推论得到的氨基酸顺
35
第6期张发云等:小麦HMW谷蛋白亚基基因克隆研究进展
序同它的等位基因1Ax2*亚基的氨基酸顺序比较只发现细微的差别,并且两亚基均与优质有关。对从22个小麦品种中提取的总蛋白进行数量分析发现,无论是具有1Ax1亚基还是1Ax2*亚基的品种与该位置为N亚基的品种相比,其HMW蛋白的含量均可增加8%~10%。这种在HMW蛋白含量上的增加也许刚好说明了位于1Ax座位的基因与优质之间存在着相关性。
3 2 Glu-B1座位编码的HMW-GS基因
目前已知的Glu-B1座位上的H MW-GS等位基因最多,至少有14个。迄今为止已有3个基因完成了克隆与测序。它们分别是1By9,1Bx7和1Bx17。
Halford等[36]用经Sma Bam H 消化的HMW亚基基因pHSB26克隆片段作探针与部分扩增基因组文库杂交,然后将杂交斑挑出纯化。通过液体培养获得DNA的 克隆,Ec oR 酶切该 克隆,琼脂糖电泳后与pHSB26克隆杂交,筛选杂交上的 HMW47克隆,分析其位于1B染色体上。部分限制性酶切 H MW47克隆再与pHSB26克隆杂交,将杂交上的三个片段亚克隆测序,从而最终得到1B y9基因的全序列。将该基因的5 上游非编码区与1Ay沉默基因对比发现,后者该区缺失了85bp。并且1By9基因该区的碱基顺序与其它农作物如大麦和玉米的醇溶谷蛋白基因 -300区 具有很高的同源性,而 -300区 在5 游区是保守的。这表明1Ay基因缺失的碱基引起它的沉默,即不再表达。1Bx7基因和1Ax2*基因同时于1989年得到克隆[35]。对Bx 和Ax基因序列分析发现,Ax基因顺序与来自于D基因组的部分同源基因的顺序相似,而Bx的重复结构却有显著的不同。到1993年Reddy和Appels从小麦的基因组文库中分离得到包含有1Bx17基因的片段。该片段包含一个2 82kb的编码区,1 98kb的下游非编码区和12 8kb的上游非编码区。用计算机进行同线性分析发现Bx17与B x7的基因顺序具有很大的相似性[37]。
3 3 Glu-D1座位编码的HMW-GS基因
该位点现已有5个基因被克隆和测序。它们分别是1Dy12,1Dx2,1Dx5,1Dy10和1Dy12t。
Thompson等[28]以中国春小麦为材料构建cDNA文库,用带有32P标记的H MW谷蛋白插入片段的cDNA克隆pTag1290进行杂交筛选,从而将Glu-1位点的染色体DNA克隆从cDNA文库中分离出来。分析所得到的克隆发现其中有一个克隆包含有Glu-D1位点并携带一个编码1Dy亚基的基因。将该克隆片段亚克隆测序,经分析比较确定该基因为高分子量谷蛋白1Dy12亚基基因。1Dx2亚基基因的克隆[29]则是通过先合成两段与HMW部分c DNA克隆的DNA序列互补的寡核苷酸序列(序列大小分别为24与25碱基)。而后用这两段序列作探针与小麦EcoR 部分酶切基因文库杂交筛选谷蛋白基因。将筛选到的克隆中的插入片段切下后亚克隆并建立酶切图谱,最后用Southern杂交定位。Anderson等[38]在克隆1Ax2*和1Ax7亚基基因之前就成功获得了1Dx5和1Dy10亚基基因的克隆。除所用小麦品种不同外,其克隆策略与技术方法基本类似。应用PCR技术,Mackie等[30]扩增得到了1Dy12t亚基基因(来自于Ae.tauschii)。
4 对小麦HMW-GS基因克隆方法的探
索及展望
麦谷蛋白是一个较为复杂的基因家族,目前对它们的功能还在继续探索。从已获得的小麦HMW-GS基因的克隆来看,几乎都是采用传统的分子生物学方法,其基本思路是利用与HMW谷蛋白基因相关的克隆或基因片段作探针,通过对基因文库的筛选与鉴定而获得。
随着现代分子生物学技术的迅猛发展,基因工程作为生物技术领域的先导也取得了突破性进展。而基因工程育种的前提条件是必需克隆大量可供利用的功能基因。因此,对植物基因克隆新技术的研究已引起国内外的高度重视,近年来已涌现出一些很有希望的新技术和新方法,有的已在小麦HMW-GS基因的克隆方面取得重要进展。
4 1 PCR技术在HMW-GS基因克隆上的应用
高分子量麦谷蛋白亚基编码基因的5 端和3 端在核苷酸序列上存在极高的同源性,为利用PCR反应扩增未知高分子量麦谷蛋白亚基编码基因提供了便利[24,39~41]。
李育庆等[31]利用计算机Homology软件,从3
36中 国 生 物 工 程 杂 志第22卷
种已知小麦HMW-GS基因顺序间找到了两段同源性分别达93%和100%的顺序。以之作为PCR 扩增的引物,以 扬麦4号 核DNA为模板,进行聚合酶链式反应。由此获得了小麦(Triticum aestivum L.)高分子量谷蛋白亚基约0 6kb的基因片段。Mackie等[30]通过设计5个引物,用PCR 技术在Triticum tauschii(Aegilo ps squarrosa,DD)中成功扩增出2809bp的Dy12t基因。解瑞立等[32]也利用PC R技术从多倍体偏凸山羊草物种中同时克隆了两个高分子量麦谷蛋白亚基的编码基因,氨基酸序列分析表明两基因分别编码一个x型和一个y型亚基,从而建立了在同一PCR 反应中同时扩增多个亚基编码基因的体系。此外,D Ovidio等[33]设计了较高的退火温度,用PC R特异扩增方法还获得了 -醇溶蛋白基因。
4 2 染色体显微切割与微克隆技术应用
染色体显微切割技术(chromosome microdissection and microcloning)是在80年代初Scalenghe等[42]首次将之应用于果蝇唾腺染色体的切割、分离与显微克隆研究而发展完善起来的。它是在显微镜下用微细玻璃针或激光对特定染色体或染色体区段进行显微切割、分离,随后进行PCR扩增构建特定染色体或某一区段特异性DNA文库,以获得大量有用探针,从而对那些已定位的基因进行定向克隆。Sandery等[43]第一次将此技术引入植物,通过用微细玻璃针剥离黑麦B组染色体微克隆后得到一个区别于A组染色体的克隆。近年来显微切割和微克隆在植物上的研究日渐活跃,在水稻、大麦、蚕豆、玉米、小麦、小冰麦等作物上的研究也日渐增多[44-47]。田钗等[48]通过对小麦刚82-122品种的C分带方法识别出Glu-1D位点所在的1D染色体,用显微切割技术成功地克隆了该染色体的长臂端,经PC R扩增后得到了1Dx5亚基基因5 端400bp的片段。可见,通过对目标染色体(特别是具特殊形态特征或带型的染色体)的识别辨认,用微切割技术将单条染色体或染色体的某一区段分离,酶切克隆或经PCR扩增后再克隆。足够数目的克隆子即可覆盖该染色体或染色体区段的全部区域,从而建立单染色体文库或染色体区段文库。文库可提供大量染色体区域特异性探针,因此可用于高密度遗传图谱和物理图谱的构建,进行精确的基因定位及有用基因的分离。
由于不同小麦品种含固定种类的HMW-GS,并已被定位于1A、1B和1D染色体上。因此可利用染色体微切割微克隆技术建立欲克隆HMW-GS基因所在染色体的文库,从中筛选该染色体上特异的并和H MW-GS基因同源的探针。然后用探针在小麦基因组文库或cDNA文库中钓取基因。用该方法克隆HMW-GS基因的优越性在于可排除其他同源基因的干扰,特异地克隆HMW-GS基因。其缺点在于整个操作过程较复杂,工作量很大。
4 3 用功能克隆的方法克隆HMW-GS基因
功能克隆[49]就是根据目标性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定基因的功能后进行克隆。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库的筛选则可采用不同的方法。或者将纯化的蛋白质进行氨基酸测序后合成寡核苷酸探针从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因;或者氨基酸测序后以此合成简并引物,通过PCR扩增得到基因的部分序列,再通过cDNA文库或是RACE-PCR 得到基因的全部序列。功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质,只要有一个纯的蛋白质,得到特异的探针,这一方法是行之有效的。早先的研究主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和高效液相色谱(HPLC)等方法分离纯化HMW-GS,然后测定氨基酸序列,了解不同亚基的组成及其结构特点。目前蛋白质技术发展迅速,出现了一些新的高效分离技术,如高效毛细管电泳(HPCE)等。因此,结合各种PAGE、HPLC、HPCE等方法分离纯化HMW谷蛋白亚基,氨基酸测序后合成简并引物,通过PC R扩增或筛选cDNA或gDNA文库获得HMW谷蛋白亚基基因将是可行的。
4 4 用免疫化学方法克隆HMW-GS基因
现代科学技术的进步以及免疫学理论的发展,使得免疫化学技术的应用范围日趋广泛。利用抗原与抗体的特异反应原理,制作单 多克隆抗体筛选cDNA表达文库不仅其准确性大大提高,操作程序也比一般方法简单的多。对于小麦贮藏蛋白来说,由于cDNA间可发生高频率的相互杂交(cross-hybridization),导致了谷蛋白及醇溶
37
第6期张发云等:小麦HMW谷蛋白亚基基因克隆研究进展
蛋白各组分间具有极高的同源性,从而使得利用常规分子生物学技术筛选和鉴定这些克隆极为困难。免疫化学技术的应用则较易解决这一难题。Donovan等[50]曾利用特异性单克隆抗体技术筛选编码不同胚乳贮藏蛋白的cDNA克隆,发现该技术具有快速、准确等优点。因此,只要从含高分子量谷蛋白的小麦胚乳中提取RNA,再由RNA构建cDNA表达文库,然后利用纯化的特异性抗体筛选该表达文库,即可获得编码小麦HMW-GS基因。
5 利用转基因技术改良小麦品质
虽然小麦HMW-GS仅占总种子蛋白的5% ~10%,但它们在决定面团的粘弹性方面所起到的重要作用使得编码H MW-GS的基因家族成员成为小麦品质改良基因工程研究的首要对象。随着小麦转基因技术的发展成熟,通过改变HMW-GS组成以对麦谷蛋白的结构与功能关系进行研究变得可能。
Blechl等[51]曾利用一套不同的HMW-GS基因编码区的融合表达来研究转化基因的表达对面粉品质的影响。结果发现原始HMW-GS基因的启动子可用以获得种子贮藏蛋白的高水平表达,而且该表达至少在三代中是稳定遗传的。另外,Barro等[52]实验证明了用HMW-GS基因转化小麦得到的转基因植株其面粉品质有明显提高。这就表明了利用新的种子蛋白组成改良小麦品质的可行性。
用微粒轰击法(基因枪法)将1Ax1和1Dx5基因外加一供筛选的标记基因bar或htp导入春小麦Federon中,并获得6种独立的转基因类型[53]。通过SDS-PAGE和Southern分析发现,在两种类型中超表达1Dx5基因而不影响其它原有胚乳蛋白的组成。超表达的1Dx5基因使得HMW-GS在总蛋白中的百分含量提高到22%。两种类型在表达1Ax1基因的同时内源1Ax2*基因表现出沉默。尽管有基因沉默的存在,HMW-GS占总胚乳蛋白的比例增加了20%多。对这四种类型的Southern分析证实转化基因具较低的拷贝数。另有两种类型只分别表达和超表达1Ax1基因和1Dx5基因,而所有原有HMW-GS基因表现沉默。但这些基因沉默的同时伴随着高拷贝的转化基因与多插入位点的存在。值得一提的是,在这6种转基因类型中,其中有四种的HMW-GS占总胚乳蛋白的含量增加了10%~ 20%,而HMW-GS含量的增加能提高面团的粘弹性[1]。
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Molecular Cloning of Genes Coding for High-Molecular-weight
Glutenin Subunits in Wheat
Zhang Fayun1,2 Yan Yueming2 Hu Yingkao2 Hu Zanmin1 Zhou Yihua1
(1Ins ti tute of Genetics,Chinese Academy of Sciences Beiji ng100101)
(2Department of Biology,Capital Normal Universi ty Beijing100037)
Abstract High Molecular Weight Glutenins(HMW-GS),as major storage proteins in wheat endosperm, play an important role in determining bread-making quality.Therefore,improving the composition and content of HMW-glutenin proteins is the main task for wheat quality breeding.The cloned wheat H MW-GS genes are new gene resource to improve wheat quality by gene engineering.This paper introduces the development of wheat HMW-GS gene cloning in the la test two decades.The ne w cloning techniques for wheat HMW-GS genes and their prospect are also discussed.
Key words Wheat HMW-GS Gene cloning
40中 国 生 物 工 程 杂 志第22卷
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
学号：班级：姓名： 《生物化学与生物分子学实验》 ——分子生物学设计性实验开题报告 实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师： 作者姓名： 所在院系： 小组编号： 小组成员： 完成时间：
成都医学院 Cheng Du Medical College 题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出
绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究 沈国军（指导老师：王友如） （湖北师范学院生命科学学院湖北黄石435002） 引言 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 2008 年10 月8 日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。他们分别为日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲(Martin Chalfie)和钱永健(Roger Tsien)[3]。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[4]。1994年，查尔菲等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，开创了GFP 研究与应用之先河[5]。 绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白，其分子量为27 kDa。GFP作为一种新的报告基因，与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，